任意数量离散不规则感兴趣区域的快速荧光寿命显微成像

荧光寿命显微成像(fluorescence lifetime imaging microscopy,FLIM)技术在细胞微环境传感中具有特异性强、灵敏度高、可定量的优点,被广泛应用于生物医学研究.其中,基于时间相关单光子计数(time-correlated single photon counting,TCSPC)进行荧光寿命探测的方法是目前最常用的技术之一,但受成像原理和条件限制,该技术存在数据采集时间较长、成像速度不够快的不足.本文开发一种能对生物样品中任意数量离散的、形状不规则的感兴趣区域(region of interest,ROI)进行快速FLIM成像的技术.该技术利用声光偏转器(acousto-optic deflector,AOD)实现快速灵活的寻址扫描,并通过对ROI形状特征的简单在线分析,实现AOD与TCSPC同步策略的优化及寿命图像的准确重构,对于生物样品中常见的存在多个离散不规则ROI情形,可大幅节省数据采集时间,从而实现对这些ROI的快速FLIM成像.采用该技术,对氯化铵刺激下活细胞中溶酶体探针LysoSensor Green DND-189的荧光寿命变化进行了动态FLIM成像,以监测溶酶体管腔内pH值的实时变化情况.结果表明,该快速FLIM技术可用于动态监测生物样品中微环境的变化,将在活细胞微环境传感中发挥重要作用.

快速荧光寿命显微成像技术及其在活体应用的研究进展(特邀)

荧光寿命显微成像(FLIM)已经广泛应用于生命科学研究领域,具有高灵敏和高特异性的特点,在对组织微环境进行定量表征方面具有独特优势,但由于成像速度相对较慢,限制了FLIM的活体应用。近年来,随着光电子器件和人工智能等技术的发展,开启了FLIM活体成像新篇章。介绍通过优化硬件和算法两方面提升时域和频域FLIM技术的成像速度,以及其在生物医学基础研究和临床疾病诊断中的应用研究进展。最后,对活体FLIM成像的未来发展进行展望。

活细胞应激反应过程中线粒体和核仁微环境动力学的荧光寿命成像研究

核仁和线粒体在维持细胞平衡发挥重要作用,研究其生理过程有助于深入了解生物学功能.本文采用一种红色荧光的芘罗丹明荧光探针在不同条件下靶向标记细胞线粒体和核仁.通过激光共聚焦成像和荧光寿命成像技术分析HeLa细胞在光照和药物刺激下细胞凋亡的形态变化,并利用相图定量分析了线粒体与核仁的微环境变化,确定在稳态HeLa细胞中探针标记到的线粒体的平均荧光寿命约为3.65 ns,线粒体黏度约为66×10^(-3)Pa·s.在激光光照后,探针标记到HeLa细胞线粒体的荧光寿命降至3.61 ns,对应线粒体黏度增至约131×10^(-3)Pa·s;使用紫杉醇和秋水仙碱诱导细胞凋亡,观察到探针标记于HeLa细胞核仁的荧光寿命先增加后降低,反映了在HeLa细胞凋亡过程中核仁微环境的变化,证明HeLa细胞在非稳态情况下核仁和线粒体的功能变化,为线粒体和核仁功能障碍相关疾病研究提供了新的研究方法.

基于ICCD的快速荧光显微成像技术及在活细胞研究中的初步应用

利用像增强型CCD、氩离子激光器和氙灯等建立了一套快速荧光显微成像系统,并初步应用于活细胞研究。实时观测和拍摄了大鼠脑微血管内皮细胞增殖分裂过程中细胞内钙敏感荧光探针Fluo-3标记的钙离子浓度分布快速变化的图像,并选取动态图像中四个典型的点给出荧光强度灰度值的变化曲线。该系统可用于高灵敏实时记录活细胞内基于荧光显微成像的快速变化过程,为活细胞的研究提供了一种很好的观察和分析手段。

二组分荧光寿命成像显微术的研究

用ＭｏｎｔｅＣａｒｌｏ方法研究了激发光的调制频率、ＣＣＤ所记录到的光强度、荧光寿命的大小以及权值对二组分荧光寿命成像显微术的频域外差法测量及数据处理精度的影响，提出了改进测量精度的方法，如选择合适的调制频率和染料，使调制频率ω和荧光寿命τ满足（１４）和（１５）式；增大ＣＣＤ的积分时间等。

