表达心脏SCN5A基因的人胚肾细胞钠电流特性及其对钠通道阻滞剂的反应性

目的利用人胚肾293细胞表达心脏钠通道SCN5A基因并研究其钠电流特性和对钠通道阻滞剂的反应性。方法野生型SCN5A基因和SCN1B基因共表达于人胚肾293细胞,应用全细胞膜片钳技术记录给药(氟卡尼与利多卡因)前后的钠电流。结果 SCN5A基因转染效率约为60%;测试电压为-40mV时记录到钠电流峰值大小约为-8nA;100μmol/L的氟卡尼轻度抑制钠电流,使钠电流峰值减少(21.1±4.6)%[(-435.8±30.5)pA/pF vs.(-343.9±27.1)pA/pF,P<0.01];氟卡尼使钠通道激活曲线和失活曲线均呈负向移动,改变的幅值分别是-6.08mV[(-51.88±1.20)mVvs.(-57.96±0.79)mV,P<0.05]和-9.08mV[(-94.12±0.13)mVvs.(-103.20±0.11)mV,P<0.05];1Hz和10Hz频率刺激时,氟卡尼使钠电流分别减少(64.5±10.7)%和(83.5±12.2)%(P<0.01);30μmol/L利多卡因使钠通道失活后快恢复时间常数和慢恢复时间常数分别延长2倍和3倍。结论表达心脏钠通道SCN5A基因的人胚肾293细胞模型可用于基因特异性的钠通道阻滞剂安全性与药效学筛查。

钠离子通道SCN5A基因突变与遗传性心脏病研究进展

大量研究表明，钠离子通道在维持心肌细胞的正常功能上发挥着重要的作用，心脏钠离子通道SCN5A基因突变可致多种心脏疾病，其中遗传性室性心律失常就是目前研究较多的一大类疾病，如长QT综合征（LQTS）、Brugada综合征、特发性心室颤动、婴儿猝死综合征等，本综述主要报道SCN5A基因与遗传性室性心律失常类疾病。

在心脏传导障碍伴长QT综合征家系中发现心脏钠离子通道基因SCN5A R1193Q

目的研究心脏传导障碍伴长QT综合征家系中心脏钠离子通道基因(SCN5A)的突变或多态位点。方法该家系有成员19名,进行病史询问、体格检查及做12导联心电图,采集静脉血标本,抽提基因组DNA,聚合酶链反应扩增SCN5A编码区及相邻内含子序列,直接测序寻找基因突变位点。发现突变位点后对所有家系成员的该位点进行测序分析,同时筛查281名无血缘关系的正常人作为对照。结果通过对该家系SCN5A基因的筛查,在其中发现1个位于Exon20的多态性位点(G→A)。碱基的变异造成编码氨基酸的改变,在1 193位置精氨酸由谷胺酰胺代替(R1193Q)。家系中有5例确诊为房室传导阻滞(AVB),至少2例同时存在长Q／c;另有1例虽无AVB,但QTc临界;5例AVB患者中4例携带R1193Q;3名QTc延长或临界的成员均携带R1193Q。281名正常对照者中36名亦存在SCN5A R1193Q,携带率为12．8％。结论SCN5A R1193Q与心脏传导障碍伴长QT综合征存在相关性,这个多态在中国人群的分布约为12．8％,显著高于白种人和日本人(0．2％-2．0％)。

钠通道重叠综合征相关基因SCN5A在H9C2细胞中的表达

目的构建表型重叠家系相关基因SCN5A del QKP1507-1509突变型真核表达载体,研究其在H9C2细胞中的表达。方法一步法定点诱变技术构建SCN5A基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体,电穿孔方法将野生型和突变型质粒转染至H9C2细胞,应用实时荧光定量聚合酶链反应(RFQ-PCR)及Western blot技术检测其mRNA及蛋白表达情况。结果琼脂糖凝胶电泳法及DNA直接测序法均表明定点突变成功,RFQ-PCR及Western blot结果显示,野生组、突变组和混合组SCN5A基因mRNA相对表达量分别为1.089±0.459、1.011±0.840和1.069±0.492,3组SCN5A基因mRNA相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。野生组、突变组和混合组SCN5A蛋白在H9C2细胞的相对表达量分别为3.781±0.221、3.466±0.176和3.714±0.198,3组SCN5A蛋白相对表达量比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论成功构建钠通道基因del QKP1507-1509突变型真核表达载体并转染至H9C2细胞,该突变未引起钠通道在细胞膜的异常表达,为进一步功能研究提供了研究基础及方向。

