肾综合征出血热病毒快速荧光灶抑制试验

报道一种新的HFRS病毒中和抗体检测方法──快速荧光灶抑制试验的建立。方法：病毒和细胞同时加入塑料微孔板上，37℃培养24小时后，经固定和荧光染色，即可在荧光显微镜下判定结果。结果：检验的4株病毒能在Vero－E6细胞上形成荧光灶；接种病毒的浓度与荧光灶里直线关系。用此法检测Z10单价和双价灭活疫苗免疫的20份兔及人血清的中和抗体，与空斑减少中和试验的结果相一致。结果：此法具有快速、简便、敏感、稳定的特点。

采用快速荧光灶抑制试验对一种狂犬病病毒抗体竞争性ELISA检测法的评价

目的以快速荧光灶抑制试验(RFFIT)检测结果为标准,确定竞争性酶联免疫吸附试验(ELISA)检测人血清样品中狂犬病病毒抗体的能效。方法对100份人血清样品采用RFFIT检测狂犬病病毒中和抗体,采用竞争性ELISA检测狂犬病病毒抗体,分析两种方法检测结果的相关性和一致性。结果经回归分析,两方法检测结果之间有线性关系,回归方程Y=2.320+0.333X,相关系数r=0.504;经χ2检验,两种方法阳性检出率差异无统计学意义(χ2=3.70,P>0.05),两种方法有相关性(χ2=16.50,P<0.05);经Scheff啨可信区间法分析,RFFIT不同检测值范围内ELISA阳性检出率之间差异无统计学意义(P>0.05)。结论本组评价的竞争性ELISA与RFFIT检测结果之间有相关性,但一致性较差,还需要进一步改进。

血清稀释条件对快速荧光灶抑制试验结果的影响

目的：对比不同倍比稀释条件稀释血清对快速荧光灶抑制试验（RFFIT）结果的影响,以指导RFFIT在狂犬病防控中的应用。方法：采集65个健康个体和40个狂犬病暴露后预防处置（PEP）个体的血清标本,分别进行3倍和5倍倍比稀释,采用RFFIT检测抗狂犬病病毒中和抗体（RVNA）水平。结果：3倍倍比稀释时,RVNA检测结果显示：65个健康个体中,63人〈0.50 IU/m L,2人≥0.50 IU/m L;40个PEP个体均≥0.50 IU/m L。5倍倍比稀释时,RVNA检测结果显示：65个健康个体均〈0.50 IU/m L;40个PEP个体中,34例≥0.50 IU/m L,6例〈0.50 IU/m L,这6例PEP个体在3倍倍比稀释时RVNA呈弱阳性,效价在0.50-1.00 IU/m L。结论：以5倍倍比稀释条件稀释血清进行RFFIT检测时灵敏度降低,但是检测结果更能反映个体实际免疫状态,可能更有利于指导狂犬病PEP措施。

非标准方法检测狂犬病病毒抗体阴性血清快速荧光灶抑制试验复核结果分析

目的揭示非标准方法检测狂犬病病毒抗体阴性血清真实的狂犬病病毒中和抗体状态,指导基层狂犬病门诊正确认识非标准方法检测结果的意义。方法收集狂犬病疫苗免疫个体经酶联免疫吸附试验(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)和胶体金(colloidal gold, CG)法检测狂犬病病毒抗体阴性血清,采用快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行复核,Excel表统计数据。结果ELISA,CG法检测 1 053、1321 份血清,其中 102(9.69%, 102/1053)、183( 13.86%,183/1321)份血清为阴性,经RFFIT复核确证6(5.88%,6/102)、14(7.65%,14/183)份血清阴性。ELISA、CG法阴性结果的多数样品(88.55%、96.45%)经RFFIT检测狂犬病病毒中和抗体效价0.5-2.0 IU/mL。结论狂犬病病毒抗体非标准检测方法灵敏性有待提高,对其阴性检测结果应谨慎解读。

