一种新型H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂的建立

利用5株广谱特异性抗H5亚型血凝素单克隆抗体和酶联免疫渗滤技术成功地建立了一种适于现场检测H5亚型禽流感病毒血凝素蛋白的抗原快速检测试剂H5-HA(Ag)Dot-ELISA。该试剂对41株代表当前亚洲地区流行的各种遗传变异亚系H5N1禽流感病毒检测均为阳性,对多数毒株的分析灵敏度优于0.1个血凝滴度(HA titer),其中部分优于0.01个血凝滴度;比较该试剂与早期开发的同类ELISA试剂,发现前者对后者未能检出的H5N1新变异株检测均为阳性;利用该试剂和商品化Directigen Flu A(BD)试剂检测两株H5N1病毒株,提示前者灵敏度高于后者;该试剂对一株H5N1病毒的检测灵敏度与标准RT-PCR相当;该试剂对24株非H5亚型病毒检测均为阴性,显示出良好特异性。以上结果提示,此研究建立的H5N1病毒抗原快速检测试剂在H5禽流感现场检测上具有较好的应用前景。

H5N1禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂对不同现场标本的检测比较

利用H5亚型禽流感病毒血凝素抗原快速检测试剂“H5-HA（Ag）Dot-ELISA（H5-Dot）”对来自陆禽、水禽的484份气管拭子、泄殖腔拭子和粪便拭子标本进行检测，结果：①不同采集方式的H5N1阳性标本的检出率高低有别，气管拭子的检出率最高，泄殖腔拭子次之，粪便拭子最低（P〈0．05），因此建议现场采样时应尽可能采集气管拭子标本；②陆禽标本检出率显著高于水禽标本（P〈0．05），对病毒培养阳性的陆禽气管拭子检出率达80％（95％CI：70．6％～87．8％），对水禽气管拭子标本的检出率为38％（95％CI：26．9％～49．4％），可能与标本中病毒滴度高低有关；③有症状与无症状陆禽标本的检出率无显著差异。另外，H5-Dot试剂对333份非H5病毒气管拭子标本的特异性为99．4％（95％CI：97．9％～99．9％）。这些结果表明，H5-Dot是一种较为可靠的H5亚型禽流感病毒早期快速检测方法，在缺乏仪器设施和高素质专业技术人员的H5N1禽流感病毒防控第一线具有重要推广价值。

H5N1型禽流感病毒广谱中和单克隆抗体的筛选及其中和机制初步研究

利用杆状病毒-昆虫细胞表达H5N1型禽流感病毒的血凝素蛋白(HA),纯化后的重组蛋白HA免疫小鼠并制备杂交瘤单克隆抗体,用H5N1型禽流感病毒的全病毒进行筛选,成功地获得了抗H5N1型禽流感病毒血凝素蛋白HA的单抗.MDCK细胞微量中和试验表明,单抗8G10D7可对clade2和clade9的H5N1型禽流感病毒起中和作用.Western-blot及血凝抑制实验进一步证明了该单抗的结合位点位于HA蛋白的HA1亚基上.鸡胚感染病毒预防试验结果表明,8G10D7对禽来源的和人来源的H5N1型禽流感病毒均可达到100%的保护率;在治疗试验组中,8G10D7对禽来源的病毒感染具有较高的保护率,可达100%,对人来源的H5N1型禽流感病毒最高也可达87.5%的保护率.该抗体的获得不仅为H5N1型高致病性禽流感病毒的预防和治疗带来了希望,同时其中和位点的发现也为以后亚单位疫苗的研制提供新的思路.

H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及其应用

采用活病毒免疫,常规杂交瘤融合的方法,获得了4株针对H5N1亚型禽流感病毒(AIV)A/duck/Shandong/093/2004(A/D/SD/04)株血凝素(HA)的单克隆抗体A8E8、D2F8、A8C8和C3G4。其中A8E8可以与11株不同来源的H5N1AIV发生交叉免疫抑制性反应(HI),具有广谱性。采用间接免疫荧光试验(IFA),用A8E8单克隆抗体测定A/D/SD/04株对COS1和MDCK2种细胞的半数感染量(TCID50),结果显示,A/D/SD/04株在COS1上的TCID50为10-5.33/0.1mL,在MDCK上的为10-7.33/0.1mL。将编码A/D/SD/04株的HA基因质粒与PR8质粒共转染COS1细胞后,用A8E8进行IFA,能观察到特异性绿色荧光,这与鸡胚接种结果相符。表明,用此单克隆抗体能准确地检测到H5重组病毒。

抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的制备及鉴定

目的建立稳定分泌抗H5N1亚型禽流感病毒血凝素单克隆抗体的杂交瘤细胞系,为进一步研究禽流感诊断技术奠定基础。方法以纯化的H5亚型禽流感病毒按常规方法免疫BALBc小鼠,最后一次免疫后第3天取其脾细胞与SP20细胞在聚乙二醇作用下融合,用选择性培养、有限稀释法克隆和血凝抑制试验进行筛选,对获得阳性克隆株用ELISA方法进行亚型鉴定,并用37株H5、H7、H9亚型AIV测定其特异性、覆盖性。结果最后获得了3株分泌特异性抗体的杂交瘤细胞,命名为1E5、4A4、4B1,经长期体外培养和冻存后复苏能稳定地分泌抗体。经鉴定,其亚型均为IgG1、kappa链。腹水HI效价1∶210～1∶216,细胞培养上清HI效价1∶26～1∶28。3株杂交瘤所分泌的单克隆抗体均能与本中心保存的全部20株H5亚型禽流感病毒分离株发生反应,而与15株H9亚型禽流感病毒分离株、2株H7亚型禽流感病毒分离株以及H1H4、H6H15亚型禽流感病毒标准毒株均不反应,与鸡新城疫病毒、鹅新城疫病毒、鹅腺病毒和鸡产蛋下降综合征病毒等均无交叉反应。结论所获3株单克隆抗体可用于禽流感病毒特异性诊断试剂的研制。

H5N1亚型禽流感病毒NA和NS1蛋白原核表达及多克隆抗体制备

为了获得检测禽流感病毒神经氨酸酶(NA)蛋白和非结构蛋白(NS1)的抗体,试验采用扩增NA、NA+、NS1和NS1+基因,连接原核表达载体p ET-32a进行原核表达,蛋白纯化后免疫Balb/c小鼠,获得NA、NA+、NS1和NS1+的多克隆抗体血清。结果表明:NA、NA+、NS1和NS1+多克隆抗体血清反应性良好,可以检测NA和NS1自身蛋白,且NA和NA+及NS1和NS1+多克隆抗体血清之间均具有良好的交叉反应。说明基因部分缺失对整个NA蛋白和NS1蛋白的抗原性影响不大。

抗禽流感病毒H5N1亚型单克隆抗体制备初报

目的制备禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体,为相关研究提供工具。方法以禽流感H5N1亚型病毒免疫BALBc小鼠,取其脾细胞和SP20细胞融合,用血凝抑制试验(HI)和酶联免疫反应(ELISA)检测培养上清,并将阳性融合细胞稀释克隆化3次直至100%孔均为阳性,筛选阳性克隆株,运用免疫荧光法评估单克隆抗体检测病毒感染的犬肾细胞(MDCK)。结果得到三株稳定分泌抗体的细胞并命名为F8、F9、G11,抗体亚型鉴定结果分别为IgG1、IgG2a和IgG2b;在免疫荧光法单克隆抗体能够检测出感染MDCK细胞的病毒。结论建立了3株抗禽流感H5N1亚型病毒的单克隆抗体细胞株,其产生的一株高特异性的McAbG11能够用于H5N1亚型禽流感病毒感染诊断,并可能应用于禽流感病毒H5N1亚型感染的防治。

麻花鸡不同剂量禽流感H5N1亚型灭活疫苗免疫抗体水平对比试验

近些年来．我国对禽流感实施高密度的免疫接种．通过疫苗免疫可使鸡群得到有效的保护．对控制疫情起了显著的作用．并广泛使用。然而，在疫苗的具体使用过程中存在免疫后抗体效价参差不齐、离散度较大。不能使鸡群得到有效的免疫保护．为此．我们乌昌地区的麻花鸡使用禽流感H5N1亚型灭活疫苗进行不同剂量的免疫抗体水平测定对比试验．初步掌握了免疫剂量与免疫抗体的消长规律．为制定本地合理的免疫方案提供科学依据。

重组禽流感病毒灭活疫苗(H5N1亚型,Re-1株)免疫鸡抗体消长规律及免疫程序的初步研究

研究新型重组H5N1亚型禽流感灭活疫苗对种鸡和肉鸡的免疫原性,并对雏鸡母源抗体和免疫后的抗体进行动态观察,根据试验结果推荐该疫苗对鸡的免疫程序。用HI方法检测种鸡、肉鸡的母源抗体和免疫抗体,根据母源抗体的衰减和免疫抗体的消长规律确定首免和再免日龄。结果表明种鸡的母源抗体约能维持10 d多;0.3 mL/羽首免后10 d HI抗体就可达到6.40 log2,3-5周达到高峰期,至免疫17周后(19周龄)HI抗体水平仍然维持在4.88 log2;19周龄时0.5 mL/羽进行二免,有效抗体能维持约20周;280日龄0.5 mL/羽三免后抗体水平均一,下降缓慢,至种鸡淘汰时(三免后29周)抗体水平仍能维持在5.32 log2。肉鸡母源抗体约能维持7d,10日龄时0.3 mL/羽免疫,有效抗体能维持到上市。新型重组H5N1亚型禽流感灭活疫苗对鸡的免疫原性确实。