SCN5A基因致钠通道病研究新进展

编码心脏钠通道α-亚基的SCN5A基因的异常,常导致各种疾病表型,包括长QT综合征、Brugada综合征、心脏传导障碍、心房静止、心房颤动、窦房结病等心律失常疾病,甚至扩张型心肌病等器质性心脏病。近来还发现与心脏钠通道相互作用分子的异常也能导致相关表型。现对SCN5A相关Na+通道病进展进行综述。

心脏传导阻滞SCN5A基因L1001Q突变体构建和功能研究

目的对作者发现的一个中国3代人心脏传导阻滞家系SCN5A基因新突变L1001Q,构建突变表达载体,利用分子生物学方法和全细胞膜片钳技术观察L1001Q突变的功能。方法一步定点诱变法构建pEGFP-L1001Q-SCN5A突变体;激光共聚焦和Western blotting技术检测突变蛋白定位和表达;全细胞膜片钳技术观察突变体钠电流。结果野生型和L1001Q突变均表达在细胞膜上,且表达量无明显变化。二者最大激活电流分别为(148.34±0.77)pA/pF和(132.59±0.96)pA/pF(P>0.05),L1001Q突变半失活电压V1/2为(-73.25±0.87)mV,较野生型正向转移约3.5mV[V1/2为(-76.71±0.73)mV,P<0.05],L1001Q突变失活后恢复时间常数较野生型稍减小,差异无统计学意义(WT tau=16.8ms,L1001Qtau=14.1ms,P>0.05)。结论 L1001Q突变未影响钠通道蛋白的表达和转运,主要通过改变钠通道门控特性引起钠通道功能减弱进而导致心脏传导阻滞。

新疆维吾尔族人群SCN5A基因在单纯性先天性心脏病中的相关性分析

背景:SCN5A是目前报道最多的编码心肌钠离子通道的基因,SCN5A基因编码人心脏电压门控钠通道的α亚基,在人心肌细胞中高度表达,其主要负责动作电位的产生和兴奋细胞的扩展,对控制心肌细胞的兴奋传导起着关健作用。目的:研究SCN5A基因H588R,C5457T,R1193Q位点多态性与新疆地区维吾尔族单纯性先天性心脏病的相关性。方法:选取150例新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病患者作为病例组,150例新疆维吾尔族健康人群作为对照组。采用聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性分析技术和直接测序法对SCN5A基因H588R,C5457T,R1193Q位点进行多态性检测,分析不同基因型频率和等位基因频率在病例组和对照组中的分布。结果与结论:两组比较多态位点C5457T,R1193Q的基因型频率和等位基因频率差异均有显著性意义(P<0.05);多态位点H588R的基因型频率差异有显著性意义(P<0.05),而等位基因频率差异无显著性意义(P﹥0.05)。与对照组比较,C5457T位点在房间隔缺损和动脉导管未闭患者中等位基因频率分布差异有显著性意义(P<0.05),等位基因T分布增加房间隔缺损、动脉导管未闭的发病风险,OR值分别为3.636和3.467。R1193Q位点在房间隔缺损、法洛氏四联症和卵圆孔未闭患者中等位基因频率分布差异有显著性意义(P<0.05),等位基因A分布增加房间隔缺损、法洛氏四联症和卵圆孔未闭的发病风险,OR值分别为3.413,3.839和4.059。结果证实,SCN5A基因多态位点C5457T,R1193Q可能是新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病的易感因子;未发现多态位点H558R与新疆维吾尔族单纯性先天性心脏病直接相关。