快速荧光灶抑制试验检测暴露后人群接种狂犬病疫苗的免疫学效果

目的调查暴露后人群接种狂犬病疫苗(Rabies Vaccine for Human Use,RabV)的免疫学效果。方法 122例暴露后,病例接种RabV后应用快速荧光灶抑制试验检测抗体产生情况。结果 3剂免疫后抗体阳性率达99.1%,5剂免疫后抗体阳性率为100%;不同性别病例抗体几何平均滴度差异无统计学意义。青少年接种RabV的应答较快,中老年接种RabV的应答较慢。结论对要确定是否需要接受RabV加强接种以建立一个可接受的暴露前免疫状态,对有免疫缺陷等身体状况特殊者,有必要检测接种RabV后的中和抗体,对未产生抗体者应及时补充免疫,确保免疫学效果。

假病毒中和试验对狂犬病毒中和抗体效价的检测效能分析

目的:组织不同的实验室分析假病毒中和法(Pseudo Virus-based Neutralization Assay,PBNA)对不同样品的狂犬病病毒中和抗体水平的检测能力,并比较其与经典的快速免疫荧光灶抑制试验(Rapid Fluorescent Focus Inhibition Test,RFFIT)以及小鼠中和试验法(Mouse Neutralization Test,MNT)的相关性。方法:共9家实验室,分别采用PBNA、RFFIT以及MNT法对6份样品进行狂犬病病毒中和抗体检测,每个实验室进行3~5次重复实验。采用配对t检验及Pearson相关系数对3种检测方法的结果进行统计学分析。结果:PBNA与RFFIT、PBNA与MNT、RFFIT与MNT Pearson相关系数分别为0.985、0.988和0.974,抗体几何平均滴度进行t检验,差异均无统计学意义(P>0.05)。结论:3种方法重复检测6份样品的定量结果具有高度的相关性,PBNA法可作为《中华人民共和国药典》方法RFFIT、MNT的一种替代或补充方法,用于人用狂犬病疫苗临床血清、狂犬病人免疫球蛋白及抗狂犬病血清的狂犬病病毒中和抗体效价检测。

抗狂犬病病毒中和抗体效价快速荧光灶抑制试验(RFFIT)的建立及应用

目的建立抗狂犬病病毒中和抗体效价的快速荧光灶抑制试验(RFFIT),验证其与小鼠脑内中和法(MNT)的相关性,并用于马抗狂犬病病毒血清(ERIG)和人狂犬病免疫球蛋白(HRIG)及狂犬病疫苗免疫后血清中和抗体效价的测定。方法待测血清或免疫球蛋白在96孔板中作3倍系列稀释,与能感染80%～95%细胞量的攻击病毒混合后,37℃体外中和1h,接种BSR细胞,培养24h后荧光染色,荧光显微镜下读取结果。用建立的RFFIT法与MNT法同时标定狂犬病免疫球蛋白国家标准品,并检测ERIG和HRIG以及疫苗免疫后血清样品的抗狂犬病病毒中和抗体效价,以比较两种方法的精密度和相关性。结果采用MNT法和RFFIT法检测我国抗狂犬病免疫球蛋白国家标准品的GMT分别为21.4和23.8IU/ml,两种方法的变异系数分别为62.3%和13.3%;两个实验室用RFFIT法测定我国国家标准品的结果分别为21.71和23.81IU/ml。两种方法测定ERIG和HRIG及疫苗免疫后血清中和抗体效价的结果差异无统计学意义,相关系数为0.976,两种方法的检测结果之间呈良好的正相关性。结论RFFIT法可替代MNT法检测抗狂犬病病毒中和抗体效价。

快速荧光灶抑制试验的应用和改进

快速荧光灶抑制试验（rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT）是世界卫生组织（World Health Organisation，WHO）推荐的狂犬病病毒中和抗体检测标准方法，已被应用于狂犬病疫苗免疫效果评估、狂犬病疫苗新型免疫方案评估、狂犬病诊断试剂和方法评估、狂犬病被动免疫制剂评价。对RFFIT的改进包括自动化判读结果和用表达绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的重组狂犬病病毒做为攻击病毒，这些改进目前尚未获得广泛应用，传统RFFIT仍然是值得推广的狂犬病病毒中和抗体检测方法。

