源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成与抑制机理

探讨源于马铃薯多酚氧化酶(PPO)的酶活性中心必需基团组成与抑制剂对PPO的抑制作用类型。应用具有相对专一性的氨基酸基团化学修饰剂溴乙酸(BrAC)、乙酰丙酮(Hacac)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、1,4-二硫代苏糖醇(DTT)与对氯汞苯甲酸(pCMB)等对PPO进行化学修饰反应,确定源于马铃薯的多酚氧化酶活性中心必需基团组成为组氨酸(His)的咪唑基、精氨酸(Arg)的胍基与色氨酸(Trp)残基,二硫键对酶活性中心的稳定有贡献作用但游离的硫基不是酶反应所必需的基团。抑制动力学实验表明乙醇对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.12 mmol/L,抑制类型为竞争性可逆抑制,苯甲酸对PPO的IC50为0.07 mmol/L,抑制类型为非竞争性可逆抑制。说明乙醇通过与PPO酶活中心结合抑制PPO酶活性而苯甲酸则通过与PPO非酶活中心的结合抑制PPO酶活。

富士苹果中多酚氧化酶活性的中心必需基团与抑制动力学

以源于苹果的多酚氧化酶(PPO)为对象,选取溴乙酸、乙酰丙酮、N-溴代琥珀酰亚胺、1,4-二硫代苏糖醇和对氯汞苯甲酸等具有相对专一性的氨基酸基团修饰剂,研究PPO的酶活性中心必需基团,并确定乙醇对PPO的抑制动力学特性.结果表明:富士苹果中的PPO蛋白结构中酶活性中心必需基团有组氨酸的咪唑基、精氨酸的胍基与色氨酸残基.抑制动力学实验表明:乙醇通过与PPO酶活中心基团的结合抑制PPO酶活性,其对PPO的半抑制浓度(IC50)为0.14mmol.L-1,抑制类型为可逆的竞争性抑制.

菜青虫N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究

从菜青虫表皮分离纯化N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase),获得电泳单一纯的酶制剂,通过化学修饰法研究该酶的活性必需基团.分别以碳化二亚胺(EDC)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、对-氯汞苯甲酸(pCMB)、二硫苏糖醇(DTT)、溴代乙酸(BrAc)和乙酰丙酮在特定条件下对该酶进行特异的化学修饰,结果表明酸性氨基酸的侧链羧基、半胱氨酸巯基、色氨酸的吲哚基、组氨酸的咪唑基、二硫键被修饰后,酶活性均显著下降,因此这些氨基酸残基是酶活性的必需基团,而精氨酸残基及赖氨酸ε-氨基被修饰后对酶活力没有影响,不是酶的必需基团.

黄海黄杆菌YS-9412-130低温碱性蛋白酶活性必需基团分析

用化学修饰法结合酶的紫外吸收光谱变化研究黄海黄杆菌 YS- 94 12 - 130分泌的海洋低温蛋白酶的功能基团性质 ,结果表明 ,羟基、咪唑基、ε-氨基及胍基均与酶活性有关 ,而羧基、巯基与酶活性无关。酶的性质与丝氨酸蛋白酶有很大的相似性。

甘露聚糖酶Man23的化学修饰及活性必需基团测定

用化学修饰剂NEM、二甲基溴化锍、EDC、DEPC、TNM、对硝基苯乙二醛、PMSF、TNBS对芽孢杆菌B23产生的甘露聚糖酶M an23进行化学修饰,并测定修饰反应的动力学参数关系。结果显示半胱氨酸、色氨酸(1个)和谷氨酸(或天冬氨酸)残基(2个)是酶活性的必需基团;组氨酸、酪氨酸、精氨酸、丝氨酸和赖氨酸残基均为非必需基团。双向电泳结果显示酶蛋白分子具有一个链内二硫键(Cys90-Cys110)。荧光光谱测定结果显示该酶最大吸收峰为336 nm。底物作用导致酶的发射光谱发生蓝移,说明色氨酸残基位于酶蛋白分子内部的疏水区。

