三七总皂苷心肌靶向脂质体对内毒素血症心肌损伤小鼠的保护作用及机制研究

目的:研究三七总皂苷心肌靶向脂质体(PAC-L-PNS)对内毒素血症心肌损伤小鼠的心肌保护作用,并探讨其可能的作用机制。方法:将50只雄性C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、PAC-L-PNS组、三七总皂苷普通脂质体(L-PNS)组和三七总皂苷(PNS)组,每组10只。PAC-L-PNS组、L-PNS组和PNS组分别尾静脉注射相应药物,正常组和模型组小鼠尾静脉注射等体积空白脂质体,连续给药5 d,末次给药4 h后,正常组小鼠腹腔注射生理盐水,其余各组小鼠分别腹腔注射脂多糖(LPS,10 mg/kg)建立心肌损伤模型。造模12 h后处死小鼠,采用TUNEL染色和苏木精—伊红(HE)染色分别观察各组小鼠心肌细胞凋亡及心肌组织病理变化;检测仪检测小鼠血清中肌酸激酶(CK)和乳酸脱氢酶(LDH)的活性;采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测血清中IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1的含量;采用RT-qPCR法检测小鼠心肌组织NF-κB P65、IκBα、TLR4和IRAK1mRNA的表达;此外,进行血管刺激性、溶血性试验初步评价PAC-L-PNS的安全性。结果:PAC-L-PNS几乎无溶血和血管刺激性现象,生物相容性良好。与正常组比较,模型组小鼠心肌细胞凋亡率显著升高(P<0.01),心肌组织损伤较严重。与模型组比较,PAC-L-PNS组和L-PNS组小鼠心肌凋亡细胞显著减少(P<0.01),组织病变有所改善,PNS组小鼠无显著变化。与正常组比较,模型组小鼠CK、LDH活性、IL-6、IL-1β、TNF-α和MCP-1含量、TLR4、IRAK1、NF-κB P65和IκBαmRNA表达均显著升高(P<0.01)。与模型组比较,PAC-L-PNS组小鼠CK、LDH活性、各炎症因子含量、TLR4、IRAK1、NF-κB P65、IκBαmRNA表达均显著降低(均P<0.05)。与L-PNS组和PNS组比较,PAC-L-PNS组CK活性、各炎症因子含量、TLR4、IRAK1 mRNA表达均显著下降(均P<0.05)。结论:PAC-L-PNS对LPS致内毒素血症心肌损伤具有明显的保护作用,可减轻心脏组织的病变,其机制可能与抑制炎症因子产生有关。

骨髓间充质干细胞移植的心肌靶向性研究进展

骨髓间充质干细胞是多能干细胞,在体内外诱导分化为心肌样细胞,并改善心功能。本文对其不同移植途径及心肌靶向性进行分析,探讨细胞移植治疗心功能不全的最佳治疗方案。

三七总皂苷心肌靶向脂质体的体外靶向性研究

目的研究三七总皂苷心肌靶向脂质体(PAC-L-PNS)的对心肌细胞的体外靶向性。方法将加载了罗丹明B(Rhodamine B,RHB)荧光染料的PAC-L-PNS(即PAC-L-PNS-RHB)和加载了RHB的三七总皂苷普通脂质体(即L-PNS-RHB)分别与H9C2心肌细胞在相同实验条件下共同培养一定时间,以每毫克细胞蛋白摄取的荧光值为指标,考察H9C2心肌细胞对不同脂质体的摄取量;将PAC-L-PNS-RHB和L-PNS-RHB分别与H9C2心肌细胞和HL-7702非心肌细胞在相同实验条件下共同培养一定时间,以每毫克细胞蛋白摄取的荧光值为指标,考察不同细胞对脂质体的摄取量;将PAC-L-PNS-RHB和L-PNS-RHB分别与H9C2心肌细胞在不同实验条件下共同培养一定时间,以每毫克细胞蛋白摄取的荧光值为指标,考察不同环境下心肌细胞对脂质体的摄取量。结果心肌细胞摄取PAC-L-PNS-RHB和L-PNS-RHB的量均随着培养时间的延长而增加,从1h开始,心肌细胞对PAC-L-PNS-RHB的摄取量显著高于L-PNS-RHB(P<0.01);心肌细胞对PAC-L-PNS-RHB的摄取量较非心肌细胞高4.97倍;在缺氧条件下,心肌细胞对PAC-L-PNS-RHB的摄取量较L-PNS-RHB高2.06倍;美托洛尔的加入导致心肌细胞对PAC-L-PNS-RHB的摄取量显著下降。结论PAC-L-PNS具有较强的体外心肌细胞靶向性,其原因可能是PAC-L-PNS与心肌细胞表面的β1-AR发生了特异性结合。