ELISA法与RFFIT法检测狂犬病疫苗免疫后血清抗体的比较

目的比较狂犬病疫苗免疫后血清抗体酶联免疫吸附试验(ELISA)与快速免疫荧光灶抑制试验(RFFIT)两种检测方法。方法对93名研究对象采用0、3、7、14和28d程序进行暴露后免疫,分别采用ELISA法与WHO认可的金标法RFFIT法检测免疫D0、D3、D7、D14、D45d的血清抗体。结果免疫D0、D3、D7、D14、D45dELISA法检测抗体阳性率分别为8.6%、11.8%、22.6%、49.6%、86%,RFFIT法检测抗体阳性率分别为0%、0%、22.58%、100%、100%,ELISA法与RFFIT法阳性符合率分别为0%、0%、34.8%、100%、100%;阴性符合率分别为100%、100%、81.4%、0%、0%。结论ELISA法检测狂犬病疫苗免疫后血清抗体,免疫早期D0、D3、D7假阳性率较高,免疫D14、D45则假阴性率较高。建议采用WHO认可的方法做检测。

抗狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制试验方法的验证

目的对抗狂犬病病毒中和抗体(Rabies virus neutralizing antibody,RVNA)快速荧光灶抑制试验(Rapid fluorescent focus inhibition test,RFFIT)进行验证。方法利用已检测RVNA效价的人狂犬病疫苗免疫后血清建立血清参考品。采用参考血清和狂犬病人免疫球蛋白标准品,评价RFFIT方法的准确性、重复性、稳定性、线性和检测范围。结果共制备5批血清参考品(A、B、C、D和E),RVNA效价分别为57.39、16.54、8.76、1.38和0.08IU/mL。采用效价适中的参考血清C进行RFFIT方法的认证。参考血清样品C加标(4.5IU/mL、2.25U/mL和1.125IU/mL)后的回收率分别为91.70%、80.15%和74.96%。同一实验人员对相同样品检测6次的RVNA中和效价的变异系数(Coefficient of variation,CV)为7.61%;2名实验人员对相同样品各检测3次的RVNA中和效价的CV为3.88%。标准品效价值与RFFIT方法检测值的线性方程为y=0.9524x-0.1192(R^(2)=0.999),最低检出效价为0.04IU/mL。不同病毒-抗体中和时间、细胞-抗体-病毒孵育时间、丙酮固定时间和荧光抗体染色时间测定的参考血清C中和效价的CV均<30%。结论本研究建立的RFFIT方法对人狂犬病疫苗免疫后血清检测具有很好的准确性、重复性、线性和稳定性,推荐在相关血清检测中应用。

快速荧光灶抑制试验检测狂犬病病毒中和抗体效能评价

目的对人血清中狂犬病病毒中和抗体快速荧光灶抑制试验(RFFIT)进行方法效能评价,为其推广提供技术支撑。方法采用国际标准品、质控参考品和临床血清样品,评价RFFIT方法的检出限、线性、重复性、重现性、特异性和抗干扰能力,并建立质量控制体系。结果 RFFIT方法检出限为0.15 IU/ml;线性曲线斜率为0.999 11,r^(2)=0.980 98;批内重复性和批间重复性的变异系数<5%和<15%;2名不同人员检测结果差异无统计学意义(t=0.348,P=0.731),定性一致率高达100%;71份阳性样品和5份阴性样品定性检测结果的符合率均为100%;8份乳糜血去除乳糜前后的检测结果差异无统计学意义(t=0.022,P=0.983);室间质控和室内质控的变异系数均不超过30%。结论本室建立的RFFIT方法检测效能良好,适用于推广应用。