中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶活性必需基团的研究

为了探讨中国鲎N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)活性的必需基团,采用了化学修饰法进行研究,分别以甲醛、乙酸酐、三硝基苯磺酸、对氯汞苯甲酸、苯甲基磺酰氟、二巯基苏糖醇、乙酰丙酮、溴代乙酸、碘代乙酸、N-溴代琥珀酰亚胺等10种修饰剂,在特定环境中对中国鲎NAGase进行化学修饰。结果表明:中国鲎NAGase中赖氨酸的ε-氨基、组氨酸的咪唑基、色氨酸的吲哚基和丝氨酸的羟基经修饰后,酶活力几近丧失,这些氨基酸基团为酶活性的必需基团,且可能处于酶的活性部位;半胱氨酸的巯基经修饰后不完全失活,说明半胱氨酸的巯基是NAGase催化活性所必需的,但可能不处于酶的活性部位;酶的二硫键被修饰后,酶活力明显下降,说明二硫键在维系NAGase的三维空间构象中起重要作用;而精氨酸的胍基经修饰后酶的活性基本不变,因此,精氨酸不是NAGase的必需基团。

菠萝蜜多酚氧化酶必需基团的研究

以菠萝蜜果肉多酚氧化酶(Polyphenol oxidase,PPO)为研究对象,选用对氯汞苯甲酸、溴乙酸、β-巯基乙醇、PMSF、乙酰丙酮等8种化学修饰剂,研究PPO酶活的必需基团。并观察苹果酸、柠檬酸、β-环糊精、山梨醇、抗坏血酸、半胱氨酸、谷胱甘肽等9种食品添加剂对PPO活性的影响。结果表明,组氨酸是酶活的必需基团,可能位于酶活中心;丝氨酸和赖氨酸对酶活有一定贡献;二硫键对酶活有重要贡献。1 mmol/L EDTA·Na抑制15%酶活,抗坏血酸、半胱氨酸和谷胱甘肽可显著抑制酶活,IC50依次为0.3、0.2、0.56 mmol/L。

白蜡虫碱性磷酸酶功能基团的研究

白蜡虫Ericeruspela雌成虫经匀浆 ,正丁醇抽提 ,硫酸铵分段盐析 ,SephadexG 150凝胶过滤等步骤 ,得到比活力为 136 65U mg蛋白酶制品。用苯甲基磺酰氟、N 溴代琥珀酰亚胺、三硝基苯磺酸、二巯基苏糖醇、对氯汞苯甲酸、琥珀酸酐、溴乙酸、碘乙酸等化学修饰剂在一定条件下选择修饰白蜡虫碱性磷酸酶的几种氨基酸残基 ,并测定酶活力变化。结果表明 :苯甲基磺酰氟、N 溴代琥珀酰亚胺、三硝基苯磺酸、琥珀酸酐、二巯基苏糖醇的修饰能显著抑制酶的活力 ,活力的降低与修饰剂的浓度有关。氯汞苯甲酸、溴乙酸、碘乙酸的修饰对酶的抑制作用影响较小。初步认为 :丝氨酸、赖氨酸和色氨酸残基是白蜡虫碱性磷酸酶的必需功能基团 。

背角无齿蚌碱性磷酸酶的功能基团研究

在一定条件下分别采用PMSF、DTT、PCMB、NBS、TNBS、SUAN、BrAc及IBr等化学修饰剂选择修饰背角无齿蚌碱性磷酸酶的多种氨基酸残基，并测定其酶活力变化。结果表明，PMSF、NBS、TNBS、SUAN、DTT的修饰能显著抑制酶的活力，活力的降低与修饰剂的浓度相关。BrAc、IAc、PCMB的修饰不表现对酶的抑制作用。作者初步认为，Ser、Lys和Trp残基是背角无齿蚌碱性磷酸酶的必需功能基团，部分二硫键时保护酶的催化功能也是必需的。

