RACE: cDNA末端快速扩增技术进展

ＲＡＣＥ：ｃＤＮＡ末端快速扩增技术进展明洪黄秉仁中国协和医科大学基础医学院中国医学科学院基础医学研究所国家分子生物学重点实验室北京１００００５基因表达水平和模式的变化驱动着生物体内主要的生物学过程。分离和克隆基因是研究基因结构、功能以及表达的基础。以...

cDNA末端快速扩增技术及其方法的改进

cDNA末端快速扩增(RACE)技术可以快速扩增mRNA3'和5'末端,从而获得全长的cDNA序列,为分离和研究新的基因提供了一个快速简便的方法。从RACE的原理出发,综述RACE技术的优缺点,阐述RACE技术的改良,并对其应用现状和发展前景进行了分析。

少棘蜈蚣毒腺RACE cDNA文库的构建及β-actin基因的克隆与序列分析

运用SMART技术首次构建了少棘蜈蚣(Scolopendrasubspinipes)毒腺cDNA文库。经琼脂糖电泳检测,文库所含全长cDNA主要分布在5 0 0bp以上,大于2 0 0 0bp的区域尚有很长拖尾,中间有几条高丰度mRNA亮带。以此文库为模板,通过5′RACE(RapidamplificationofcDNAends,快速扩增cDNA末端)方法获得了细胞质肌动蛋白βactin基因5′末端5 98bp片段,其中包括开放阅读框5 46bp ,编码1 82个氨基酸。将该基因片段推导的氨基酸序列通过BLAST软件与蛋白质公共数据库Swissprot比对,发现与蜜蜂(Apismellifera)的βactin基因同源性高达96% ,说明本实验所构文库质量完全可以满足用RACE方法进行功能基因的cDNA克隆。通过基于双参数模型的NJ法对部分动物βactin基因进行系统重建,较好地反映了这些动物的系统发生关系。

口蹄疫病毒全长cDNA克隆的快速构建

利用RT PCR和 3′cDNA末端快速扩增 (RACE)技术分别扩增出包含口蹄疫病毒(FMDV)全基因组的 2个重叠cDNA片段 ,将其分别插入到载体 pcDNA3.1zeo(+)和pGEM T Easy中 ,然后利用片段本身单一酶切位点将FMDV全长cDNA克隆至 pcDNA3.1zeo(+)载体 ,经PCR扩增、酶切鉴定和序列测定。结果表明 ,重组质粒 (pcDNA3.1/FMDV)

cDNA文库构建策略及其分析研究进展

cDNA文库构建和筛选是基因克隆的重要方法之一,它是目前发现新基因和研究基因功能的基本工具。从cDNA文库中可以筛选到目的基因,并直接用于该基因的表达。经典cDNA文库存在克隆的片段短等缺点,而全长cDNA文库则能提供完整的mRNA信息,从而克隆cDNA全长;对文库进行均一化处理即均一化cDNA文库,可以增加克隆低丰度mRNA的机会;差减cDNA文库在研究生物体某一时期基因差异表达上具有重要的意义;改进的固相cDNA很大程度上提高了建库的效率和质量。本文以阐述基本原理为主,介绍几种近年来常用的cDNA构建的方法及其优缺点。

黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长克隆及其表达分析

利用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆了黄颡鱼DMRT1基因cDNA全长序列,并利用实时荧光定量RT-PCR技术对该基因在黄颡鱼成体不同组织及不同发育阶段的表达情况进行研究。结果表明,黄颡鱼DMRT1基因cDNA序列全长1 381bp,其中5′端非翻译区30bp,3′端非翻译区454bp[不包括poly(A)],开放阅读框885bp,编码295个氨基酸。氨基酸序列同源性分析表明,黄颡鱼DMRT1基因与革胡子鲶同源性最高(为81%),与黑鲷、虹鳟、斑马鱼、青鳉的同源性分别为60%、59%、64%和52%,与小鼠、人的同源性较低,分别为42%和44%。实时荧光定量RT-PCR分析表明:DMRT1基因在黄颡鱼胚胎发育阶段及胚后发育的1～51d仔鱼均有表达,且在胚后发育的第31天表达量最高;在成体,只在雄性精巢中特异性表达,其他组织均无表达,且性腺发育阶段的Ⅳ期精巢表达量最高,表明该基因可能在黄颡鱼雄性性腺的形成或功能维持上具有重要作用。