免疫荧光灶试验法检测消毒剂灭活病毒效果的方法研究

目的建立一种检测消毒剂灭活病毒效果的方法。方法采用免疫荧光灶试验方法,建立消毒剂灭活病毒效果的检测方法。结果本研究建立的荧光灶试验法实验证明,采用浓度为2 000 mg/L季铵盐复合消毒剂对悬液内狂犬病毒作用3 min,平均灭活对数值大于4.0。实验浓度证明该消毒液对病毒宿主细胞生长有影响,但本研究选用的中和剂可有效中和最高实验浓度的消毒剂对病毒及其宿主细胞的影响。结论本研究建立的免疫荧光灶试验方法,可以用于该皮肤黏膜消毒剂灭活狂犬病毒效果的检测,操作简便,出结果快,利于统计计算,便于观察。

PRRSV灭活抗原免疫接种后抗主要结构蛋白抗体的产生规律研究

目的检测PRRSV灭活抗原免疫接种后抗主要结构蛋白抗体的产生规律。方法用差速离心法纯化PRRSV Hn-3/06株,0.1%甲醛灭活PRRSV,加入弗氏佐剂乳化制备成PRRSV灭活抗原。20只昆明系小鼠(7～8周龄)随机分为2组,每组10只,每次每只110μg蛋白剂量,第1组免疫1次,第2组免疫2次,每次间隔7 d。每隔7 d采血1次,间接ELISA方法检测血清中抗PRRSV及GP5、M和N蛋白的抗体效价。用Marc-145细胞进行细胞中和试验,间接免疫荧光灶抑制方法检测血清中和抗体效价。结果 2组小鼠均产生针对PRRSV及各结构蛋白的抗体,抗PRRSV的抗体和抗N蛋白的抗体一免后14 d出现,21 d后抗体效价达到1∶1 280,35 d抗体水平达到最高;抗M蛋白的抗体一免后42 d出现,49 d抗体水平达到最高,抗体效价达到1:160;抗GP5蛋白的抗体一免后49 d出现,至56 d抗体水平呈上升趋势,抗体效价达到1∶80。免疫2次的小鼠各项ELISA抗体效价总体略微偏高。细胞中和试验结果表明第1组免疫小鼠免疫后42 d左右产生微弱的中和抗体;第2组免疫小鼠一免后35～49 d产生可检测到的中和抗体,42 d时中和抗体水平达到最高,抗体效价达到1∶2。结论纯化灭活的PRRSV抗原诱导机体产生的抗主要结构蛋白的抗体滴度较低,说明PRRSV抗原的免疫原性较弱,不能诱导机体产生有效的保护抗体。

改良抗体结合试验的建立和在灭活狂犬病疫苗效价检测中的应用

目的对抗体结合试验(ABT)进行改进并将其用于灭活狂犬病疫苗效力的测定。方法将快速荧光灶抑制试验(RFFIT)与ABT方案融合,在疫苗样品稀释、剩余中和抗体检测、结果计算方面进行改进,形成改良抗体结合试验(M-ABT);应用M-ABT对10种灭活狂犬病疫苗随库存时间增加疫苗效力改变的情况进行检测。结果 M-ABT可以在28 h内完成,比ABT节省2 d,检测结果与人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH)基本等效;10种疫苗随着库存时间增加疫苗效力下降。结论 M-ABT法能够成功建立,并用于灭活狂犬病疫苗效力检测效果较满意。

应用改良抗体结合试验(ABT)方法检测狂犬病疫苗效力

目的 应用改良抗体结合试验（ＡＢＴ）方法在体外快速测定狂大病疫苗效力。方法 将定量的狂犬 病毒中和抗体与疫苗样品进行结合，将剩余的中和抗体的滴度用快速荧光灶抑制试验（ＲＦＦＩＴ）进行测定，然后计算 待测疫苗的效价，并与传统的ＮＩＨ效力试验结果进行比较。结果ＡＢＴ与传统的ＮＩＨ效力试验的结果有良好的相 关性，而且快速、经济，重复性高。结论 该方法在大多数情况下可取代ＮＩＨ效力试验。