氨基酰化酶Ⅰ的必需半胱氨酸巯基

本文用DTNB和IAM修饰了猪肾氨基酰化酶Ⅰ的半胱氨酸巯基,用Koshland和邹承鲁作图法定量处理的结果都表明,酶分子中有二个巯基为酶的必需巯基。

中华蜜蜂工蜂碱性磷酸酶功能基团的研究

在一定条件下,分别采用二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)、N-溴代琥珀酰亚胺(NBS)、苯甲基磺酰氟(PMSF)、溴乙酸(BrAc)、乙酰丙酮、巯基乙醇(ME)等化学修饰剂选择修饰中华蜜蜂碱性磷酸酶多种氨基酸残基,并测定其酶活力变化。结果表明,DTNB、PMSF的修饰不表现对酶的抑制作用,而NBS、BrAc、ME能显著抑制酶的活力,乙酰丙酮也能抑制酶的活力,但是不太明显。因此认为Trp、His是中华蜜蜂工蜂碱性磷酸酶的必需功能基团,部分二硫键对保护酶的催化功能也是必需的。

菠萝蜜过氧化物酶活性部位的研究

以菠萝蜜果肉过氧化物酶(peroxidase,POD)为研究对象,用丁二酮、碳化二亚胺(N-ethylN’-3-dimethylaminopropyl carbodiimide,EDC)、N-乙酰咪唑(N-acetylimidazole,NAI)、β-巯基乙醇(β-mercaptoethanol,MT)、对-氯汞苯甲酸(parachloro-mercuri-benzoate,p CMB)和焦碳酸二乙酯(diethylpyrocarbonate,DEPC)对POD进行化学修饰,研究酶活性必需基团。结果表明,丁二酮、EDC和NAI对酶活力无显著影响,说明精氨酸、羧基和酪氨酸与酶活力无关;p CMB、DEPC和β-巯基乙醇强烈抑制酶活性,说明半胱氨酸和组氨酸是酶活性的必需基团,二硫键对酶活性有重要贡献。动力学分析和底物保护实验表明,DEPC为POD的竞争性抑制剂,组氨酸位于酶活中心。

生物絮凝剂产生菌节杆菌LF-Tou 2葡萄糖基转移酶的性质与化学修饰

节杆菌LF-Tou2葡萄糖基转移酶是控制絮凝剂聚糖合成的酶。通过对细胞超声破碎使酶释放,经Sephadex G200凝胶色谱和DEAE-Sepharose Fast Flow离子交换色谱对酶进行了纯化。对酶学特性进行了分析,并用5种化学修饰剂对酶分子中5种不同氨基酸残基与催化活性之间的关系进行了研究。结果表明:该酶的分子质量为14315Da;样品中w(α-螺旋)=31.7%,w(β-转角)=34.1%,w(无规卷曲)=34.2%。Km为2.752μmol,Vmax为58.056μmol/min;Mn2+是酶活性强有力的激活剂,Fe2+次之。酪氨酸和二硫键是酶分子的结构基团,色氨酸、巯基和组氨酸是酶活力的必需基团,在必需基团中色氨酸最关键。

米曲霉外切β-D-氨基葡萄糖苷酶的化学修饰

采用化学修饰剂对来源于米曲霉(Aspergillus Oryzae)的外切β-D-氨基葡萄糖苷酶(GlcNase)进行修饰。氯胺-T(Ch-T)和碳二亚胺(EDAC)的修饰结果表明甲硫氨酸残基和羧基是GlcNase的必需基团。用化学修饰剂对GlcNase的羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键进行修饰,结果表明:修饰剂在较高的浓度范围内均没有引起酶活的显著降低,因此羟基、精氨酸残基、酪氨酸残基、巯基和二硫键都不是维持GlcNase酶活的必需基团。

尼罗罗非鱼肝脏N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质分析

N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(NAGase)是生物体内主要的溶酶体水解酶之一,广泛存在于动植物和微生物体内.以尼罗罗非鱼(Oreochromis niloticus)肝脏作为材料,采用硫酸铵(饱和度30%~70%)分级沉淀、DEAE Sepharose Fast Flow离子交换柱层析、Sephadex G-200分子筛凝胶过滤柱层析的方法分离纯化NAGase,得到比活力为2 988 U/mg的酶制剂.经十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测呈现单一条带,说明所得酶为PAGE单一纯.通过Sephadex G-200柱层析法测得NAGase的总分子质量为61.8 ku,结合SDS-PAGE结果,说明该酶仅有一个亚基.进一步测定了NAGase的酶学性质:NAGase水解底物对硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷(pNP-NAG)的最适温度为55℃,温度稳定范围为0~55℃,超过75℃时则完全丧失活性;NAGase水解底物的最适pH为5.8,pH稳定范围为4.0~9.0,pH大于9.0时几乎完全失活;该酶水解底物的动力学参数K m和v m分别为0.229 mmol/L和9.346μmol/(L·min);运用化学修饰法分析发现二硫键、氨基、组氨酸咪唑基和色氨酸吲哚基均是NAGase的活性必需基团,而精氨酸胍基则不是其活性必需基团.