三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆及表达分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了三角帆蚌β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为1483bp,由长92bp的5′非翻译区(untranslated region,UTR),257bp的3′非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为41.9ku,理论等电点为5.3。三角帆蚌β-actin氨基酸序列中Met178,Ser305,Ser321,Pro325,Val331,Pro346等6个氨基酸残基具有特异性,此外还发现3个特殊的氨基酸残基位点以及2个软体动物特有的氨基酸残基。三角帆蚌β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达98%～99%。NJ法系统进化分析显示三角帆蚌首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再依次与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。RT-PCR显示β-actin基因在外套膜、血液、肝、肾、胃、肠、鳃、斧足共8个组织的表达基本一致,具有良好的稳定性。

小麦NBS-LRR类抗病基因同源cDNA序列的克隆与表达分析

为获得小麦抗叶锈病相关基因,以小麦近等基因系TcLr19所构建的非亲和cDNA文库中获得的EST序列(Contig 914)为靶序列,用RT-PCR方法和cDNA末端快速扩增技术,分离克隆到片段为3 042bp的全长cDNA序列。序列分析表明该序列符合典型单子叶植物的CC-NBS-LRR结构模式,命名为TaNLR。该基因包含一个完整的2 739bp的开放阅读框(ORF),具有连续的Poly A尾和典型的加尾信号AATTAA。ProtParam程序预测表明该基因编码912个氨基酸。发育树分析显示该氨基酸序列与大麦的NBS-LRR类抗病基因蛋白同源性最高达89%。荧光定量PCR分析表明,在小麦与叶锈菌互作中,TaNLR基因受叶锈菌诱导下调表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病同源基因,这为明确NBS-LRR在小麦抗叶锈病中的作用奠定了基础。

高山红景天中糖基转移酶家族cDNA全长基因的克隆

为了获得高山红景天中红景天苷生物合成关键酶——UDP-糖基转移酶家族基因的全长cDNA序列,采用在线简并引物设计软件结合3′-RACE技术获得两个糖基转移酶基因的3′端部分序列,进一步采用不同的5′-RACE试剂盒扩增两个基因的5′端序列,结果显示利用Takara公司的试剂盒扩增可以得到cDNA全长序列(GenBank登录号为EF508689和EU567325),而采用Invitrogen公司的试剂盒得到的序列不包括全部开放读码框。实验证明,利用Takara公司的SMARTerTM RACE cDNA Amplification Kit克隆获得基因全长序列的比率更高。

珊瑚藻R-藻红蛋白rpeA和rpeB基因全长cDNA克隆与序列分析(英文)

依据珊瑚藻 (CorallinaofficinalisL .)藻红蛋白rpeA和rpeB的DNA序列 (AF5 1 0 986 )设计引物 ,通过PCR RACE方法扩增得到rpeA和rpeB的cDNA序列 .序列分析表明 ,该序列采用多顺反子转录策略 ,全长 2 2 5 7bp(AF5 42 5 5 4) ,排布顺序为 5′UTR rpeB 间隔区 rpeA 3′UTR .5′非编码区 4 93bp ,rpeB基因 5 34bp ,基因间隔区 1 0 1bp ,rpeA基因 4 95bp ,3′非编码区 6 34bp .在rpeA和rpeB的基因起始密码子上游均存在类似原核核糖体结合的Shine Dalgarno (SD)序列 .在rpeA基因终止密码子下游 1 1 0bp处还存在着一个可能的开放阅读框架 .经检索GenBank发现 。

小麦NBS类抗病基因同源cDNA序列的克隆与特征分析

根据已克隆植物抗病(R)基因NBS保守结构域设计简并引物,采用RT-PCR和cDNA末端快速扩增技术(RACE),在小麦抗叶锈病近等基因系材料TcLr19中进行抗病同源基因cDNA全长的扩增。获得了1个通读的NBS类抗病同源基因S11A11cDNA序列,该序列全长2923bp,编码878个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明,该片段含有NB-ARC保守结构域和多个LRR结构域。聚类分析表明,S11A11编码的蛋白与小麦抗叶锈病基因Lr1编码的蛋白亲缘关系较近,而与Lr10亲缘关系较远。半定量RT-PCR分析表明,该基因在小麦叶片中为低丰度组成型表达。本研究在TcLr19小麦中成功获得了抗病基因同源序列,为最终克隆小麦抗叶锈病目的基因奠定了基础。

