一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

目的评价一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的可应用性,为流感病毒核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用离心柱法、磁珠法和快速法核酸提取试剂对流感病毒MDCK细胞株的不同稀释度标本以及20份阳性咽拭子标本进行核酸提取,然后进行实时荧光PCR检测,用SPSS 21.0软件对结果进行统计分析,评价核酸快速提取方法的RNA提取效率。结果快速核酸提取试剂对不同稀释度的流感病毒细胞株提取效率要高于离心柱法和磁珠法,Ct值与离心柱法的差值中位数为-1.51(-1.18～-2.01),与磁珠法的差值中位数为-1.09(-0.83～-1.31),咽拭子标本检测结果也显示出快速法核酸提取试剂核酸提取效率高于离心柱法和磁珠法。3种检测方法检出率和重复性差异无统计学意义。结论快速提取试剂具有操作简单、时间短、对设备要求不高等优势,并且核酸提取效率优于离心柱法和磁珠法,提示快速提取试剂可以应用于流感病毒的核酸检测。

一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的应用评价

目的探讨一种快速核酸提取试剂在流感病毒检测中的适用性及有效性。方法选取流感病毒H3亚型、乙型Yamagata系细胞株和甲型H1N1型鸡胚株各1株,对其倍比稀释液及2015年北京市流感病原学监测阳性的67份咽拭子样本,同时采用快速提取法及离心柱提取法提取病毒核酸,经实时荧光PCR法进行定性、定量检测,检测结果采用SPSS19.0软件进行统计分析。结果快速提取法提取细胞培养液、鸡胚培养液中流感病毒核酸的最低检测限高于离心柱法10倍,咽拭子样本则高100倍;快速提取法提取核酸后检测到的病毒载量均低于离心柱法,其中对含有病毒量较高的毒株检测到的病毒载量低于离心柱法10倍,而对病毒量较少的咽拭子样本,则低100倍;快速提取法稳定性优于离心柱法;提取后的核酸-80℃保存10 d后冻融复测,快速提取法核酸损失量大于离心柱法。67份离心柱提取法检测阳性咽拭子样本使用快速提取法提取核酸后检测,两种方法阳性符合率总计为92.54%,其中10~102拷贝/ml组,阳性符合率为76.92%,102~103拷贝/ml组,阳性符合率为92.59%,〉103拷贝/ml组,阳性符合率为100%。结论快速提取法具有稳定性高、易于操作、不易污染的优势,适用于细胞培养液、鸡胚培养液等病毒含量较高的大量样本中流感病毒核酸提取,适于检测样本量大、人手不足、设备欠缺的基层实验室使用;但-80℃冻融后核酸损失量较大,不宜反复冻融后使用;传统的离心柱法对于病毒含量较少的咽拭子样本及核酸需被反复冻融使用时具有优势。

基于磁珠的核酸快速提取和纯化

采用纳米磁珠法对细菌基因组DNA、总RNA和质粒DNA进行提取纯化,并与试剂盒法和Trizol法提取效果进行比较,以期获得核酸最佳提取方法。结果发现,与试剂盒法和Trizol法相比,磁珠法在细菌基因组DNA和RNA提取、PCR产物检测及纯化中效率更高;而在PCR产物回收和质粒DNA的提取中,效率低于试剂盒法,质粒酶切效果与试剂盒法无差异。结果表明,纳米磁珠法相比试剂盒法和Trizol法在核酸提取纯化效果上更佳。

不同的核酸提取方法在布鲁氏菌检测中的应用评价

目的比较不同核酸提取方法对布鲁氏菌检出率的影响,为布鲁氏菌核酸快速提取检测提供技术参考。方法分别使用磁珠法、直接裂解法和高温裂解法对感染布鲁氏菌患者的20例全血样本、10例关节腔及浆膜腔积液样本进行核酸提取,然后进行实时荧光RT-PCR检测,采用SPSS 22.0对结果进行统计分析,评价该核酸快速提取试剂的DNA提取效率。结果磁珠法阳性检出率为100%,Ct值中位数为29.17(21.19~31.33),批内变异系数(CV)最高为1.33%。直接裂解法阳性检出率为63.33%,Ct值中位数为33.29(28.69~34.54),批内CV最高为1.28%。高温裂解法阳性检出率为100%,Ct值中位数为30.26(26.63~33.85),批内CV最高为1.21%。高温裂解法和磁珠法检出率比较差异无统计学意义(P>0.05),直接裂解法检出率显著低于磁珠法和高温裂解法(P<0.05)。结论核酸快速提取试剂在高温裂解条件下可保证核酸提取效率和重复性稳定,具有操作简单、检测时间短、降低实验室生物安全风险等优势,可以应用于布鲁氏菌的核酸检测。