三七总皂苷心肌靶向脂质体的处方、制备工艺优化及质量评价

目的:优化三七总皂苷心肌靶向脂质体的处方和制备工艺,并对其进行质量评价。方法:采用薄膜分散超声法制备三七总皂苷普通脂质体(L-PNS),通过单因素实验和响应面设计实验优化L-PNS处方,根据最优处方制备由艾司洛尔类似物(PAC)修饰的三七总皂苷心肌靶向脂质体(PAC-L-PNS),并对其进行表征研究、储存稳定性及体外释药特性考察。结果:L-PNS的最优处方与制备工艺为:磷脂与胆固醇的质量比为9∶1,药物与磷脂的比例1∶20,超声功率为63 W,超声时间为10 min,水化时间为15 min,药物浓度为1 mg/mL。在最优处方基础上制备的PAC-L-PNS粒径为(222.70±2.55)nm,Zeta电位为(+32.73±0.25)mV,包封率和载药量分别为64.62%、11.52%;稳定性实验结果显示,L-PNS和PAC-L-PNS在48 h内的渗漏率均低于30%,没有出现突释现象,稳定性良好;体外释药结果显示,L-PNS和PAC-L-PNS 72 h的累积释放率分别为35.88%、32.86%,均平稳释放,无明显的突释行为,具有缓控释作用。结论:根据最优处方和制备工艺,采用薄膜分散超声法制得的PAC-L-PNS粒径分布均匀、表面带正电荷,避光储存稳定性良好,体外释放缓慢。

PCM和TAT双修饰脂质体的制备及心肌靶向性的初步评价

目的研究心肌特异性靶向肽PCM和穿膜肽TAT双修饰的载荧光探针香豆素-6脂质体的制备工艺,并初步考察其心肌靶向性。方法采用薄膜分散-超声法,以PCM和TAT为靶头,制备以大豆磷脂、胆固醇、DSPE-m PEG_(2000)为载体材料的载香豆素-6的双修饰脂质体;优化香豆素-6用量、靶头连接方法及靶头用量,以形态、粒径分布、电位、包封率及体外稳定性对脂质体进行表征;考察心肌细胞H_9C_2对双修饰脂质体的摄取能力,表征其心肌靶向性。结果 PCM和TAT通过插入法连接,当PCM的用量为脂质的3%、TAT的用量为脂质的1%、香豆素-6的用量为20μg时,所制得的双修饰脂质体的形态圆整,粒径分布为115.7±2.91 nm,Zeta电位为-13.1±1.81 m V,包封率为83.2%±3.1%,具有良好的体外稳定性,双修饰脂质体的心肌细胞摄取率明显高于未修饰和单修饰的脂质体。结论双修饰脂质体的制备工艺简单,PCM和TAT双修饰可提高脂质体的心肌细胞靶向性。