猪类无精症缺失基因DAZL的cDNA全长克隆、组织表达和亚细胞定位

旨在获得猪类无精症缺失基因DAZL cDNA全长序列,阐明该基因的序列、mRNA组织表达模式、蛋白质结构特征及亚细胞定位情况。本研究以版纳微型猪近交系(Banna mini-pig inbred line,BMI)10月龄成年公猪为研究对象,屠宰收集组织样,利用RACE和RT-PCR技术获得DAZL基因cDNA全长序列;使用实时荧光定量PCR(qPCR)技术检测其mRNA多组织表达谱;在线分析蛋白质的结构特点和保守结构域;用体外细胞转染技术鉴定其在ST猪睾丸细胞中的定位。结果表明,BMI DAZL cDNA全长2985 bp(KU705632),包含888 bp的CDS区,编码295个氨基酸(AOC89050);该基因位于猪13号染色体,含11个外显子。qPCR结果显示,DAZL mRNA在睾丸中特异高表达。生物信息学分析表明,猪DAZL蛋白含有哺乳动物RMP和DAZ同源区,无规则卷曲在二级结构中超过50%。进化分析表明,BMI DAZL氨基酸序列高度保守,与牛科的亲缘关系最为接近。pEGFP-C1-DAZL转染ST细胞后的荧光共定位结果显示,DAZL蛋白主要分布在细胞核中。本研究分别从DNA、mRNA和蛋白质层面阐明了BMI DAZL基因的序列特征、表达、蛋白质结构和定位,为进一步研究DAZL在BMI精子发生方面的功能奠定基础。

曼氏无针乌贼(Sepiella maindroni)β-肌动蛋白基因的cDNA全长克隆与序列分析

采用RT-PCR和快速扩增cDNA末端(rapid amplification of cDNA ends,RACE)技术首次克隆了曼氏无针乌贼β-肌动蛋白基因的cDNA全序列,该序列全长为2000bp,由长197bp的5’非翻译区(untranslated region,UTR),669bp的3’非翻译区,和1134bp的开放阅读框(open reading frame,ORF)组成。阅读框共编码377个氨基酸,推算的分子量约为42.0kDa,理论等电点为5.16。曼氏无针乌贼β-actin氨基酸序列中Ile12、Ser172、Ser174、Gln223、His227、Ile231、Gly232、Ser320、Glu328、Thr360等10个氨基酸残基具有特异性,以及2个特殊的氨基酸残基位点和2个软体动物特有的氨基酸残基。曼氏无针乌贼β-actin氨基酸序列与软体动物、节肢动物、脊椎动物的相似性高达97%。NJ法系统进化分析显示曼氏无针乌贼首先与软体动物聚在一起,然后与节肢动物聚在一起,再与鱼类、两栖类、哺乳类聚在一起。

广东紫菜Hsp70基因cDNA克隆与表达分析

为探索广东紫菜(Pyropia guangdongensis)叶状体Hsp70基因在温度刺激下机体耐温相关分子机制,为广东紫菜的栽培生产提供技术参考,本研究利用RACE技术获得了广东紫菜Hsp70基因(PgHsp70)全长序列,并在此基础上采用实时荧光定量PCR技术,研究广东紫菜叶状体分别在不同温度(22℃、27℃和31℃)条件下处理0、1/6、1/2、1、6、12、24和36h后PgHsp70基因的差异表达。结果显示,PgHsp70基因序列长2004bp,包含一个1866bp的开放阅读框,可编码621个氨基酸,预测分子量为67.7kDa,理论等电点为4.87。基因表达水平定量分析表明,温度对PgHsp70基因表达水平有显著影响,PgHsp70基因在不同温度的表达水平变化趋势基本一致,均呈现先上调后下降的趋势,且均于1 h表达量到达最高水平,其中,在31℃ 1h表达量最高,为未经高温处理组的11倍,说明PgHsp70基因在应答高温胁迫中发挥着重要的作用。

背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因cDNA全序列克隆及表达分析

采用RACE方法,克隆了背角无齿蚌抗菌肽theromacin基因的cDNA全序列。结果显示,该cDNA序列全长为870 bp,5'端非翻译区104 bp,3'端非翻译区460 bp,开放阅读框长为306 bp,共编码101个氨基酸,相对分子量为11 166.9 u。同源性分析显示,该基因编码的蛋白与三角帆蚌theromacin基因氨基酸序列的相似度最高,为73%;与贻贝中发现的抗菌肽defensins、mytilins、myticins和mytimycins等4种类型相似度较低,属于Macin家族(登录号:KJ598604)。实时荧光定量PCR分析结果显示,该基因在血液、肝脏、外套膜、鳃、斧足和肠等组织中均有表达,在外套膜中的表达量最高,在其他组织中的表达量较低;经嗜水气单胞菌诱导后,各个组织的表达量出现明显上调的趋势且与对照组显著差异,推测theromacin基因可能在背角无齿蚌的免疫反应中起重要作用。

