血管内皮生长因子和血管生成素-1抑制心脏成肌细胞凋亡研究

目的:探讨血管内皮生长因子(VEGF165)和血管生成素-1(angiopoietin-1)抑制心肌细胞凋亡的作用机制。方法:将编码人VEGF165或angiopoi-etin-1的复制缺陷型腺病毒载体(Ad-VEGF165或Ad-Ang1)转染大鼠心脏成肌细胞(H9C2),24h后以H2O2诱导细胞凋亡,分析VEGF165和an-giopoietin-1的抗凋亡作用。腺病毒转染24h后检测细胞中三磷酸肌醇激酶(phosphatidylinositol-3kinase)活性和bcl-2表达水平。结果:VEGF165和angiopoietin-1可不同程度抑制H9C2细胞凋亡。VEGF165和Ang1作用下细胞内三磷酸肌醇激酶活性和bcl-2表达水平增高。结论:VEGF165和/或Ang1可抑制心脏成肌细胞凋亡,这种保护作用与其激活细胞内三磷酸肌醇激酶途径和促进抗凋亡分子bcl-2的表达相关。血管生长因子VEGF165和angiopoietin-1的心脏成肌细胞保护作用为其功能学研究和临床应用开辟了新的方向。

苯甲酰芍药苷影响冠状动脉粥样硬化性心脏病模型大鼠心肌细胞凋亡的机制研究

目的探究苯甲酰芍药苷(BP)通过细胞外调节蛋白激酶(ERK)-钙蛋白酶2(Calpain2)途径对冠心病模型大鼠心肌细胞凋亡的影响及潜在机制。方法将健康雄性SD大鼠35只随机分为对照组11只、冠心病组12只和药物组12只,后2组大鼠用高脂饮食成功建立冠心病模型,药物组灌胃BP 170 mg/kg,1次d,干预4周。苏木精-伊红染色和TUNEL染色测心肌组织变化和心肌细胞凋亡。Western blot测ERK-Calpain2通路和凋亡相关蛋白。结果冠心病组和药物组干预后J点位移值高于对照组[(0.226±0.021)mV和(0.173±0.014)mV vs(0.076±0.011)mV,P<0.05],且药物组J点位移值显著低于冠心病组(P<0.05)。冠心病组心肌细胞凋亡率显著高于对照组(P<0.05),药物组心肌细胞凋亡率显著低于冠心病组[(19.02±3.77)%vs(37.14±6.58)%,P<0.05]。冠心病组半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶(Caspase)-12和Bax蛋白表达高于对照组,Bcl2蛋白低于对照组(P<0.05)。药物组Caspase-12和Bax蛋白表达低于冠心病组,Bcl2高于冠心病组(P<0.05)。冠心病组心肌组织磷酸化ERK/ERK和Calpain2表达高于对照组(P<0.05),药物组磷酸化ERK/ERK和Calpain2表达低于冠心病组(P<0.05)。结论BP缓解冠心病大鼠模型心肌损伤,可能与通过抑制ERK-Calpain2通路抑制心肌细胞凋亡有关。

乌司他丁通过上调Cx43表达减轻缺氧/复氧诱导的心肌细胞铁死亡的作用机制

目的探讨乌司他丁(UTI)对缺氧/复氧(H/R)诱导的心肌细胞铁死亡的影响,并分析其保护机制。方法体外培养大鼠H9c2心肌细胞,分为对照组、H/R组、铁死亡诱导剂(Erastin)组、UTI组、UTI+Erastin组、UTI+小干扰RNA(siRNA)阴性对照(si-NC)组、UTI+连接蛋白43(Cx43)siRNA(si-Cx43)组,各组给予相应干预后,检测各组细胞活力、乳酸脱氢酶(LDH)活性、活性氧、Fe^(2+)、丙二醛、超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)活性及Cx43、谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)、铁蛋白重链1(FTH1)、酰基辅酶A合成酶长链家族成员4(ACSL4)mRNA和蛋白水平。结果与对照组比较,H/R组细胞活力、SOD、CAT活性和Cx43、GPX4、FTH1mRNA及蛋白水平显著降低,LDH活性、活性氧、丙二醛、Fe^(2+)和ACSL4mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.01)。与H/R组比较,UTI组细胞活力[(71.40±8.05)%vs(42.63±6.71)%]、SOD、CAT活性和Cx43、GPX4、FTH1mRNA及蛋白水平显著升高,LDH活性、活性氧、丙二醛、Fe^(2+)和ACSL4mRNA及蛋白水平显著降低(P<0.05)。与UTI组比较,UTI+Erastin组和UTI+si-Cx43组细胞活力、SOD、CAT活性和Cx43、GPX4、FTH1mRNA及蛋白水平显著降低,LDH活性、活性氧、丙二醛、Fe^(2+)和ACSL4mRNA及蛋白水平显著升高(P<0.05)。结论UTI可能通过上调Cx43抑制H/R诱导的心肌细胞铁死亡。