载精氨酸心肌靶向纳米颗粒对脓毒症心肌的保护作用研究

目的制备心肌特异性多肽(PCM)修饰介孔硅纳米粒(MSN)包载精氨酸(LA)的纳米颗粒(PCM-MSN@LA),评价其对脓毒症心肌的特异性保护作用.方法通过缩合反应制备PCM-MSN@LA,检测PCM-MSN@LA表征、LA修饰量和释放量,观察PCM-MSN@LA的细胞吞噬行为及其对组织的亲和力.①实验一:将SD乳鼠原代心肌细胞分为正常对照组(Con组)、脂多糖(LPS)组、精氨酸纳米粒组(MSN@LA/LPS组)、心肌靶向精氨酸纳米粒组(PCM-MSN@LA/LPS组).LPS组用5 mg/L LPS刺激细胞16 h;MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组分别用含25 mg/L LA的MSN@LA及PCM-MSN@LA与LPS共同刺激细胞16 h.测定细胞活性和活性氧(ROS)产生水平;用原位末端缺刻标记法(TUNEL)检测细胞凋亡情况;用蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)检测内皮型一氧化氮合酶(eNOS)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)蛋白表达.②实验二:按照随机数字表法将64只健康雄性C57BL/6小鼠分为假手术组(Sham组)、LPS组、MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组,每组16只.LPS组腹腔注射50 mg/kg LPS;MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组腹腔注射LPS后立即经尾静脉分别注射0.5 mg/kg的MSN@LA及PCM-MSN@LA.每组8只小鼠用于观察24 h存活情况;另外8只于术后12 h用超声心动图评价心功能,用实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)测定心肌组织白细胞介素(IL-1、IL-6)、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)的mRNA表达.结果PCM-MSN@LA呈球形,粒径约180 nm,Zeta电位约-21 mV,且可负载LA,LA修饰量及释放率分别为12.3%、24.3%,细胞吞噬实验显示PCM-MSN@LA具有心肌细胞和心肌组织靶向性.实验一:LPS刺激后心肌细胞活性下降,ROS生成增多,凋亡增多,eNOS及iNOS蛋白表达增多.与LPS组比较,MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组细胞活性增高,ROS及凋亡减少,eNOS、iNOS表达增多;且PCM-MSN@LA/LPS组较MSN@LA/LPS组可进一步提高细胞活性,减少ROS产生和细胞凋亡,增加eNOS、iNOS蛋白表达〔细胞活性(A值):0.51±0.08比0.41±0.03,ROS水平(相对荧光强度):28450±1941比35628±2551,凋亡细胞/总细胞数:0.27±0.03比0.35±0.04,eNOS/β-Tubulin:1.467±0.046比1.201±0.131,iNOS/β-Tubulin:1.700±0.033比1.577±0.068,均P<0.05〕.实验二:MSN@LA/LPS组和PCM-MSN@LA/LPS组术后24 h存活动物数多于LPS组(只:2、4比1,P值分别为0.36、0.03).与Sham组比较,LPS组小鼠心功能明显下降,心肌组织炎性因子mRNA表达增多.与LPS组比较,PCM-MSN@LA/LPS组左室射血分数(LVEF)、左室短轴缩短率(LVFS)明显升高,IL-1、IL-6、TNF-α的mRNA表达明显下降〔LVEF:0.456±0.019比0.337±0.017,LVFS:(21.97±1.78)%比(15.53±1.67)%,IL-1 mRNA(2-ΔΔCT):169.22±8.95比189.79±6.79,IL-6 mRNA(2-ΔΔCT):19.90±1.60比23.74±1.45,TNF-αmRNA(2-ΔΔCT):8.21±0.81比11.00±1.48,均P<0.05〕;而MSN@LA/LPS组与LPS组各指标比较差异无统计学意义.结论PCM-MSN@LA具有心肌靶向性,可显著提高心肌细胞活性,下调炎性因子表达,减少ROS产生,减轻脓毒症心功能不全,从而实现脓毒症心肌损伤的靶向治疗.