卵形鲳鲹PPARα基因cDNA序列的克隆、组织表达及生物信息学分析

采用RACE-PCR 克隆卵形鲳鲹（Trachinotus ovatus）过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptors-α,PPAR α）基因的cDNA 序列全长,并应用生物信息学方法分析其编码蛋白质的理化性质和结构特征.结果表明：卵形鲳鲹PPAR α 基因（GenBank 登录号KP893147） cDNA 全长1 930 bp,开放阅读框（ORF）为1 425 bp,共编码474 个氨基酸,其编码的蛋白质为不稳定蛋白,无信号肽和跨膜结构,二级结构由α 螺旋、β转角、伸展片段和无规则卷曲组成,且α 螺旋占较大比例;预测显示,该蛋白有PPARs 基因家族典型的DNA 结合区（DBD）和配体结合区（LBD）;序列对比表明,卵形鲳鲹PPAR α 基因与尼罗罗非鱼（Oreochromis niloticus）、花鲈（Lateolabrax japonicas）、大黄鱼（Larimichthys crocea）、金头鲷（Sparus aurata）、军曹鱼（Rachycentroncanadum）等有较高的同源性（81% - 89%）;蛋白系统进化树分析显示,在人（Homo sapiens）、鼠（Mus musculus）、鸭（Gallus gallus）、花鲈、大黄鱼、军曹鱼等动物中,卵形鲳鲹的PPAR α 蛋白与军曹鱼的进化关系最为密切（94%）,与人（68%）、鼠（68%）、鸭（67%）等的同源性较低.荧光定量分析显示,卵形鲳鲹PPAR α mRNA 在脑、肾脏、肠、脾脏等组织表达水平较高,其次是皮肤、肌肉,在心脏、肝脏中表达量较低.

中华鳖gp130基因全长cDNA克隆及生物信息学分析

目的:从中华鳖脾脏、肝脏、肠道构建的SMART cDNA文库中克隆中华鳖gp130基因cDNA全长。方法:采用RACE法克隆中华鳖gp130基因全长cDNA,并对其进行生物信息学分析。结果:中华鳖gp130基因cDNA全长3806 bp,对应基因组全长73 252 bp,包含16个内含子及17个外显子。中华鳖gp130与鸟类、哺乳类相比均有保守的共线性关系。该基因编码由927个氨基酸残基构成的序列,二级结构主要包括α螺旋、延伸链、无规则卷曲、β转角,三级结构包含配体结合、跨膜结构域、纤维链接蛋白结构域等。系统进化分析显示与鸟类首先聚类,其次是哺乳类,最后是两栖类与鱼类。同时以人GP130蛋白为模型构建了中华鳖GP130蛋白的3D结构模型,一致性为58.32%。结论:获得了中华鳖gp130基因全长并做了生物信息学分析,为深入研究GP130及相关信号通路提供了基础。

简化cDNA末端快速扩增技术测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶd型新城疫病毒基因组末端序列及分析

【目的】简化cDNA末端快速扩增技术(Rapid amplification of cDNAends,RACE)流程,测定基因Ⅲ、Ⅵb和Ⅶd型新城疫病毒(Newcastle disease virus,NDV)基因组两侧末端序列,并对NDV的leader和trailer进行分析。【方法】利用T4 RNA连接酶将特定寡聚核苷酸片段的连接于病毒基因组RNA和cDNA,再利用RT-PCR或PCR方法对病毒基因组的末端进行快速的扩增。【结果】建立一套操作简单、低成本、可重复性高的RACE方法,测定了三种基因型5株NDV3’末端leader和5’末端trailer序列比对分析。【结论】本实验测定的鹅源VII型毒株JS/7/05/Ch基因组的15,184 nt由一个T变为了C,5’端trailer与3’端leader的连续互补序列由8 nt变为12 nt,而其它4株基因Ⅲ型和VI型NDV均未发现该突变。通过RNA的二级结构分析,NDV基因组和反向基因组RNA的3’末端形成一个发卡结构。JS/7/05/Ch等3株NDV U→C(T→C)的突变位于发卡环上,不影响二级结构的形成,发卡环的RNA序列突变为3’-UCUC-5’,与基因组3’端发卡环的3’-UCUUA-5’相似,推测可能影响了基因组RNA的复制速度。