PPARγ在心脏非心肌细胞增殖中的作用

目的:探讨PPARγ激活物对心脏非心肌细胞(cardiac nonmyocyte,CNM)增殖的影响及其可能涉及的PPARγ途径。方法:体外原代培养新生大鼠的CNM,以AngⅡ刺激,并分别给予不同浓度的吡格列酮和15-脱氧前列腺素J2(15d-PGJ2)。以MTT比色法和3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入实验检测CNM增殖情况,以瞬时基因转染CNM测定PPARγ活化后对靶基因的转录调控活性。结果:AngII刺激后CNM明显增殖3、H-胸腺嘧啶脱氧核苷的掺入明显增加,经不同浓度的吡格列酮和15d-PGJ2作用后,呈剂量依赖性抑制CNM的增殖和3H-胸腺嘧啶脱氧核苷掺入。将PPARγ表达质粒载体与含乙酰辅酶A氧化酶(ACO)启动子的过氧化酶体增殖反应元件(PPRE)表达质粒共转染CNM,其荧光素酶的表达量较非共转染显著增强;以吡格列酮和15d-PGJ2刺激后,荧光素酶的相对表达量呈剂量依赖性显著增强。结论:PPARγ激活物吡格列酮和15d-PGJ2在体外显著抑制新生大鼠CNM的增殖,这一过程可能与PPARγ的激活有关。

人诱导多能干细胞来源的心肌细胞研究进展

心血管疾病(CVD)是全球第一大致死疾病,各种CVD的临床终末阶段为心力衰竭。心脏移植是无禁忌证晚期心力衰竭患者的首选治疗方法^([1])。然而,心脏移植面临着供者不足、免疫排斥等诸多困难。人诱导多能干细胞(hiPSC)的出现为再生医学提供了可能,且避免了胚胎干细胞(ESC)引起的伦理问题,因而受到广泛关注。

病理状态对心肌细胞及心脏成纤维细胞β3-肾上腺素受体表达的影响

目的观察与心力衰竭相关的不同病理因素刺激下,Sprague-Dawley(SD)乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞中β3-肾上腺素受体(β3-AR)表达变化的差异。方法分离培养SD乳鼠心肌细胞和心脏成纤维细胞并行免疫荧光鉴定,分别给予血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)及去甲肾上腺素(NE)进行刺激,采用实时荧光定量PCR(qPCR)检测心肌细胞肥大相关基因[心钠肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-肌球蛋白重链(β-MHC)]、心脏成纤维细胞纤维化相关基因[Ⅰ型胶原蛋白(COL-Ⅰ)、Ⅲ型胶原蛋白(COL-Ⅲ)]及2种细胞中β3-AR的mRNA表达。结果免疫荧光鉴定显示,分离培养的心肌细胞和心脏成纤维细胞均状态良好。AngⅡ和NE分别刺激2种细胞48h后,心肌细胞中ANP、BNP、β-MHC和β3-AR的表达较对照组明显增加;心脏成纤维细胞中COL-Ⅰ、COL-Ⅲ表达较对照组明显增加,但β3-AR的表达没有明显变化。结论参与心力衰竭发生发展的病理因素AngⅡ和NE主要引起心肌细胞的β3-AR表达增加,而不是心脏成纤维细胞。

