必特霉素基因工程菌航天育种的研究

探讨航天技术对必特霉素基因工程菌的育种效果。我国返回式搭载卫星对基因工程必特霉素菌种进行了航天育种，共搭载4个菌株以沙土、甘油、斜面等不同方式，经受航天环境条件处理后计算其孢子存活率、营养缺陷型出现率及菌株的发酵效价。在本实验条件下菌株的存活率均很低，尤其是沙土方式的致死率为100％，甘油及斜面孢子的致死率分别为99．79％～100％和99．81％～100％。营养缺陷型出现率为1．65％。存活菌株的负突变率高于正突变率。经筛选从408株正突变株获得了发酵效价提高11．3％～14．5％的菌株。航天技术有可能应用于基因工程必特霉素的育种，但适于其育种的空间条件必须经过详尽而细致的研究和控制。

新一代必特螺旋霉素基因工程菌的微波诱变

本文探讨微波诱变对新一代必特螺旋霉素基因工程菌的育种效果。以经紫外诱变筛选的新一代必特螺旋霉素产生菌Streptomyces spiramyceticusNBT-U149为出发菌株进行微波诱变筛选。辐射分四种方式:培养皿加盖冷却;加盖不冷却;不加盖冷却;不加盖不冷却,辐射时间分别为10、20、30、40、50、60、80、100和120 s。每次辐射5 s后,冰上快速冷却20 s再照射,并将照射时间累计。以不同的辐射时间设定为不同的微波处理剂量,计算致死率。结果表明,必特菌株对微波敏感,微波辐射60 s时致死率达到92.55%。微波诱变在以脉冲频率为2450MHz的800W家用微波炉条件下,其最佳作用方式为培养皿不加盖、冰上快速冷却,最佳辐射时间为50 s。初筛摇瓶正突变率达到57.14%,复筛摇瓶发酵效价是出发菌株1.6倍以上的有10株,占初筛菌株的2%。最终筛选得到突变株Streptomyces spiramyceticusNBT-UM22,其必特螺旋霉素发酵产量是出发菌株的1.87倍,且组分比例无明显变化。

统计学法优化必特螺旋霉素发酵培基养

利用Plackett-Burman设计法析出影响必特螺旋霉素效价的四个最显著的因素,以Box-Behnken设计法及响应面分析法确定了主要因素的最佳浓度,即鱼粉22.8g/L,酵母粉2.44g/L,CoCl29.25mg/L,NaCl 9.13g/L,此时必特螺旋霉素效价为2245μg/ml。新配方验证结果表明必特螺旋霉素效价和必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素的含量在96h分别达到2380μg/ml和54%,比原配方分别提高了53%和20%。

中心组合设计优化必特螺旋霉素合成培养基

将克隆自卡波霉素产生菌的4"-O-异戊酰基转移酶基因整合到螺旋霉素产生菌S trep tomy ces sp iramy ceticus F-21的染色体上,构建成一株稳定的生物工程菌W SJ-1-195,它产生的一组以4"-O-异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分基因工程新型抗生素命名为必特螺旋霉素。针对目前没有适合必特螺旋霉素产生菌的合成培养基,所以本文顺序通过部分因子析因设计法、最速上升实验、中心组合实验,并利用统计学软件SA S V 8对实验数据进行分析,确定了必特螺旋霉素合成培养基的组成,为以后对必特螺旋霉素生理生化特性的研究提供基础。经过优化后必特螺旋霉素的发酵效价从173μg/m l提高到1880μg/m l。

Mn^(2+)对必特螺旋霉素产生菌代谢和必特螺旋霉素合成的影响

通过在必特螺旋霉素产生菌WSJ 1 195发酵过程中添加金属离子Mn2 + 发现 :发酵前期 (2 4h左右 )添加Mn2 + 可以明显提高生物效价 ,加入的Mn2 + 浓度以 5mmol L为最佳。实验显示添加Mn2 + 后发酵液pH逐渐下降 ,整个产素期间pH一直低于对照 ;与对照相比添加Mn2 + 摇瓶菌体浓度也较低。通过研究必特螺旋霉素发酵过程有机酸的变化趋势发现 :2 4h添加 5mmol LMn2 + 后发酵过程中有机酸含量已经发生变化 ,其中丙酸浓度的增长最为显著 ,84h时其浓度为对照的 6倍。通过丙酸盐的添加实验证实了发酵前期添加Mn2 + 可以促进产物合成的原因之一是促进了丙酸等前体酸的合成 。

Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素生物合成的影响

在合成培养基中分别添加缬氨酸(Val)、异亮氨酸(Ile)与亮氨酸(Leu)考察其对必特螺旋霉素生物合成的影响,证明Val、Ile及Leu对必特螺旋霉素多组分的合成有着不同的调节作用。实验结果表明在36h分别添加0.5g/L的上述三种氨基酸,发酵液pH和铵离子浓度存在着显著差异,而Val脱氢酶活性都增加了2～3倍。添加Val使菌体在60h之前糖耗速率加快,达到1.0g/(L.h),胞内丙酮酸积累,丙酮酸羧化酶活性增加20%～95%,柠檬酸合成酶活性降低41%,发酵液中丙酸和丁酸出现先增加后降低的现象,最终效价比对照高出45.3%,而总异戊酰组分则降低了23%,其他酰化组分降低了39.6%;添加Ile以后菌体糖耗速率降至对照的30%～40%,柠檬酸合成酶活性降低了47%,发酵液中的乙酸、丙酸、丁酸都出现大量积累的现象。最终效价为对照的85%,而丙酰螺旋霉素III、乙酰螺旋霉素以及异丁酰螺旋霉素组分含量分别增加126%、50%、296%。添加Leu对初级代谢影响不大,异戊酸在胞外积累,随后被重新吸收利用,最终异戊酰基螺旋霉素II和异戊酰基螺旋霉素III组分分别提高了41%和50%。同时总异戊酰基螺旋霉素相对含量也比对照提高了41.9%,效价和对照基本一致。

响应面法优化必特螺旋霉素发酵培养基

目的利用响应面法对新一代必特螺旋霉素基因工程菌(Streptomyces spiramyceticus,WSJ-2),即含有整合型双拷贝4″位异戊酰基转移酶基因(4″-isovaleryltrasferase gene,ist)工程菌发酵培养基进行优化。方法以发酵效价和异戊酰螺旋霉素组分含量为指标,通过部分因子析因设计实验,筛选出影响较大的主要影响因子。其次,进行最陡爬坡实验,最后,通过中心组合设计,利用DX7trail 7.0软件进行回归分析,确定主要影响因子的最佳浓度,得到优化发酵培养基。结果综合培养基组成对发酵效价和组分含量的影响获得2个主要影响因子,即KH2PO4和NaCl,通过最陡爬坡实验和响应面法,确定了优化发酵培养基组成为(g.L-1):淀粉60、碳酸钙7.0、MgSO42.0、NH4NO36.0、酵母粉3.0、鱼粉15、MnCl20.10、NaCl 12.5、KH2PO40.645。验证实验表明在优化培养基中发酵相对效价为142%与预测值139%比较接近,效价比原配方提高了42%,而其总异戊酰基螺旋霉素组分的含量与原配方基本一致。结论对新构建的必特螺旋霉素基因工程菌采用响应面中心组合设计,可以较有效地进行发酵培养基的优化。

铵离子对必特螺旋霉素生物合成的调控

研究了在复合培养基中发酵生产必特螺旋霉素时,铵离子浓度对发酵组分的影响。从发酵24 h开始,每12 h补加3.2 mmol/L的铵离子,考察其对必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素组分和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ/Ⅱ的调节作用。实验结果表明:在降低基础培养基铵离子浓度的基础上,补加铵离子可以明显改善必特螺旋霉素组分,生物效价达2 200 u/mL。通过测定发酵过程中还原糖、相关有机酸、琥珀酸脱氢酶(Succinate dehydrogenase,SDH)活性、缬氨酸脱氢酶(Valine dehy-drogenase,VDH)活性等中间代谢数据,对铵离子的作用原理进行了讨论。

液相色谱-质谱联用法鉴定必特螺旋霉素中多组分

采用 Kromasil C18色谱柱 ( 5μm粒径 ,2 0 0× 4.6mm内径 ) ,流动相为乙腈 -1 0 mmol/ L乙酸铵溶液 ( V(乙腈 )∶V(乙酸铵 ) =60∶ 45 ) ,建立快速分析抗生素新药必特螺旋霉素中复杂多组分的分析方法。采用电喷雾离子化源 ,以正离子检测方式进行一级、二级全扫描质谱分析。研究表明 :其中含有 1 0种螺旋霉素类衍生物并推断出化学结构 ,通过与对照品的色谱和质谱行为对比得到验证。采用液相色谱 -质谱联用技术 ( LC-MSn)可以快速阐明复杂多组分抗生素新药必特螺旋霉素类的化学组成 ,并且可以作为一种简单、便捷的分析方法对大环内酯类新抗生素进行高通量筛选。