云南晾晒烟中小分子的荧光光谱及显微成像

为提高晾晒烟中化学成分的研究利用,进一步拓展烟草资源的用途,以云南地方晾晒烟为研究对象,分离得到2个荧光小分子化合物2-甲基喹啉(QND)和3-羧酸吲哚(YD),对其进行了光谱分析和药理学毒性与成像分析. 2个荧光小分子均显示出较高的荧光量子产率,在一定范围的p H条件下,对环境p H的变化表现出良好的响应,且呈现互补特征.细胞实验结果表明,实验条件下两个小分子细胞毒性较低,细胞成像结果均呈现出较好的荧光成像能力,具有在生物领域应用的可行性,为晾晒烟资源的综合应用以及探究烟草的新用途新用法展示出良好的应用前景.

基于点扫描的高时空分辨荧光显微成像技术进展

激光点扫描荧光显微镜凭借高分辨率、高灵敏度、高特异性、可光学层切三维成像和动态成像等优势,已成为生命科学研究中广泛应用的重要工具.随着研究者对生命科学研究的逐渐深入,由于受光学衍射极限影响和逐点扫描探测的限制,传统点扫描共聚焦显微镜的时空分辨率已无法完全满足相关研究需求,在实际应用中面临诸多挑战.近二十年来,超分辨荧光显微成像技术取得了重要进展,研究人员发展了多种高空间分辨率、高时间分辨率的点扫描荧光显微成像技术,对于生物成像等具有重要意义.然而,有关该领域最新进展的综述论文较少,系统地讨论、总结基于点扫描的高时空分辨荧光显微成像技术的研究进展,对于其未来研究发展极为重要.本文主要从时间分辨率与空间分辨率两个维度分别介绍了各类点扫描荧光显微成像技术的基本原理及相关进展,并介绍了高时空分辨显微成像技术及应用,最后讨论展望了高时空分辨点扫描荧光显微镜的未来发展趋势和挑战.

荧光寿命显微成像技术及应用的最新研究进展

由于荧光寿命不受探针浓度、激发光强度和光漂白效应等因素影响,荧光寿命显微成像技术(fluorescence lifetime imaging microscopy, FLIM)在监测微环境变化、反映分子间相互作用方面具有高特异性、高灵敏度、可定量测量等优点,近年来已被广泛应用于生物医学等领域.然而,尽管FLIM的发明和发展已历经数十年时间,其在实际应用中仍然面临着许多挑战.例如,其成像分辨率受衍射极限限制,而其成像速度与成像质量和寿命测量精度则存在相互制约的关系.近几年来,相关硬件和软件的快速发展及其与其他光学技术的结合,极大地推动了FLIM技术及其应用的新发展.本文简要介绍了基于时域和频域的不同寿命探测方法的FLIM技术的基本原理及特点,在此基础上概述了该技术的最新研究进展,包括其成像性能的提升和在生物医学应用中的研究现状,详细阐述了近几年来研究者们通过硬件和软件算法的改进以及与自适应光学、超分辨成像技术等新型光学技术的结合来提升FLIM的成像速度、寿命测量精度、成像质量和空间分辨率等方面所做的努力,以及FLIM在生物医学基础研究、疾病诊断与治疗、纳米材料的生物医学研究等方面的应用,最后对其未来发展趋势进行了展望.

快速三维荧光显微成像技术的研究进展(特邀)

荧光显微成像具有高分辨率、高灵敏度、高分子特异性以及非介入性的优点,可以在微米乃至纳米尺度下表征样本的形态学与分子功能学信息,成为了生命科学研究的重要工具。随着微观生物学研究的不断深入,荧光显微成像被期待能够动态且立体地观测微观生物结构与分子事件。文中系统性地梳理了近年来快速三维荧光显微成像技术的研究进展,包括点扫描式成像、宽场成像与投影断层成像在提高成像速度、拓展成像维度以及增强成像质量等方面的主要技术手段、改进策略与代表性研究成果,并展望了快速三维荧光显微成像技术的未来挑战与发展前景。

荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在生命科学研究中的应用进展

细胞是动植物结构和生命活动的基本单位。细胞过程的一个重要特点就是其生化组分在时空调控上的相互作用关系。然而,利用传统的生化方法(如酵母双杂交系统、pull-down系统等)很难在空间上评估活细胞内分子间的相互作用。光学技术的快速发展,为研究活细胞中生物分子的时空动态提供了新的遗传研究工具,其中荧光共振能量转移-荧光寿命显微成像(FRET-FLIM)技术在实时探测分析活细胞中生物大分子构象变化和分子间动态相互作用过程具有独特的优势,如:实现对活细胞的实时“可视化”研究,同时具有高时空分辨率;检测更加灵敏、结果可信度高;且基于简易的数学运算完成简单快捷的分析程序。介绍FRET-FLIM技术的理论背景知识,对比了该技术与传统蛋白相互作用技术研究的利弊,同时归纳了其在蛋白相互作用、细胞生物学和疾病诊断等方面的最新应用研究进展,最后总结和讨论了FRET-FLIM技术的未来发展趋势,以期能够为揭示活细胞的结构和细胞过程相关研究提供新的见解。

含油岩心显微荧光成像光谱研究

发展了一种显微荧光光谱成像技术,并将其应用于天然岩心进行显微荧光成像光谱研究。利用这种技术同时采集含油岩心表面的荧光光谱信息和空间信息,并对获得的光谱图像给予光谱学和地质学解释。结果表明,不但能显示岩心形貌和组分的大致趋势,而且能揭示其精细细节,为石油地质研究提供了一种新方法,为今后的石油勘探开发工作提供了一种先进的指导手段。

显微荧光光谱成像仪的研究与设计

将光谱分析技术快速、灵敏、准确等独特的优点,与光学成像技术的定位记录特点融合、构成光谱成像技术,可以提供分析试样中各种化学或生化成份的分布图像,因而可以获得定性、定量和定位综合、更丰富的分析信息。报导在商售落射荧光显微镜基础上,实现显微镜荧光光谱成像技术的理论基础、系统组成、设计技术关键等一系列研究工作,设计研制成了可在250~680nm波长范围内自动扫描的光纤激发显微荧光光谱成像仪样机,并获得了满意的实验结果。

荧光寿命成象显微技术及其应用

本文综述了荧光寿命成象显微技术的概念、原理及实现方法，介绍了荧光寿命成象显微技术在生物物理、生物化学及临床医学诊断等领域的最新研究成果和发展现状，并就其未来的发展及应用研究进行了讨论．

自适应光学技术在深层动态荧光显微成像中的应用和发展

荧光显微成像技术是开展微观生命科学研究的重要手段和工具,使用该技术可以观察生物体内的精细结构、动态追踪生物体内组织、细胞、细胞核、蛋白、小分子等不同尺度的生命活动过程。其中,研究深层组织高时空分辨率荧光显微成像技术,是当前成像领域一个前沿问题。应用自适应光学技术实时补偿经由不透明散射、非均匀生物组织传播而引入的复杂波前畸变已被证实是实现上述技术的一种有效途径。文中首先归纳了深层动态荧光显微成像的需求和特点,随后分别介绍了自适应光学技术近几年在共聚焦显微成像、随机光学重构显微成像、光激活定位显微成像、受激辐射光淬灭显微成像、双光子/多光子激发显微成像中的相关应用,并对今后的研究问题和发展方向提出展望。

两种荧光显微成像系统采集细胞器探针荧光图像的对比研究

目的 :应用荧光显微数码成像系统和共聚焦荧光显微成像系统采集细胞器探针图像的对比研究。方法 :传代培养内皮细胞 ,将四种细胞器探针与细胞共同孵育不同时间。采用荧光显微镜、计算机及高分辨率数码CCD组成的荧光显微数码成像系统采集四种细胞器探针的荧光图像。同时应用激光共聚焦显微镜采集图像进行对比。结果 :两种系统均可采集到细胞器荧光探针的图像 ;荧光显微数码成像系统采集的图像的特点为分辨率高 ,速度快 ,对细胞器的损伤小。结论 :荧光显微数码成像系统在细胞器探针的荧光检测定位研究中准确可靠。

单组分荧光寿命成象显微的研究

激发光的调制频率和CCD所记录到的光强度是影响荧光寿命成象显微频域法测量和数据处理精度的主要因素．本文采用MonteCarlo方法，以单组分问题为例，研究了在用频域外差法进行荧光寿命成象显微测量中激发光的调制频率以及CCD所记录到的光强度对数据处理精度的影响，给出了当调制频率不变时，在不同荧光强度下，对于不同的荧光寿命范围、荧光寿命计算的统计结果，给出了改进测量精度的方法．