3′tRF-PheGAA对AngⅡ诱导的心肌细胞肥大的调控作用及其机制

目的探讨3′tRF-PheGAA对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的心肌细胞肥大的调控作用及其机制。方法获取小鼠乳鼠的原代心肌细胞,培养24 h以后分为A~G组。其中A组使用DMEM/F12完全培养液培养心肌细胞36 h;B组使用NC转染心肌细胞36 h;C组使用agomir-3′tRF-PheGAA转染心肌细胞36 h;D组使用DMEM/F12完全培养液培养心肌细胞84 h;E组在心肌细胞中加入终浓度为1μmol/L的AngⅡ处理48 h;F组使用anta-NC转染心肌细胞36 h,随后加入终浓度1μmol/L的AngⅡ处理48 h;G组使用anta-3′tRF-PheGAA转染心肌细胞36 h,随后加入终浓度1μmol/L的AngⅡ处理48 h。采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)技术检测各组心肌细胞中3′tRF-PheGAA及心房钠尿肽(ANP)、脑钠肽(BNP)、β-重链肌球蛋白(β-MHC)基因表达水平;使用罗丹明标记鬼笔环肽对各组心肌细胞中F-肌动蛋白进行染色并计算心肌细胞骨架表面积。结果RT-qPCR检测结果显示,A~C组心肌细胞中3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因水平差异具有显著性(F=137.10~1061.00,P<0.05),其中与A组相比,C组3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因水平显著上调(P<0.05);D~G组心肌细胞3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因表达水平差异有显著性(F=117.60~572.30,P<0.05),其中与E组相比,G组3′tRF-PheGAA及ANP、BNP、β-MHC基因表达水平显著降低(P<0.05)。罗丹明标记的鬼笔环肽染色结果显示,A~C组心肌细胞骨架表面积差异有显著性(F=35.06,P<0.05),其中与A组相比,C组细胞骨架表面积显著增加(P<0.05);D~G组心肌细胞骨架表面积差异有显著性(F=48.05,P<0.05),其中与E组相比,G组细胞骨架表面积显著减少(P<0.05)。结论3′tRF-PheGAA通过抑制自身表达,从而缓解AngⅡ诱导的心肌细胞肥大。

5′tRF-LysCTT对小鼠心肌细胞铁死亡的调控作用及其机制

目的探究tRNA衍生的小RNA(tsRNA)对小鼠心肌细胞铁死亡的调控作用及其机制。方法采用实时荧光定量PCR(RT-qPCR)检测8周龄C57BL/6J小鼠心脏、肝脏、脾脏、肾脏、大脑、肌肉中5′tRF-LysCTT的相对表达水平。将原代心肌细胞分为A~D组,A组细胞使用完全培养基培养60 h,B组先使用完全培养基培养24 h,再依次进行饥饿处理12 h,H/R处理24 h,C组和D组细胞分别转染antagomir-NC和antagomir-5′tRF-LysCTT,并于转染24 h后再依次进行饥饿(12 h)和H/R处理(12 h);将原代心肌细胞分为E~G组,E组细胞使用完全培养基培养24 h,F组细胞转染agomir-NC 24 h,G组心肌细胞转染agomir-5′tRF-LysCTT 24 h。采用RT-qPCR检测A~G组小鼠心肌细胞中5′tRF-LysCTT和Ptgs2、Gpx4、Slc7a11的相对表达水平,分别采用亚铁离子比色法测试盒、脂质活性氧(ROS)染色、CCK8试剂盒检测A~G组小鼠心肌细胞内亚铁离子相对水平、ROS水平及心肌细胞的存活率,采用普鲁士蓝染色试剂盒观察A~G组小鼠心肌细胞内铁离子沉积情况。结果RT-qPCR检测结果显示,与肝脏、脾脏、肾脏、大脑、肌肉中相比较,小鼠心脏中5′tRF-LysCTT表达水平最高(F=16.21,t=3.81~7.93,P<0.05)。D组与B组相比,心肌细胞内5′tRF-LysCTT和Ptgs2相对表达水平降低、Gpx4以及Slc7a11相对表达水平升高、亚铁离子相对水平和ROS水平降低,心肌细胞的细胞存活率升高(t=3.26~15.61,P<0.05),细胞内铁离子沉积明显增多,而C组与B组相比,细胞内的上述指标的水平差异无显著性(P>0.05)。G组与E组相比,心肌细胞内5′tRF-LysCTT和Ptgs2相对表达水平升高、Gpx4和Slc7a11相对表达水平降低、亚铁离子相对水平和ROS水平升高,心肌细胞的细胞存活率降低(t=3.57~91.84,P<0.05),细胞内铁离子沉积明显减少,而F组与E组相比,细胞内的上述指标的水平比较差异无显著性(P>0.05)。结论5′tRF-LysCTT对于小鼠心肌细胞铁死亡具有调控作用,敲低细胞内5′tRF-LysCTT可以抑制H/R诱导的心肌细胞铁死亡,而过表达5′tRF-LysCTT可促进心肌细胞铁死亡的发生。