必特螺旋霉素在大孔树脂HZ820上的吸附动力学研究

在本文中,采用大孔吸附树脂HZ820从水溶液中吸附分离必特螺旋霉素。吸附速率是吸附实验设计中一个很重要的参数。本文以吸附温度,离子强度为考察参数,利用间歇吸附实验,获得必特螺旋霉素在HZ820上的吸附动力学数据和热力学数据。使用准一级方程(pseudo-first-order)、准二级方程(pseudo-second-order)、Freundlich动力学方程、空隙扩散模型(porediffusion model)和Elovich方程5种模型对实验动力学数据进行拟合,并分析对比了拟合结果。结果表明,准二级方程对实验数据的拟合具有最高的相关度,并根据对比结果判断该吸附系统为非均相吸附过程,吸附速率由液膜扩散速率和孔内扩散速率综合控制。Langmuir和Freundlich吸附等温线方程均较好地描述了必特螺旋霉素在HZ820树脂上的吸附相平衡关系。该吸附过程为优惠吸附过程,提高温度和增大离子强度均有利吸附的进行。

高效液相色谱法测定必特螺旋霉素发酵液中有机酸

必特螺旋霉素是运用基因工程技术获得的工程菌产生的一组以异戊酰螺旋霉素为主要成分的多组分新型抗生素,其前体为乙酸、丙酸、丁酸和异戊酸等有机酸。本研究利用高效液相色谱法以0.01 mol/L磷酸缓冲液(pH2.3)和甲醇为流动相,分别在反相C_8(α-酮戊二酸、乙酸、柠檬酸、琥珀酸、丙酸)和C_(18)(丁酸、异戊酸)柱上定量测定了必特螺旋霉素前体酸和三羧酸循环相关有机酸。所建立的测定方法的相对标准偏差为0.10%～0.42%,回收率为93.19%～102.08%。

添加异戊酸对必特螺旋霉素生物合成的影响

为了进一步提高多组分必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量,本文通过外源添加浓度为0.5 g/L的异戊酸使异戊酰螺旋霉素Ⅲ和总异戊酰螺旋霉素的含量分别比对照提高了38.32%和31%。通过测定必特螺旋霉素发酵过程中糖耗、有机酸、亮氨酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、己糖激酶等中间代谢产物的相关数据,探讨了异戊酸调控必特螺旋霉素组分和效价的机理。

亮氨酸对必特螺旋霉素发酵组分的影响

本文针对必特螺旋霉素发酵主要组分异戊酰基螺旋霉素以及异戊酰基螺旋霉素Ⅲ的提高,在摇瓶培养基试验中,通过一次性添加与分批添加终浓度为15.4mmol/L的亮氨酸,发现分批添加亮氨酸可以维持效价基本不变,而总异戊酰基螺旋霉素与异戊酰基螺旋霉素Ⅲ分别由对照的31.1%和12.0%提高至46.9%和19.5%。通过分析发酵过程的有机酸以及氨基酸的变化规律,讨论了亮氨酸提高必特螺旋霉素主要组分的作用机理,同时在15L发酵罐中对分批添加亮氨酸添加效果进行了验证试验,结果表明,发酵液必特螺旋霉素组分中总异戊酰基螺旋霉素和异戊酰基螺旋霉素Ⅲ在96h分别提高至59.91%和21.45%。

铵离子对必特螺旋霉素组分生物合成的调控作用

通过考察铵离子浓度对必特螺旋霉素组分的影响,证实低浓度铵离子的培养条件可以有效提高必特螺旋霉素中异戊酰螺旋霉素Ⅲ的比例。在此基础上进一步测定了高铵(62·5mmol/L)和低铵(2·5mmol/L)培养条件下的糖、铵离子、相关有机酸、缬氨酸脱氢酶酶活等中间代谢数据,结果表明高浓度铵离子培养条件下,必特螺旋霉素产生菌中亮氨酸分解代谢途径的关键酶——缬氨酸脱氢酶的活性低于低铵对照试验,造成异戊酰螺旋霉素合成过程中酰基转移反应的底物——异戊酰CoA的相对不足,从而导致异戊酰螺旋霉素组分的降低。大幅度降低铵离子浓度至2·5mmol/L,使异戊酰螺旋霉素Ⅲ的比例从5·43%提高至28·59%。但氮源的不足影响了必特螺旋霉素的产量,低铵条件下的效价为107μg/mL,相对高铵条件下降了14·4%。在低铵培养条件的基础上添加亮氨酸,可以进一步改善必特螺旋霉素的组分,异戊酰螺旋霉素Ⅲ的比例增至37·84%。