三套荧光显微成像系统在光敏剂亚细胞定位研究中的应用比较

目的:对三套荧光显微成像系统在国产新型光敏剂HMME亚细胞定位研究中的应用特点及适用范围进行了比较与评价。方法:分别应用LSCM、CCD、ICCD荧光显微成像系统,选择特异性细胞器荧光探针Rhodamine 123、DIOC6(3)标记细胞内线粒体和内质网。采用细胞器-细胞荧光强度比值法,对HMME进行单细胞内分布的定性与定量研究。结果:LSCM和CCD成像系统能采集到浓度达到160μg ml时的HMME的荧光图像,获得荧光探针图像信息显示所标记的细胞内线粒体和内质网平均荧光强度比值(J1 J2值)都明显高于细胞内J1 J2值。而ICCD成像系统只需HMME浓度为5μg ml,荧光图像特点都呈胞浆中荧光强度较高且分布不均,细胞核区荧光较弱的中空现象。ICCD系统对细胞器探针荧光图像在空间分辨上不理想。结论:LSCM与CCD成像系统限于其探测灵敏度,对于弱荧光性光敏剂,适用于其高孵育浓度条件下的亚细胞定位研究。二者获得的结果相一致:孵育24h,HMME在鼠肺内皮细胞线粒体和内质网有分布而几乎不进入细胞核。ICCD成像系统可不受孵育浓度条件的限制,实现光敏剂极微弱荧光的有效探测,但空间分辨率较低。

荧光显微成像技术应用于生物样品中氧氟沙星的检测

应用毛细流自组装成环荧光显微成像技术,建立了溴化十六烷基三甲胺(Cetyltrimethylammoniumbromide,CTMAB)-Al 3+-氧氟沙星(Ofloxacin,OFLX)三元荧光体系(CTMAB-Al 3+-OFLX)测定氧氟沙星的方法,并实测鸡灌喂氧氟沙星药片后血液中药物浓度、人体尿液中氧氟沙星浓度及蜂蜜、氧氟沙星片剂、滴眼液中氧氟沙星的含量,均得到满意结果。在pH9.50NH3-NH4Cl缓冲介质和聚乙烯醇-124存在下,溴化十六烷基三甲胺-Al 3+-氧氟沙星三元配合物在疏水性玻璃表面上受热挥发形成的自组装环直径为1.63mm,环线宽为50μm。当点样体积为0.20μL,氧氟沙星在3.30×10-13～1.65×10-12 mol.ring-1(0.60～2.98mg.L-1)范围内,荧光强度与药物浓度有良好的线性关系(r=0.999 2),检测限为4.10×10-15 mol.ring-1(7.41μg.L-1)。此法用于鸡灌胃氧氟沙星2h后血药中药物浓度的测定,回收率为96.4%～101.2%;检测了三名健康志愿者服用氧氟沙星片剂后尿液中氧氟沙星的浓度,发现服药后3h尿液中药物浓度最高,回收率在98.2%～106.1%。应用于三种蜂蜜中氧氟沙星残留量的测定,回收率为98.2%～106.1%,相对标准偏差小于2.3%;检测了氧氟沙星片剂、滴眼液中有效成分的含量,与标示量相近,回收率分别为93.5%～101.5%和95.8%～104.2%,RSD为3.5%和3.6%。

铝敏化依诺沙星荧光显微成像体系性质及其应用研究

应用毛细流自组装成环荧光显微成像技术,建立了铝敏化依诺沙星的测定方法,并实测了不同样品中依诺沙星的浓度。在NH3-NH4Cl缓冲介质(pH9.7)和聚乙烯醇(PVA-124)存在下,Al3+-ENX复合物液滴在疏水性玻璃表面上受热挥发形成直径约为1.63mm,环线宽约为50μm的自组装环。当点样体积为0.20μL,其线性范围1.00×10-13～5.00×10-13mol/ring(5.00×10-7～2.50×10-6mol/L),检出限为7.65×10-15mol/ring(3.83×10-8mol/L)。本方法用于葡萄糖酸依诺沙星注射液中依诺沙星含量和牛奶中依诺沙星残留量的检测,回收率分别为96.9%～107.0%和94.2%～102.5%,相对标准偏差(RSD)分别小于4.1%和2.4%。实测了健康志愿者服用依诺沙星胶囊后尿液中依诺沙星的平均浓度及兔子灌喂依诺沙星后血清中药物平均浓度,均得到了较满意的结果。