大鼠心肌细胞H9C2多元复合支架的制备及优选

目的制备大鼠心肌细胞H9C2的聚己内酯(PCL)/壳聚糖(CS)多元复合支架,并优选有利于H9C2细胞生长的支架。方法通过静电纺丝法制备PCL/CS支架(支架A)、PCL/CS/氧化锌(ZnO)支架(支架B)、PCL/CS/ZnO/碳纳米管(CNTs)支架(支架C)三种多元复合支架,采用X射线衍射(XRD)、傅里叶红外光谱(FTIR)、热重分析(TG)、拉曼光谱测试等方法验证支架制备是否成功,采用电镜观察及拉伸应力、水接触角、电导率、膨胀率检测等方法评估三种支架的理化特性,采用DAPI染色、电镜观察、CCK-8实验等方法评估三种支架的生物相容性。结果XRD、FTIR、TG、拉曼光谱测试结果显示三种支架制备成功。电镜观察结果显示支架C的纤维直径显著长于支架A、B(F=73.050,t=8.724、9.747,P<0.05);拉伸应力测试结果显示支架B的拉伸应力显著高于支架A、C(F=13.833,t=3.641、3.802,P<0.05);水接触角检测结果显示三种支架皆亲水;电导率测试结果显示支架B、C的电导率显著高于支架A(F=798.780,t=32.155、30.048,P<0.05);膨胀率测试结果显示,在PBS缓冲液中浸泡后,支架A第5小时膨胀率显著高于第0.5小时(F组内=53.103,P<0.05),支架C在第2~5小时中各时间点膨胀率显著高于第0.5小时(F组内=103.748,P<0.05);在第0.5~4小时中各时间点,支架A膨胀率显著高于支架B、C,在第0.5~2小时中各时间点,支架B膨胀率显著高于支架C(F组间=35.226~162.448,P<0.05)。DAPI染色及电镜图像结果显示,在三种支架上培养96 h以后,支架B、C表面H9C2细胞数量较支架A增多。CCK-8实验结果显示,支架A、B、C表面H9C2细胞在第18小时~第5天中各时间点的吸光度值均显著高于第12小时(F组内=37.159~67.083,P<0.05);在第12小时~第5天各时间点,支架C表面H9C2细胞的吸光度值均显著高于支架A、B(F组间=26.039~80.994,P<0.05)。结论大鼠心肌细胞H9C2的多元复合支架符合细胞外基质特征,能够支持心肌细胞生长,其中PCL/CS/ZnO/CNTs支架显示出较高的生物相容性,比纯PCL/CS支架在心脏组织工程中更具应用潜力。