重金属复合污染农田土壤DNA的快速提取及其PCR-DGGE分析

国内首次运用FastPrep○R 核酸快速提取系统提取了重金属复合污染农田土壤的DNA ,并对其进行了聚合酶链反应—变性梯度凝胶电泳 (PCR DGGE)分析。结果表明 ,FastPrep○R核酸提取仪与相应的FastD NASPINKitforSoil试剂盒联用时 ,能有效地分离到纯度较高的重金属污染农田土壤的DNA。PCR DGGE电泳图谱表明 ,PCR产物经DGGE检测后得到的电泳条带清晰且分离效果好 ,可以明显反映出重金属复合污染导致了农田土壤微生物在基因上的损伤 ,影响到农田土壤生态系统的细菌丰富度 ,改变了土壤环境的优势菌群 ,从而使农田土壤微生物群落结构多样性发生变化。可见 ,FastPrep○R核酸提取系统同样适用于重金属污染农田土壤环境中微生物基因组DNA的快速分离和纯化 ,得到的DNA可直接用于PCR DGGE分析。

一种快速有效提取植物和真菌DNA和RNA的简易方法

本文利用一种真菌核酸的快速提取方法提取了3种真菌的DNA和RNA,并将该法略作改进用于烟草DNA和RNA的提取。同时,通过低温保藏试验评价核酸提取液和提取产物的稳定性和有效性;利用凝胶电泳、PCR和RT-PCR等方法比较分析核酸质量;并将提取效果与传统方法或试剂盒的提取效果进行比较,以分析其有效性。结果表明,改进后的提取方法是一种简单、方便和有效的实验方法,不仅可用于真菌也可用于植物DNA和RNA提取,用这种方法提取得到的DNA和RNA在低温保存条件下比较稳定,能较长时间保持其原有活性。

2种核酸快提取法对羊口疮病毒和羊痘病毒DNA提取效能的比对研究

目的合理选择病毒快速核酸提取方法。方法分别采用2种商品化核酸快提取法——Cell-to-cDNA裂解液(A法)和基于磁珠核酸提取方法(InnuPREP MP Basic Kit A,B法),提取羊临床样品中的羊口疮病毒(ORFV)和羊痘病毒(CaPV)核酸,使用实时荧光定量核酸扩增检测系统(qPCR)和重组酶聚合酶扩增结合侧流层析技术(RPA-LFD)方法进行平行检测,并与常规核酸提取方法(宝生物病毒DNA/RNA提取试剂盒,C法)比较。结果与C法相比,在A法和B法提取的46份疑似orf拭子中,qPCR的ORFV核酸检出率分别为70.8%和87.5%,RPA-LFD的检出率分别为69.5%和82.6%;在A法和B法提取的52份疑似CaP的拭子样品中,qPCR的CaPV核酸检出率分别为77%和90%,RPA-LFD的检出率分别为65.5%和89.7%。对组织样品分析发现:A法不能用于组织样品的核酸提取;在B法提取的52份疑似orf组织样品核酸中,与C法相比,qPCR的ORFV核酸检出率为93.7%,RPA-LFD的检出率93.3%;对B法提取的61份疑似CaP组织样品核酸中,qPCR的CaPV核酸检出率为94.5%,RPA-LFD的检出率为88.7%。结论磁珠核酸提取方法(B法)可适用于不同样品中的ORFV和CaPV核酸的快速提取。

鲤疱疹病毒Ⅱ型的核酸恒温扩增微流控快速检测芯片的建立

鲤疱疹病毒Ⅱ型(Cyprinid herpesvirus 2,CyHV-2)主要感染锦鲤、鲫鱼及其变种,导致造血器官坏死,其致死率高,给养殖业造成了巨大损失。为建立一种快速、灵敏、准确的CyHV-2检测方法,可于大规模暴发之前进行疫情的早期诊断和及时防控,对CyHV-2建立了一种集核酸快速提取方法、竞争性互补介导核酸恒温扩增(competitive annealing mediated isothermal amplification,CAMP)与微流控芯片(microfluidic chip)于一体的检测方法。以CyHV-2基因保守区域片段为靶序列设计特异性引物,通过条件优化建立了一种基于CAMP技术的CyHV-2可视化检测方法,并且对该方法进行了特异性、灵敏性及临床样本的检测进行评估。结果表明:所建立CAMP方法的灵敏度最低检测限为10拷贝;对与其基因型有较高相似性的鲤疱疹病毒Ⅲ型(Cyprinid herpesvirus3,CyHV-3)无非特异性扩增,特异性良好;用本方法对89批次的临床样本进行检测,显示灵敏度及特异性均为100%。核酸快速提取的方法能够较快获得纯度较高的核酸,缩短了核酸提取时间,且极大节约了检测成本,具有操作简单、样本用量少等特点,且经核酸快速提取方法处理的病鱼组织样本能够满足CAMP现场检测的要求。此外,将针对CyHV-2所建立的CAMP可视化检测方法结合微流控芯片,可实现多目标病原的高通量、多指标筛查,将极大提高检测效率。本试验对鲤疱疹病毒Ⅱ型所建立的核酸快速提取、CAMP检测及微流控芯片的方法可在70min内实现对该病毒的现场快速检测及诊断,极大地提高了对CyHV-2疫病的早期防控能力,将为CyHV-2的快速检测及疫情早期预警提供参考。所建立的方法亦可应用于其他经济水生生物病原的现场快速检测及后续防控。