In-Fusion技术构建Ⅰ型钠通道与红色荧光蛋白共表达载体及其突变载体

目的:构建Ⅰ型钠通道(NaV1.1)与红色荧光蛋白(DsRed)共表达载体及其突变载体。方法:利用In-Fusion技术将SCN1A基因亚克隆到DsRed真核细胞表达载体(pCMV-IRES-DsRed)。限制性内切酶对载体进行酶切并回收线性载体片段,PCR扩增SCN1A基因(与线性载体对应两端有15个相同碱基),In-Fusion技术进行融合即得到pCMV-SCN1A-IRES-DsRed。将其转染HEK293T细胞,Western blot检测NaV1.1的表达。定点诱变试剂盒对其进行定点诱变。结果:成功构建NaV1.1与DsRed共表达载体,SCN1A基因所编码的第1623位密码子由谷氨酸(Glu)突变为丙氨酸(Ala)。结论:NaV1.1与DsRed共表达载体及其突变载体的构建成功,为进一步研究该突变位点导致NaV1.1功能的改变奠定了基础。

谷氨酸钠对PC12细胞钠离子通道蛋白1.7表达的影响

目的:研究不同浓度谷氨酸钠刺激对PC12细胞钠离子通道蛋白1.7(Nav1.7)表达的影响。方法:PC12细胞解冻后,胰蛋白酶消化传代培养,对照组为普通培养基,实验组分别用终浓度为5、10、20、40 nmol/L的谷氨酸钠刺激PC12细胞14 h。14 h后收集细胞,通过免疫荧光、RT-PCR、Western-blot等方法检测Nav1.7和SCN9A mRNA表达量的变化。结果:各组PC12细胞RT-PCR、免疫荧光、Western-blot结果比较,差异均有统计学意义(F=11.821、61.871、23.274,P均<0.001);且除RT-PCR结果 5 nmol/L谷氨酸钠刺激组与对照组相比外,其余各谷氨酸钠刺激组与对照组相比均升高(P均<0.05)。结论:PC12细胞Nav1.7的表达与疼痛有关。

MicroRNA-7-5p通过mTORC2/SGK-1信号通路负向调控人肺泡上皮细胞钠离子通道

目的:探讨microRNA-7-5p通过哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合物2(mTORC2)/血清糖皮质激素诱导激酶-1(SGK-1)信号通路负向调控人肺泡上皮细胞钠离子通道(ENaC)的机制。方法:对人类非小细胞肺癌肺泡上皮细胞系A549细胞转染microRNA-7-5p模拟剂,设为microRNA-7-5p组,阴性对照组A549细胞转染与目的基因序列无同源性的不表达microRNA-7-5p的阴性对照剂。雷帕霉素组在A549细胞培养基中加入雷帕霉素。PP242组在A549细胞培养基中加入PP242。空白对照组仅加入lipo fectamineTM 2000试剂。采用RT-qPCR检测各组SGK-1 mRNA;免疫印迹法检测SGK-1蛋白、ENaC蛋白的表达量。比较各组的microRNA-7-5p表达水平、SGK-1 mRNA及蛋白表达量、ENaC蛋白表达量。结果:microRNA-7-5p组的microRNA-7-5p表达水平高于空白对照组、阴性对照组、雷帕霉素组和PP242组,A549细胞转染成功上调microRNA-7-5p表达水平(P<0.05)。microRNA-7-5p组中,SGK-1 mRNA水平、SGK-1及ENaC-α、ENaC-β、ENaC-γ蛋白表达量均低于空白对照组、阴性对照组、雷帕霉素组(P<0.05)。结论:microRNA-7-5p可能通过mTORC2/SGK-1信号通路负向调控ENaC。

慢性房颤患者心房肌细胞钠通道的变化

目的研究慢性房颤病人心房肌细胞钠通道电流特征及其基因表达。方法膜片钳全细胞技术记录风湿性心脏病慢性房颤者和窦性心律者心房肌细胞钠通道电流;半定量反转录聚合酶链式反应测量心房肌细胞钠通道α亚单位基因(SCN5A)mRNA的表达。结果(1)与窦性心律相比,慢性房颤病人钠通道电流密度和恢复动力学无改变,钠通道电压依赖性失活曲线向更正的方向偏移;(2)慢性房颤病人基因表达无改变。结论慢性房颤病人心房传导速度的减慢不是由于钠通道电流的减小所致。