剪切力对必特螺旋霉素发酵的影响

目的考察剪切力对必特螺旋霉素发酵的影响。方法考察摇瓶发酵过程中玻璃珠数量、添加玻璃珠时间及不同发酵阶段添加玻璃珠对发酵的影响。50L发酵罐上,通过改变搅拌速度调整对菌体的剪切力,并考查不同发酵阶段剪切力对发酵的影响。结果随着玻璃珠数的增加,菌体浓度和必特螺旋霉素产量下降明显;48h时添加玻璃珠对必特螺旋霉素合成有促进效果,效价提高8%,且菌体浓度变化不大。发酵前期(0～48h)和发酵后期(72～96h),过强的剪切力会对发酵产生不利的影响。在50L发酵罐上,不同发酵阶段调整剪切力,使发酵产物单位数比对照提高16.7%。结论剪切力对必特螺旋霉素发酵有显著影响。

必特螺旋霉素萃取过程研究

从热力学角度考察了温度、pH值、NaH2PO4质量分数对不同溶剂体系中必特螺旋霉素溶解度的影响,研究了磷酸盐缓冲液萃取石油醚洗脱液中必特螺旋霉素过程工艺特性,详细考察了温度、pH值、NaH2PO4质量分数等诸因素对萃取过程分配系数α的影响。萃取实验选择H3PO4-质量分数0.7%NaH2PO4缓冲溶液为萃取剂,以A/O相比=1/10进行萃取。研究发现:萃取过程最佳pH值范围为2.0—2.2,萃取分配系数α随着温度的升高而变小,萃取过程为放热过程,低温与较高的NaH2PO4质量分数有利于萃取过程的进行。在实验基础上推导并建立了萃取分配系数α与pH值及温度T函数关系α-pH及α-T理论数学模型,并用Matlab软件拟合得到α-pH-T函数关系式。

分离纯化过程中温度和pH对必特螺旋霉素稳定性的影响

考察了不同温度下必特螺旋霉素在磷酸盐缓冲液和发酵液中的稳定性,以及在碱作用下必特螺旋霉素于水酯两相中的稳定性,并分析水相pH对其组分的影响。结果表明,必特螺旋霉素对热稳定;对pH敏感,最适范围为pH4.5～7.5;水酯两相接触时,必特螺旋霉素在碱的作用下易降解,因此萃取和静置分层应在1h内完成。

基于必特螺旋霉素发酵过程物理和生理作用的消泡剂筛选

综合消泡剂的物理消泡效果及其对发酵过程参数的影响2个主要方面,考察4类(共13种)消泡剂对必特螺旋霉素发酵的影响。首先从4类消泡剂中筛选出7种物理效果好的消泡剂,再通过考察这7种消泡剂对必特螺旋霉素生物合成的影响,最后筛选到了消泡、抑泡效果好,并对发酵有显著促进作用的#12消泡剂。在此基础上研究这种消泡剂对发酵过程参数的影响,并优化它的添加浓度,最终使发酵单位提高34.5%。

缬氨酸对必特螺旋霉素生物合成的影响

在必特螺旋霉素基因工程链霉菌WSJ～1—195发酵生产必特螺旋霉素的摇瓶实验中，发酵36h时向合成培养基中添加0．5g／L的缬氨酸对必特螺旋霉素效价和组分的影响最为显著。实验结果表明：添加缬氨酸后，菌体在发酵48～60h糖耗加快，达到1g／（L·h），发酵液中丙酸和丁酸浓度先增后降，而发酵液中丙酮酸在胞内积累，丙酮酸羧化酶活性在48h和60h时分别增加20％和95％。由于糖耗加快，更多碳流可以通过甲基丙二酰CoA转羧基酶途径（MCT途径）将缬氨酸分解生成的丙酰CoA和丁酰CoA转化为内酯环合成所需要的直接三碳前体，最终效价比对照高出45．3％。添加缬氨酸后，由于大环合成增多，侧链前体的供应无法满足内酯环增加的需求，导致酰化组分含量总体下降，其中总异戊酰组分降低23％，乙酰螺旋霉素Ⅲ降低30．8％，丙酰螺旋霉素Ⅱ降低33％，丙酰螺旋霉素Ⅲ降低48．8％。同时缬氨酸代谢生成的丁酸也有可能会影响异戊酰基转移酶的活性。

必特螺旋霉素的工业结晶过程

以未知杂质为考察的着重点,探索了25℃下必特螺旋霉素最佳结晶时的pH以及同一pH下温度对工业结晶的影响。利用高效液相色谱对结晶产品进行检测,并用外标法对必特螺旋霉素中各部分杂质进行了详细的分析,通过对比结晶过程有效组分和总未知杂质对螺旋霉素的选择性系数,在兼顾有效组分含量合格和杂质质量分数最低的前提下,确定最优结晶终点pH为7.5~8.0,最优结晶温度为25~35℃。该方法首次以未知杂质的含量变化来探索必特螺旋霉素结晶的规律,工业上便于实施,有利于指导工业生产。