沉默YTH结构域家族蛋白2改善血管紧张素Ⅱ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡

目的探讨YTH结构域家族蛋白2(YTHDF2)对血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)诱导的新生大鼠原代心肌细胞肥大和凋亡的影响。方法为探讨AngⅡ刺激下YTHDF2的表达水平,将细胞分为正常组和AngⅡ组。为探讨沉默YTHDF2对心肌细胞肥大与凋亡的影响,将细胞分为4组,空白组[转染阴性对照小干扰RNA(siRNA)+PBS]、siYTHDF2组[转染YTHDF2 siRNA(siYTHDF2)+PBS]、模型组(siRNA+AngⅡ)和实验组(siYTHDF2+AngⅡ)。用Western blot和逆转录定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测YTHDF2基因表达水平,RT-qPCR检测心肌肥厚相关基因心房钠尿肽(ANP)、B型钠尿肽(BNP)和β肌球蛋白重链(β-MHC)及心肌细胞凋亡相关基因Bax、B淋巴细胞瘤2基因(Bcl-2)mRNA的表达水平,免疫荧光染色观察心肌细胞表面积,原位末端标记法染色观察心肌细胞凋亡情况,免疫沉淀反应验证YTHDF2和Bcl-2的结合关系。结果AngⅡ组YTHDF2蛋白表达及mRNA水平显著高于正常组(1.49±0.03 vs 0.97±0.09,1.50±0.08 vs 1.00±0.07,P<0.05)。与空白组比较,模型组心肌细胞表面积增大,细胞凋亡率升高,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显升高,Bcl-2 mRNA表达明显降低(P<0.05)。与模型组比较,实验组心肌细胞表面积减小,细胞凋亡率降低,ANP、BNP、β-MHC、Bax mRNA表达明显降低,Bcl-2 mRNA表达明显升高(P<0.05)。结论沉默YTHDF2可以缓解AngⅡ诱导的大鼠原代心肌细胞肥大与凋亡,YTHDF2通过与Bcl-2相结合抑制其表达水平。

微小RNA对心肌梗死中心肌细胞活性的影响及治疗前景

微小RNA(micro RNAs,miRs)是在真核生物中发现的一类内源性的具有调控功能的非编码RNA。心肌梗死(myocardial infaction,MI)是导致心脏重构和慢性心力衰竭的常见心血管事件,诸多miRs被发现在MI的病理生理机制中发挥重要作用。miRs对心肌细胞的存活及增殖活性有多方面影响,这些特性在治疗MI等缺血性心脏病中有着重要的指导意义。本文首先引入MI及miRs的研究概况,随后详细介绍了在心肌细胞存活及增殖中承担一定角色的miRs,最后展望了miRs应用于MI治疗的前景并提出局限性。

载有人心肌细胞钠离子通道及PRKAG2基因的HEK-293T细胞模型的建立

目的尝试建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道功能的HEK-293T细胞模型,为探讨PRKAG2心脏综合征心律失常机制奠定基础。方法分别构建人PRKAG2基因质粒载体和SCN5A基因质粒载体,共转人胚肾细胞(HEK-293T);应用免疫荧光法、Real-time PCR、蛋白质印迹法检测HEK-293T细胞转染结果及基因表达情况。结果转染48h后,HEK-293T细胞在细胞免疫荧光显微镜下可见红色荧光和绿色荧光。Real-time PCR及蛋白印迹结果证实:单独转染SCN5A组、SCN5A+PRKAG2组、SCN5A+G100S组、SCN5A+R302Q组SCN5A基因及蛋白均有表达,而在空白对照组无表达,差异有统计学意义(P<0.05);SCN5A+PRKAG2组PRKAG2基因及蛋白高表达,而空白对照组、SCN5A组、SCN5A+R302Q组、SCN5A+G100S组表达量较低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论成功建立类似PRKAG2心脏综合征钠离子通道的HEK-293T细胞模型,为后续研究奠定了基础。

