诱导心脏肌成纤维细胞向心肌样细胞转分化的miRNA

背景:微小RNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA,miRNA参与调控基因表达,在促进前体细胞增殖与分化中发挥了重要的作用。miRNA是否可促进前体细胞向心肌细胞的分化则鲜见报道。目的:验证转入特定miRNA(miRNA-1、miRNA-499)诱导新生小鼠心脏肌成纤维细胞转分化为心肌样细胞的可行性。方法:体外培养新生小鼠心脏成纤维细胞,常氧培养传代至P2;37℃低氧(体积分数3%O2)培养48 h;免疫荧光染色检测心脏成纤维细胞特异性标记物波形蛋白的表达,免疫荧光染色、流式细胞技术检测心脏成纤维细胞向心脏肌成纤维细胞表型转化的标记物α-平滑肌激动蛋白的表达。实验分为4组:miRNA-1转染组、miRNA-499转染组、miRNA-1/miRNA-499共转染组及空白对照组,采用miRNA芯片检测心脏肌成纤维细胞与心肌细胞中微小RNA的表达差异;real-time qPCR方法验证芯片检测结果。结果与结论:心脏肌成纤维细胞中过表达miR-1、miR-499后,心脏发育不同阶段特异性因子发生不同程度的表达变化,与空白对照组相比,其余3组GATA4、Tbx5、Mef-2c、α-MHC表达明显增高,Mesp1、Isl1表达均无显著变化。结果表明,特定miRNAs可诱导心脏肌成纤维细胞表达心肌细胞特异性性标志物,具备诱导心脏肌成纤维细胞向心肌细胞直接转分化的潜力。

心脏肌成纤维细胞与心肌细胞偶联的致心律失常作用

心肌组织中数量最多的是成纤维细胞,此类细胞可以合成和维持细胞外基质,具有自分泌和旁分泌功能,对维持心脏正常功能起着重要的作用。当发生各种原因的心肌损害时,成纤维细胞增生、转化为肌成纤维细胞,增加细胞外基质沉积,导致心脏纤维化。以往研究认为心肌纤维化致心律失常的成因与增生的胶原纤维束破坏心肌细胞间连接,导致传导减慢或产生不连续性传导有关。但近年研究发现心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞与心肌细胞之间可形成缝隙连接和紧密连接。由于心肌细胞和成纤维细胞的静息膜电位水平不同,两类细胞间形成的电偶联可降低心肌细胞除极速率和电活动传导速度。缝隙连接电流还直接参与心肌细胞早期后除极和动作电位时程电交替的发生;而肌成纤维细胞的紧张性收缩活动可通过细胞间的紧密连接,作用于心肌细胞的机械牵张敏感性离子通道,影响心脏的电生理功能。

人脐带间充质干细胞来源外泌体增强心脏肌成纤维细胞血管形成作用

目的探究人脐带间充质干细胞人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells,hucMSC)来源外泌体(exosomes)对心脏肌成纤维细胞促血管形成作用。方法通过流式细胞术检测hucMSC相关表面标记。透射电子显微镜、Nanosight纳米颗粒分析仪和Western blot鉴定exosomes。采用CCK-8细胞增殖实验、Transwell实验、细胞划痕以及内皮细胞小管形成实验检测exosomes作用后心脏肌成纤维细胞对内皮细胞增殖、迁移和小管形成能力影响。实时荧光定量PCR等技术检测对照组和exosomes作用组心脏肌成纤维细胞VEGF-A水平,进一步加入β-catenin/TCF介导的转录抑制剂后,检测VEGF-A表达水平。结果hucMSC不表达CD19、CD34和CD45,而高表达CD29、CD105和CD90,与间充质干细胞特性相符。经鉴定其exosomes粒径约100~200 nm,相较hucMSC,exosomes高表达CD81,低表达GAPDH,不表达内质网特异性分子Calnexin,这些均与exosomes特征相符。免疫荧光细胞化学染色发现心脏肌成纤维细胞高表达α-SMA,exosomes作用后心脏肌成纤维细胞促进内皮细胞增殖、迁移和小管形成能力。进一步检测发现exosomes作用后心脏肌成纤维细胞VEGF-A水平增加,加入β-catenin/TCF介导的转录抑制剂后,VEGF-A表达水平降低。结论hucMSC来源exosomes增强心脏肌成纤维细胞血管形成作用。

心脏成纤维细胞和肌成纤维细胞中miRNA的表达差异

目的应用微小RNA（miRNA）芯片技术筛选心脏成纤维细胞（cardiacfibroblasts，CFs）及心脏肌成纤维细胞（cardiacmyofibroblasts，CMFs）中差异表达的miRNAs，为寻找与心脏纤维化有关的miRNA提供理论基础。方法体外分离培养小鼠心脏成纤维细胞，常氧培养传代至第2代，然后在37℃、3％O2条件下培养48h得到心脏肌成纤维细胞。免疫荧光染色鉴定心脏成纤维细胞和心脏肌成纤维细胞，miRNA芯片技术分别检测miRNA在心脏成纤维细胞及心脏肌成纤维细胞中的表达。结果芯片实验数据分析软件V．4．0对芯片数据进行聚类分析，筛选获得80个在心脏成纤维细胞及心脏肌成纤维细胞中差异表达的miRNAs。相对于心脏成纤维细胞，心脏肌成纤维细胞中有55个miRNAs表达显著上调，25个miRNAs表达显著下调。结论心脏成纤维细胞和心脏肌成纤维细胞中存在差异表达的miRNA分子，差异表达可能与心脏纤维化的发生发展有关。

低氧激活ERK／JNK通路促进Smad2／3蛋白磷酸化诱导小鼠心脏成纤维细胞表型转换的实验研究

目的研究体外低氧诱导小鼠心脏成纤维细胞（cardiac fibroblasts，CFs）向心脏肌成纤维细胞（cardiac myofibroblasts，CMFs）表型转换过程中，促分裂素原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinases，MAPK）信号通路与Smad2／3蛋白磷酸化的关系。方法新生小鼠第1代CFs低氧（37℃、3％O2）无血清培养48h，免疫荧光检测α-SMA蛋白；新生小鼠CFs给予3种MAPK（ERK、JNK和p38）特异性抑制剂常氧培养1h，进行低氧培养30min，免疫印迹检测ERK、JNK、p38和Smad2／3蛋白磷酸化水平。结果①低氧显著上调新生小鼠CFs中α-SMA蛋白的表达；②低氧能显著地促进ERK、JNK和P38蛋白磷酸化，PD98059（ERK特异性抑制剂）、SP600125（JNK特异性抑制剂）和SB203580（P38特异性抑制剂）能抑制低氧诱导的ERK、JNK和P38蛋白的磷酸化；③PD98059（ERK特异性抑制剂）和SP600125（JNK特异性抑制剂）能抑制低氧诱导的Smad2／3蛋白的磷酸化，SB203580（P38特异性抑制剂）无此作用。结论①低氧可诱导小鼠CFs细胞发生表型转化为CMFs；②ERK和JNK信号通路能调控Smad2／3蛋白的磷酸化表达；③MAPK和Smad信号通路可能参与低氧诱导的小鼠CFs细胞的表型转化。