头孢喹肟在兽医临床上的应用

头孢母核的7位为甲氧亚胺基-5-氨基噻唑取代基．其为抗菌活性的必需基团．和第三代头孢菌素不同的是其母核的3位有一个季铵盐基团．

日本鳗鲡肠道N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶的分离纯化及酶学性质

为了探讨日本鳗鲡(Anguilla japonica)N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶(EC3.2.1.52,NAGase)的分离纯化及其酶学性质,通过硫酸铵沉淀分级分离、Sephadex G-100分子筛凝胶柱层析和DEAE-32离子交换柱层析纯化NAGase,经聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)和SDS-PAGE鉴定酶的纯度、测定酶蛋白亚基分子质量;以对-硝基苯-N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖为底物,研究NAGase催化反应的动力学参数,探讨其酶学性质。结果表明:日本鳗鲡肠道NAGase纯酶制剂比活力为2517.40 U/mg,酶蛋白亚基分子质量为69.98 kD,酶的最适pH、最适温度、米氏常数K_(m)和最大反应速度V_(max)分别为6.0、60℃、0.336 mmol/L和7.634μmol/(L·min);酶在pH 4.8—7.2较稳定,在温度60℃以下具有较好的热稳定性,在65℃以上酶迅速失活。Mg^(2+)、Ca^(2+)、Mn^(2+)、Cu^(2+)和Fe^(3+)对NAGase表现出不同程度的激活作用,Na^(+)、Li+和Ba^(2+)对酶活力几乎没有影响,Zn^(2+)、Fe^(2+)、Pb^(2+)和Hg^(2+)对酶活力有不同程度的抑制作用,Hg^(2+)对酶活力抑制作用最强,1.0μmol/L Hg^(2+)可使酶活力丧失83.69%。化学修饰法研究表明,精氨酸胍基不是日本鳗鲡NAGase的必需基团,而赖氨酸ԑ-氨基、半胱氨酸巯基、组氨酸咪唑基、丝氨酸羟基和色氨酸吲哚基是酶的必需基团,二硫键是NAGase活性所必需的。综上所述,实验采用的日本鳗鲡肠道NAGase分离纯化方案有效可行,酶活力易受环境中酸碱度、温度和金属离子的影响,且与其他不同动物来源的NAGase具有相似的必需基团。

Analysis of Functional Group of Alkaline Phosphatase from DFRKN-1

To further understand characters of alkaline phosphatase and provide reference for in-depth study of the mechanism of NFRKN-1 invading into knot nematode and its development and utilization, the effects of metal ions, organic reagents and chemical modifier on activity of alkaline phosphatase from DFRKN-1 were analyzed in the paper. The results showed that Mg2+, Ba2+ and K+ under certain concentrations activated enzyme significantly and Zn2+ could inhibit enzyme activity. Methanol, ethanol and ethylene glycol inhibited enzyme activity in similar degrees. Histidine residue and Lysine residue are essential groups of alkaline phosphatase; sulfhydryl of cysteine was not an essential group, but disulfide bond played an important role in maintaining the active conformation of alkaline phosphatase.

酶和ATP教学中常见问题释疑

“降低化学反应活化能的酶”和“细胞的能量‘货币’ATP”分别是人教2019版教材《必修1•分子与细胞》中第五章的内容。学生在学习该部分内容时经常遇到各种问题。那么,常见的问题有哪些?又该如何解答呢?1 pH影响酶促反应速度的原理酶促反应介质的pH既可影响酶分子的结构,特别是活性部位内必需基团的解离程度和催化基团中质子供体或质子受体所需的离子化状态,也可影响底物和辅酶的解离程度,从而影响酶与底物的结合。只有在特定的pH条件下,酶、底物和辅酶的解离状态,最适宜于它们相互结合,并发生催化作用。