鸟苷酸交换因子C3G对心肌细胞生存力的影响及其可能机制

目的探讨过表达鸟苷酸交换因子C3G(Crk SH3-domain-binding guanine-nucleotide-releasing factor)对心肌细胞生存力的影响及其机制。方法分别用pCXN2-Flag、pCXN2-Flag-hC3G(过表达人C3G mRNA)质粒瞬时转染H9C2心肌细胞,并进行缺氧/复氧(H/R)干预。实验分为空白组、空质粒组、C3G过表达组、空白+H/R组、空质粒+H/R组,C3G过表达+H/R组。用RT-PCR法检测心肌细胞C3G mRNA的表达,蛋白质印迹分析法检测心肌细胞C3G、p-ERK1/2蛋白的表达,MTT法检测细胞的增殖率,流式细胞术检测细胞的凋亡率。结果 C3G过表达组较空白组和空质粒组,C3G过表达+H/R组较空白+H/R组和空质粒+H/R组人C3GmRNA、C3G蛋白、p-ERK1蛋白、细胞增殖率均增加(P均<0.01),凋亡率均降低(P<0.05,P<0.01);C3G过表达+H/R组较空白+H/R组、空质粒+H/R组p-ERK2蛋白增加(P<0.01)。结论过表达C3G能促进心肌细胞的生存力,该过程可能是由p-ERK1/2蛋白表达增加和心肌细胞凋亡降低介导的。

不同活性的胶原酶对大鼠心肌细胞分离的影响

目的研究不同活性的胶原酶对大鼠心肌细胞存活率的影响。方法用4种不同活性的胶原酶以常规酶解法分离成年大鼠心肌细胞，观察分离即刻（D时点）、复钙60min后（E时点）和电刺激]Orrdn后（F时点）心肌细胞的存活率，采用IonOptix单细胞动缘检测系统同步检测心肌细胞收缩幅度（ph）、ph占单个心肌细胞长度（b1）的百分比（以ph／bl表示）、心肌细胞收缩速率（＋dL／dt）和心肌细胞舒张速率（-dL／dt）等指标。结果观察D、E、F时点心肌细胞存活率，结果表明299U／mg胶原酶的分离效果286U／mg、203u／mg和403U／mg的胶原酶（P〈0．05）。D时点4组心肌细胞的存活率没有差别，E、F时点时存活率降低。在心肌细胞收缩／舒张功能的检测中，299U／mg的胶原酶分离效果最佳，203、286、299U／mg和403U／mg组的ph分别是0．13±0．05、0．14±0．06、0．14±0．06μm和0.11±0．05μm；分别是8．8％±．4％、8．％±2．3％、9．2％±3.5％和7．5％±2．2％；＋dL／dt分别是1．8±0．6、1．9±0．6、2．0±0．7μm／s和1．7±0．5μm／s，-dL／dt分别是1．9±0．6、2．0±0．7、2．1±0．6μm／S和1．7±0．6μm／s。结论采用一定范同（203-299U／mg）的胶原酶对心肌细胞进行分离，酶活性越大，消化时间越短，心肌细胞存活率高、收缩／舒张功能好，其中以299U／mg活性的胶原酶效果最好。活性偏高或偏低的胶原酶分离心肌细胞的存活率和收缩／舒张功能均明显降低。

冠心康对大鼠缺血心肌细胞ATP敏感钾通道亚基Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B表达的影响

目的:通过观察中药复方冠心康对大鼠缺血心肌细胞ATP敏感钾(ATP-sensitive potassium,K_(ATP))通道亚基的影响,探讨冠心康保护心血管、抗心肌缺血的可能作用机制。方法:48只SPF级Wistar大鼠随机分为正常组、模型组、格列本脲组、吡那地尔组、冠心康组、冠心康加格列本脲组。采用酶解法分离大鼠心室肌细胞,用无钙台式液灌流10 min、停灌30 min、再灌注45 min模拟心肌缺血再灌注损伤。将药物直接加入细胞液中(格列本脲10μmol/L、吡那地尔50μmol/L、冠心康注射液1 ml/L)充分作用后,4℃放置24 h。采用实时荧光定量多聚酶链式反应法及蛋白质印迹法检测各组心肌细胞K_(ATP)亚基Kir6.1、Kir6.2、SUR2A和SUR2B的mRNA表达及蛋白含量。结果:正常大鼠心肌细胞可见SUR2A、Kir6.1和Kir6.2蛋白及mRNA的表达,而SUR2B蛋白几乎不表达。模型组K_(ATP)各个亚基蛋白及mRNA的表达均较正常组有一定程度的增加。与模型组比较,吡那地尔可显著增加K_(ATP)各亚基mRNA及蛋白的表达,格列本脲可阻断这一作用;冠心康可明显增加K_(ATP)通道各亚基mRNA及蛋白的表达。结论:复方冠心康具有明显的促进K_(ATP)开放的作用,从而起到心血管保护作用。