狂犬病疫苗接种人群中狂犬病病毒中和抗体水平分析

目的通过分析狂犬病疫苗接种人群中狂犬病病毒RABV中和抗体特征,为狂犬病防控提供依据。方法收集2019-2020年杭州市职业病防治院犬伤后暴露预防接种门诊抗体检测者信息,经筛选后确定157例RABV中和抗体检测者作为研究对象,采用快速荧光灶抑制试验检测狂犬病毒中和抗体,利用横断面研究方法对狂犬病毒中和抗体水平进行人群特征分析。结果研究对象中,初种者98人,复种者59人,复种者中2-1-1程序比5针法产生的抗体水平更高,其余特征均无统计学差异(P>0.05)。除1例初种者中和抗体效价低于0.5 IU/mL,其余检测者中和抗体效价均高于0.5 IU/mL。狂犬病毒中和抗体水平时间趋势分析显示,狂犬病毒中和抗体水平与时间呈负相关,回归方程为(F=4.974,P=0.031),标准化回归系数为-0.322(t=-2.230,P=0.031)。结论复种者狂犬病毒中和抗体水平与免疫程序有关,2-1-1程序对人体再次免疫应答的效果优于5针法。接种疫苗2年后部分个体出现失保护状态,再次暴露有必要全程接种狂犬病疫苗。

狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒的效果评价

目的应用快速荧光灶抑制试验(RFFIT)对狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒的检测效果进行评价。方法用RFFIT和狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒分别对135份人血清和164份动物血清进行狂犬病病毒中和抗体(RVNA)效价检测,应用SPSS22.0分析两种检测方法所得结果的相关性和一致性。结果两种方法所得结果的阳性检出符合率为99.33%(297/299);两种方法对动物血清和人血清的检测结果之间有较好的直线相关关系,相关系数分别为0.897和0.941;同一份标本的重复性检验显示,试剂盒检测方法具有较好的稳定性。结论狂犬病病毒中和抗体检测试剂盒可以用于人和动物血清狂犬病病毒中和抗体的检测。

胸腺肽联合狂犬病疫苗接种对机体产生γ-干扰素、白细胞介素-2和中和抗体影响的研究

目的:观察胸腺肽联合狂犬病疫苗接种对机体γ-干扰素、白细胞介素-2和中和抗体产生的影响。方法:Ⅱ级以下狂犬病暴露人群100例随机分为两组:疫苗组50例,单用狂犬疫苗2.5 U,常规免疫程序接种;胸腺肽组50例,给予50 mg单剂量肌肉注射+狂犬疫苗2.5 U,常规免疫程序接种。在注射前(D0)、注射7 d(D7)、注射6个月(M6)、注射12个月(M12)测定外周血淋巴细胞总数及γ-干扰素、白细胞介素-2水平,注射7 d、注射6个月、注射12个月测定中和抗体水平。结果:外周血淋巴细胞总数两组间无差异;胸腺肽组在注射后7 d白细胞介素-2水平和γ-干扰素水平均高于疫苗组(P<0.05);胸腺肽组在注射后7 d中和抗体产生量高于疫苗组(P<0.05)。结论:加用胸腺肽组注射后7 d中和抗体水平高于单用疫苗组,但6个月和12个月的抗体含量没有差异;两组接种后体内白细胞介素-2和γ-干扰素水平皆增高,白细胞介素-2增加的程度和抗体的产生量呈正相关。

RFFIT法血清系列参考品的建立

目的建立血清参考品,用于RFFIT法检测抗狂犬病毒中和抗体。方法狂犬病疫苗免疫后人血清,采用小鼠脑内中和试验确定抗狂犬病毒中和抗体滴度后,混匀,分装,以第2批人免疫球蛋白国际标准品为参考品用RFFIT方法进行标定,并考察所建参考品的稳定性。结果检测用标准血清效价为22.14IU.mL-1,弱阳性、强阳性参考品分别1.11IU.mL-1,9.20IU.mL-1,阴性参考品低于0.1IU.mL-1。结论建立的系列参考品适用于RFFIT法检测人血清中抗狂犬病中和抗体水平。