中国汉族人Brugada综合征患者SCN5A基因Ⅳ区一个新的突变

背景 Brugada 综合征是一种易导致猝死的具有遗传倾向的疾病,与编码心肌钠通道的基因突变有关。目的研究中国 Brulgada 综合征患者 SCN5A 基因的碱基改变情况。方法对15例先证者及家系进行直接SCN5A 基因测序。DNA 来源于患者外周血白细胞。全部28个外显子通过设计的40对引物进行 PCR 扩增,扩增后的产物直接测序。结果在一个家系上发现了一个错义突变,即 G5080A(R1628Q),该突变导致心肌细胞钠通道的α亚基第Ⅳ结构域的第4片段发生改变。在150个正常对照者未发现此碱基改变。结论 G5080A(R1628Q)可能是中国 Brugada 综合征患者 SCN5A 基因新的突变位点。

相同SCN5A基因突变而不同临床表现型两家系报道

目的SCN5A基因突变与各种原因导致的心脏猝死有关,具有各种临床表现的重叠。方法初始诊断为Brugada综合征的两个家系,采用DNA直接测序法,对两家系成员使用候选基因法,对SCN5A行突变检测。结果两个家系成员均分别有各种心电图异常,包括Brugada型心电图表现,长QT间期,窦性心动过缓,右束支、左前半阻滞和完全性房室传导阻滞。两个家系均有重要的心脏猝死史。DNA直接测序发现两个家系分别有两个不同的SCN5A基因突变:一家系是在核苷酸1784位点,由G代替了A的基因突变(A1784G);另一家系在SCN5A片段II插入TG的基因突变(Tgins851)。结论相同基因型和不同表现型的离子通道疾病在一个家系中共存。ICD治疗是目前Brugada综合征的惟一有效治疗,从而提出基因携带而无症状者是否需要临床治疗。

中国人Brugada综合征SCN5A基因突变K317N的初步功能分析

目的继在一个中国人Brugada综合征家系发现了SCN5A基因突变K317N并进行了载体构建之后,为进一步研究Brugada综合征发病的离子、细胞电生理机制,对新的SCN5A基因突变(K317N)进行初步的功能表达鉴定与分析。方法用脂质体转染法建立稳定表达pGFP-IRES-hβ1质粒的293细胞系,并用G418进行筛选鉴定。然后,分别做pRc/CMV-hH1(hH1)和携带有基因突变K317N的pRc/CMV-hH1(mhH1)的瞬时转染表达。采用全细胞膜片钳技术记录钠通道电流。实验结果由pClamp软件分析。结果通过G418的抗生素筛选和荧光鉴定,成功地培养出稳定表达hβ1的293细胞系。在未转染质粒的空白细胞对照中,没有发现钠电流。在瞬时转染野生型的hH1的细胞系中,记录到了明显的钠电流,在瞬时转染突变型K317N的细胞系中,没有发现钠电流。结论野生型hH1所表达的钠通道蛋白与正常心肌细胞钠通道电生理特性相似。而突变型K317N的表达则由于突变所造成的氨基酸的改变对心脏电压依赖钠通道蛋白α亚基的关键结构P环产生了影响,钠通道未能正常表达,或者导致细胞上正常钠通道数量的大量减少,这可能是导致在突变型未能记录出钠电流的原因。