仿生电刺激在心肌细胞诱导胚胎干细胞向心肌样细胞分化中的作用

目的探讨仿生电刺激对离体心肌微环境诱导胚胎干细胞(ESCs)向心肌样细胞分化的作用。方法原代分离培养SD大鼠乳鼠心肌细胞及昆明小鼠ESCs,根据是否给予ESCs仿生电刺激及心肌微环境诱导分为5组:对照组、电刺激组、心肌细胞组、电刺激+心肌细胞条件培养液组、电刺激+心肌细胞组。分别于实验第5、7、14天在相差显微镜下观察各组细胞生长情况,实验结束时行肌钙蛋白T(cTnT)免疫荧光染色检测,计算cTnT阳性细胞百分率。结果与其他组相比,电刺激+心肌细胞组ESCs分化而来的心肌样细胞搏动更快,更趋于一致,ESCs诱导分化后的心肌样细胞cTnT蛋白荧光染色阳性率最高,约为40.0%±2.39%,显著高于对照组(2.00%±1.60%)、电刺激组(3.00%±2.00%)、心肌细胞组(28.70%±4.06%)及电刺激+心肌细胞条件培养液组(17.10%±2.23%,P<0.05)。结论模拟心脏跳动的仿生电刺激有助于ESCs在体外心肌微环境下分化为功能完备的心肌样细胞。

成纤维细胞生长因子21对内质网应激诱导心肌细胞凋亡的影响及其机制研究

目的:探讨成纤维细胞生长因子21(FGF21)在内质网应激(ERS)诱导心肌细胞凋亡中的保护作用及其作用机制。方法:以pc DNA4为基因载体,构建pc DNA4-FGF21质粒并转染H9c2大鼠心肌细胞48h,加入衣霉素(TM)10μM处理24h构建内质网应激模型,实验分为4个组:对照组、衣霉素处理组、pcDNA4-FGF21+衣霉素组、pcDNA4+衣霉素组。利用蛋白免疫印迹(Western blot)方法检测FGF21蛋白及蛋白激酶R样ER激酶(PERK)和c-Jun氨基末端激酶(JNK)介导的凋亡通路相关蛋白的表达。利用CCK8检测细胞存活率和TUNEL检测细胞凋亡率。结果:成功构建pcDNA4-FGF21质粒并在H9c2细胞中过表达。与对照组相比,衣霉素处理组和pcDNA4+衣霉素组明显上调H9c2细胞内源性FGF21的表达(P<0.01),以及增加PERK和JNK介导的凋亡通路相关蛋白的表达(P<0.05~0.01),减少细胞存活率和提高细胞凋亡水平(P<0.05~0.01)。与衣霉素处理组和pcDNA4+衣霉素组相比,在pcDNA4-FGF21+衣霉素组明显降低PERK和JNK介导的凋亡通路相关蛋白的表达,增加细胞存活率,降低细胞凋亡水平(P<0.05~0.01)。结论:FGF21过表达可以减轻内质网应激诱导心肌细胞的凋亡,其机制可能部分与抑制内质网应激中PERK和JNK介导促凋亡通路的信号传导有关。