心肌靶向肽的筛选及验证

目的 利用噬菌体展示技术,在心肌活体切片上筛选能特异性结合心肌的靶向短肽,提高药物心肌组织靶向运输效率,为杜兴肌肉萎缩症（DMD）及其他心肌相关疾病的靶向治疗提供有效的候选靶向肽.方法 制备心肌活体切片,体外培养心肌活体切片并用免疫组化技术检测其蛋白活性.将噬菌体文库以1x1012pfu的滴度与体外培养的心肌活体切片共孵育,回收并扩增与心肌活体切片结合的噬菌体,再经5轮体外生物淘选获得特异性靶向心肌的噬菌体,测序分析候选噬菌体的插入序列并对高效富集的噬菌体进行体内组织分布验证.结果 成功建立了心肌活体切片体外培养平台,获得了具有良好生物学活性的心肌活体切片,活体切片培养48 h后,仍能检测到抗肌萎缩蛋白的正常表达和定位.在此基础上,利用噬菌体文库对心肌活体切片进行5轮筛选,回收滴度测定结果显示淘选具有良好的富集效应.筛选后的噬菌体测序分析和体内组织分布验证结果显示,候选噬菌体在心肌、骨骼肌中出现明显富集,而在肝、肾组织中分布显著降低.结论 筛选出的候选噬菌体在心肌和骨骼肌中均表现为较高的结合效率,证明候选短肽具有心肌靶向能力,同时也为DMD的心肌靶向治疗提供了一种新方法.

三磷酸腺苷脂质体的研究进展

本文综述了近年来三磷酸腺苷(ATP)脂质体的研究进展。脂质体作为新载体可以提高ATP在体内的稳定性,并且能靶向于缺血的心肌和缺血的大脑,用于器官移植中能提高冷冻贮存器官的能级状态,提高移植的成活率,故制备稳定的ATP脂质体具有重要的意义。本文还综述了ATP脂质体的制备方法,探讨如何进一步提高脂质体的包裹率和靶向性,以用于临床。

双配体修饰脂质聚合物杂化纳米粒的制备及细胞摄取研究

目的制备双修饰的主动心肌靶向的载荧光探针香豆素-6(C-6)的脂质-聚合物杂化纳米粒(LPHNs),并考察其细胞摄取。方法通过巯基化反应,合成导向化合物心肌细胞靶向肽-聚乙二醇-磷脂酰乙醇胺(PCM-PEG-DSPE)。选取C-6为荧光探针,采用自动组装法制备包载C-6的LPHNs,再通过插入法,用PCM和细胞穿膜肽(TAT)对C-6-LPHNs进行修饰。以心肌细胞(H9C2)为模型做体外细胞摄取实验。结果双修饰的C-6-LPHNs的平均粒径为74.5±4.2 nm,分散系数(PDI)为0.051±0.013,Zeta电位为-32.8±1.2 mV,包封率为87.04%±3.19%。双修饰的C-6-LPHNs对H9C2心肌细胞的摄取率明显高于未修饰的C-6-LPHNs。结论LPHNs经双修饰后可促进H9C2心肌细胞的摄取。

心肌灌注靶心图缺血缺失程度分割方法

心肌灌注显像作为无创影像学技术之一,为冠心病心肌缺血的诊断提供依据。本文针对心肌灌注显像图中的靶心图,基于U型网络(U-Net)提出包含多层转置卷积上采样拼接模块和四通路可加权通道注意力模块的分支结构,并将分支结构的输出结果与主干U-Net的输出结果进行融合,实现心肌灌注靶心图心脏缺血缺失程度部位的精确分割。实验结果表明:多层转置卷积上采样拼接模块实现了不同深度特征图的融合,有效地降低与缺失程度相似的重度稀疏程度对分割的干扰。四通路可加权通道注意力模块能进一步提高两种相似程度的区分能力及对目标边缘细节的学习能力,保留更丰富的边缘细节特征。本文所用实验数据来自天津医科大学总医院、天津泰达医院、天津第一、第三中心医院数据库,在自建数据集上雅卡尔(Jaccard)系数较U-Net提高5.00%。研究结果表明,本文模型优于目前基于U-Net进行优化的其他模型,主观评价满足临床诊断的精度要求。