利用假病毒技术筛选H5N1亚型禽流感病毒中和活性单克隆抗体

为筛选H5N1禽流感病毒(AIV)血凝素蛋白(HA)特异性中和抗体,本研究构建了表达HA蛋白的重组质粒,利用该重组质粒及缺失表达人免疫缺陷病病毒1型(HIV-1)囊膜蛋白基因的骨架质粒,构建了表面整合有H5亚型AIV HA蛋白的HIV假病毒。利用该假病毒系统,筛选得到一株具有中和活性的单克隆抗体(MAb)。经测定,该MAb与纯化的全病毒具有较好的反应性,其对HIV-H5HA假病毒的中和效价为64。中和试验表明该MAb能够有效阻断野生型病毒对鸡胚的感染。本研究结果为开发H5N1 AIV的被动免疫治疗方法奠定了基础,同时对亚单位疫苗的研制也具有一定的意义。

H5N1亚型禽流感灭活疫苗免疫鸵鸟后抗体消长规律及免疫程序的研究

为了探讨鸵鸟对H5亚型禽流感灭活疫苗的免疫原性,做好鸵鸟禽流感的防控工作,采用哈尔滨兽医研究所研制的重组H5N1亚型禽流感疫苗,不同剂量免疫鸵鸟,用HI方法检测母源抗体和免疫抗体,根据母源抗体的衰减和免疫抗体的消长规律确定首免和再免日龄。结果表明,雏鸵鸟母源抗体能维持约3周～8周;8周龄时分组首免,C1组产生的免疫反应优于C2组,抗体峰值能达到7.50log2,维持时间为9周左右;17周龄时C1组以3.0mL/羽进行二免,2周后抗体达到7.40log2,3周～7周抗体维持在高峰值,最高达8.80log2,以后逐渐下降,有效抗体水平能维持至接种后25周左右。二免后25周进行三免,以5mL/羽三免后2周抗体可达到9.80log2,2周～4周抗体维持在最高峰,以后缓慢下降,期间抗体时有起伏,但有效抗体水平约可维持1年时间。三免后45周内抗体水平合格率均在70%以上。根据抗体消长规律,初步推荐了鸵鸟的免疫程序。

几种圈养珍稀雉鸡H5N1禽流感疫苗免疫后抗体水平研究

家禽对禽流感疫苗免疫效果的研究多有报道,但现有的禽流感疫苗对野生禽类的有效性尚所知甚少。本文以白冠长尾雉、蓝鹇、红腹锦鸡、白腹锦鸡4组野生雉鸡类为研究对象,以家鸡为对照,进行禽流感H5N1亚型疫苗免疫。利用血凝(HA)及血凝抑制(HI)实验,分别在首免日、免后10 d、20 d、40 d、60 d、90 d及120 d监测禽类免疫后抗体水平变化。结果显示,4组野生雉鸡类均在疫苗接种后产生禽流感抗体,且达到具保护力的抗体水平。通过免疫后抗体水平的跟踪研究,证明商品化禽流感疫苗对野生雉鸡类动物有效。

H5N1禽流感病毒核酸多重RT-PCR检测方法的建立

根据禽流感病毒的基质蛋白(M)基因序列和H5亚型禽流感病毒血凝素(HA)基因、神经氨酸酶(NA)基因设计并合成了三对特异性引物,用于建立H5N1禽流感病毒核酸的RT-PCR分型鉴定方法。试验证明,建立的多重PCR方法可以将H5N1与H6N2、H9N2有效区分。该方法具有较好的灵敏度和特异性,适合在基层动物防疫和监督部门进行H5N1禽流感病毒核酸的检测。

美批准使用H5N1型禽流感病毒快速检测技术

美国食品和药物管理局2009—04—07批准使用一种H5N1型禽流感病毒快速检测技术，用这种技术可以在40min内检测出人是否感染了H5N1型禽流感病毒。

美批准使用H5N1型禽流感病毒快速检测技术

美国食品和药物管理局2009年4月7日批准使用一种H5N1型禽流感病毒快速检测技术，用这种技术可以在40min内检测出人是否感染了H5N1型禽流感病毒。美药管局当天发表新闻公报说，这一技术由加利福尼亚州一家公司开发，其原理是通过判断被检测者体内是否存在NS1蛋白质来确认其是否感染H5N1型禽流感病毒。美药管局医疗设备和放射卫生管理中心主任丹尼尔·舒茨在公报中说，这种技术有助于保护广大公众免受禽流感威胁。

美批准使用H5N1型禽流感病毒快速检测技术

美国食品和药物管理局（FDA）4月7日批准使用一种H5N1型禽流感病毒快速检测技术，用这种技术可以在40min内检测出入是否感染了H5N1型禽流感病毒。FDA当天发表新闻公报说，这一技术由加利福尼亚州一家公司开发，其原理是通过判断被检测者体内是否存在NS1蛋白质来确认其是否感染H5N1型禽流感病毒。FDA医疗设备和放射卫生管理中心主任丹尼尔·舒茨在公报中说，这种技术有助于保护广大公众免受禽流感威胁。