血塞通软胶囊对心肌梗死大鼠血流动力学及心肌细胞凋亡的影响

目的:观察血塞通软胶囊对大鼠心肌梗死后不同时间血流动力学及不同区域心肌细胞凋亡的影响。方法:采用结扎大鼠冠状动脉左前降支的方法建立心肌梗死模型,将大鼠分为假手术组、模型组、血塞通组。治疗48h和5周时,采用超声心动图检测左室射血分数和左室短轴缩短分数,多导生理记录仪检测主动脉和左心室血流动力学改变,病理切片观察心肌病理学改变,外源性荧光标记的脱氧核苷酸末端转移酶介导的dUTP缺口末端标记法检测不同区域心肌组织中的心肌细胞凋亡情况。结果:与模型组比较,心肌梗死后各个时期,血塞通组左室射血分数和左室短轴缩短分数均显著升高,心肌细胞凋亡指数下降(P<0.01,P<0.05)。心肌梗死后48h,血塞通组左室收缩压、左心室压力最大上升速率有显著升高,而心脏质量指数、左室舒张末压显著降低,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01);心肌梗死5周后,血塞通组左室舒张末压明显降低,左心室压力增高率明显升高,与模型组比较差异有统计学意义(P<0.01)。结论:血塞通软胶囊可能通过改善心肌梗死后心功能,抑制心肌细胞凋亡从而有效治疗和预防心肌梗死后的心肌重塑和心室重构。

FUNDC1通过调控线粒体分裂影响高糖损伤H9c2心肌细胞凋亡的机制研究

目的 探讨含 FUN14域蛋白 1(FUNDC1)在高糖损伤的 H9c2心肌细胞中通过调控线粒体分裂影响心肌细 胞凋亡的作用机制。方法 体外培养 H9c2心肌细胞并建立高糖损伤模型,分别进行细胞转染,使用腺苷酸活化蛋白 激酶(AMPK)激活剂 5-氨基-4-咪唑羧基酰胺核苷(AICAR)后,分为正常对照组(CTRL组)、高糖组(HG组)、HG+ shRNA-NC组(转染 shRNA-NC的 HG组细胞)、HG+shRNA-FUNDC1组(转染 shRNA-FUNDC1的 HG组细胞)和 HG+ AICAR组(使用 AICAR的 HG组细胞)。MTT法检测细胞存活率;酶标仪检测细胞乳酸脱氢酶(LDH)释放量;激光共 聚焦显微镜观察线粒体结构;Western blot检测线粒体动力相关蛋白 1(DRP1)、分裂蛋白 1(FIS1)、Bcl-2相关 X蛋白 (Bax)、B淋巴细胞瘤-2(Bcl-2)、活化的胱天蛋白酶 3(Cleaved Caspase-3)、FUNDC1和 GAPDH的蛋白表达水平。结 果 与 CTRL 组比较,HG 组细胞存活率降低,LDH 释放量升高,线粒体 DRP1(DRP1-mito)、FIS1、Bax 和 Cleaved Caspase-3蛋白表达水平升高,胞浆 DRP1(DRP1-cyto)和 Bcl-2蛋白表达水平降低(P<0.05)。与 HG组比较,HG+ shRNA-FUNDC1组细胞存活率升高,LDH释放量明显降低,DRP1-mito、FIS1、Bax和 Cleaved Caspase-3蛋白表达水平 降低,DRP1-cyto和 Bcl-2蛋白表达水平升高(P<0.05)。HG+shRNA-NC组和 HG组比较,各指标差异均无统计学意 义(P>0.05)。CTRL组线粒体主要呈线状结构,HG组和 HG+shRNA-NC组线粒体均主要呈点状结构;与 HG组比较, HG+shRNA-FUNDC1组线粒体线状结构增多,点状结构减少。与 CTRL组比较,HG组 FUNDC1蛋白表达水平升高 (P<0.05)。与 HG组比较,HG+AICAR组 FUNDC1蛋白表达水平降低(P<0.05)。结论 FUNDC1通过调控线粒体 分裂影响高糖引起的 H9c2心肌细胞凋亡,AMPK信号通路参与该过程。

高效液相色谱法检测心肌细胞蛋白降解率

目的建立一种快速测定心肌细胞3-甲基组氨酸(3-MH)释放量的方法。方法分离培养新生大鼠心肌细胞。细胞培养液样品用乙腈沉淀蛋白,离心后取上清液进样用于3-MH分析。3-MH检测采用岛津LC-20A高效液相色谱仪,用C18色谱柱分离,外标法定量,检测波长为338 nm。结果色谱峰分离良好,线性方程为:y=731 241x+896.86,相关系数(r)=0.999 8,3-MH线性检测范围为1.6～107.0μmol/L。结论该实验为检测心肌细胞蛋白降解提供了一种精确、简单、可行的方法。