三子利水颗粒对心衰肺水肿大鼠肺组织液体转运相关蛋白表达的影响

目的通过观察三子利水颗粒对心衰肺水肿大鼠肺组织病理组织学、AQP1、AQP5、ENaC蛋白及mRNA表达的影响探讨其治疗心衰肺水肿的机制。方法选择雄性SD大鼠,通过结扎腹主动脉、腹腔注射氯化铵造成心衰急性肺水肿模型,随机分为模型组、西药组、中药低剂量组、中药高剂量组、中药低剂量+西药组、中药高剂量+西药组。给药1周后观察各组大鼠肺组织含水率、病理组织学及AQP1、AQP5、ENaC蛋白及mRNA表达水平。结果与模型组比较,各给药组肺含水量均减少(P<0.05);组织细胞间的炎性浸润和肺泡间的充血症状均改善。AQP1、AQP5蛋白表达均不同程度地升高,中药低剂量组AQP1差异有统计学意义(P<0.05),AQP5差异无统计学意义(P>0.05),其余给药组差异有统计学意义(P<0.01)。ENaC蛋白表达均不同程度地升高,空白对照组、中药低剂量组+西药组、中药高剂量组+西药组差异有统计学意义(P<0.05),其余各组差异无统计学意义(P>0.05)。AQP1、AQP5mRNA表达均不同程度地升高,中药低剂量组+西药组、中药高剂量组+西药组差异有统计学意义(P<0.01)。ENaC mRNA表达均不同程度地升高,中药低剂量组+西药组差异有统计学意义(P<0.05),西药组、中药高剂量组+西药组差异有统计学意义(P<0.01)。中药低、高剂量组差异无统计学意义(P>0.05)。结论三子利水颗粒可通过升高AQP1、AQP5、ENaC蛋白表达及mRNA表达含量来改善上皮细胞病理组织形态,达到清上焦肺水,缓解心衰肺水肿体征的目的。

心源性猝死者窦房结组织SCN5A和ANK2表达及其法医学意义

目的探讨心源性猝死者窦房结组织SCN5A和ANK2表达及其法医学意义。方法收集尸检心脏标本26例,其中心源性猝死者12例(猝死组),排除心脏原因相关的异常死亡者14例(对照组)。应用免疫组化方法检测两组标本窦房结组织中SCN5A和ANK2编码的心肌钠离子通道(Nav1.5通道)和锚定蛋白B(ankyrin-B)的表达。结果猝死组窦房结组织中Nav1.5通道和ankyrin-B的表达均较对照组显著下降,差异有统计学意义(Z=-2.166、-2.505,P<0.05),但在猝死组中两者的表达无明显相关关系(r=-0.337,P>0.05)。结论窦房结组织SCN5A和ANK2表达的改变与心源性猝死的发生相关。

C反应蛋白和N端脑钠肽在心力衰竭中的研究进展

1 心力衰竭定义及分子机制研究进展 心血管疾病中最严重的一种称为心力衰竭（简称心衰）,当其它心血管疾病的发病率逐年减低的同时,心衰的发病率仍然呈现普遍上升的趋势,这可能与人口的老龄化有关.慢性心力衰竭（心衰）又称充血性心衰,心衰是一综合征,病因是各种的心脏病发展到终末阶段所致.据Fralninghan心脏长期研究的数据资料显示,心衰的发病率增加一倍在每10年,患者5年存活率在确诊心衰后为男性25%,女性38%,一般情况下严重心衰存活不到一年.因此,降低心衰的病死率和发病率就显得尤为重要.心力衰竭是不同原因所致的多种心脏病发展的最终结果,但关于心衰,目前学术界尚无统一的定义.

心脏SCN10A:从分子到临床

心脏钠通道主要由SCN5A基因编码,其电流的慢失活成分称之为晚钠电流,在多种病理及其他异常情况下的增加可导致心律失常的发生。而在神经系统由SCN10A编码的钠通道,其分子结构与调控方式虽与前者有一定的差异,但目前发现它也可能存在于心脏,且主要分布于传导组织中。电生理及药理学研究发现SCN10A编码的钠通道的激活和失活均较慢,推测可能参与了晚钠电流的组成,此外SCN10A的基因多态性还与PR间期及QRS波时限有关。因此它可能是心律失常发生的另一个潜在因素,亦可能是今后治疗心律失常的一个新靶点。

心脏钠离子通道基因SCN5A与扩张型心肌病

扩张型心肌病（dilated cardiomyopathy，DCM）以无特定原因的心腔[左心室和（或）右心室]扩大、心肌收缩功能障碍为主要特征，发病率为（5～10）／10万。Karkkainen和Peuhkufinen＾［1］报道至少30％～50％的特发性DCM患者与家族（遗传性）因素有关。业已发现30个基因的突变与DCM发病有关，其中电压门控型（VGSC）钠通道基因（SCN5A）是DCM的重要致病基因之一。