快速蛋白液相色谱系统纯化肺癌组织热休克蛋白70及其鉴定

目的:从肺癌组织中纯化并鉴定热休克蛋白70(HSP70),为研究其免疫原性和作为肿瘤疫苗奠定基础。方法:用组织蛋白裂解液从肺癌组织中提取总蛋白,应用ConA-sepharose亲和层析和快速蛋白液相色谱系统(FR-LC)连续分离、梯度洗脱获得蛋白,应用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳及Western-blot进行蛋白相对分子质量及免疫原性鉴定。结果与结论:所获蛋白的相对分子质量为70000,经Western-blot鉴定为HSP70。

快速蛋白液相色谱系统纯化和分析小鼠肝癌细胞热休克蛋白70的研究

目的 :应用快速蛋白液相色谱 (FRLC)系统建立分离和纯化 615系小鼠肝癌细胞系Hcaf细胞膜上热休克蛋白 (HSP70 )的分离方法。方法 :用经 4 3℃热处理 8h的Hcaf细胞制备裂解液 ,用ConA Sepharose 4B和MonoQ柱进行连续分离 ,所得蛋白经电泳及Western blot进行蛋白分子量及性质鉴定。结果 :纯化蛋白经鉴定为分子量70 0 0 0的HSP70。结论 :用此层析法经FRLP可分离纯度较高的HSP70。

快速蛋白液相色谱分离小麦高分子量谷蛋白亚基方法的研究

高分子量谷蛋白亚基作为小麦贮藏蛋白的重要组成部分,其组成和含量对小麦面粉的烘烤品质和加工品质有重要影响。本研究以普通小麦品种小偃22号为材料,采用快速蛋白液相色谱(Fast Protein Liq-uid Chromatograth,FPLC)凝胶过滤来分离高分子量谷蛋白亚基,并从样品浓度、洗脱液和流速3个方面进行了研究,发现将原样品稀释8倍、洗脱液为尿素、流速为0.3 ml/min时洗脱效果最好。

快速蛋白液相色谱法纯化威廉环毛蚓纤溶酶及其活性研究

摸索威廉环毛蚓纤溶酶的分离纯化工艺和研究蚯蚓纤溶酶 (earthwormfibrinolyticenzyme ,EFE)体内外的抗栓溶栓活性。通过提取 ,分步盐析 ,再经AKTAbasic蛋白快速液相色谱进一步纯化 ,得一组有纤溶活性的同工酶 ,其中一种比活较大达 2 0 0 0IU/mg。药理试验表明该酶有明显的抗拴溶栓活性。

天麻糖蛋白GGE2b的分离纯化及对急性血瘀大鼠血液流变的影响

目的:从天麻中分离纯化得到糖蛋白组分GGE2b,研究其对急性血瘀大鼠血液流变学指标的影响。方法:采用离子交换和快速蛋白液相层析色谱(FPLC)技术分离天麻水溶性提取物,得到组分GGE2b。采用皮下注射盐酸肾上腺素结合冷刺激的方法制造急性血瘀大鼠模型。观察GGE2b各剂量组对急性血瘀大鼠全血黏度、血浆黏度、红细胞压积、红细胞聚集指数和红细胞变形指数的影响。结果:离子交换结合FPLC技术分离纯化得到天麻糖蛋白组分GGE2b。GGE2b60、120mg/kg能够显著降低急性血瘀模型大鼠高切、中切的全血黏度(P<0.05或0.01)和血浆黏度(P<0.01),降低红细胞聚集指数(P<0.05或0.01),增大红细胞变形指数(P<0.05)。结论:层析技术用于天麻糖复和物的分离纯化是可行的,且得到的糖蛋白组分GGE2b对急性血瘀大鼠异常的血液流变有良好的治疗效果。

天麻糖蛋白的分离纯化及对急性血瘀大鼠血液流变的影响

目的:从天麻中分离纯化得到糖蛋白组分GGE2b,研究其对急性血瘀大鼠血液流变学指标的影响。方法:采用离子交换和快速蛋白液相层析色谱(FPLC)技术分离天麻水溶性提取物,得到组分GGE2b。采用皮下注射盐酸肾上腺素结合冷刺激的方法制造急性血瘀大鼠模型。60只雄性大鼠随机分成6组,每组10只:生理盐水组、模型组、GGE2b(30,60,120mg·kg-1)药物组、阳性药对照组(复方丹参注射液)。观察GGE2b各剂量组对急性血瘀大鼠全血粘度、血浆粘度、红细胞压积、红细胞聚集指数和红细胞变形指数的影响。结果:离子交换结合FPLC技术分离纯化得到了一个天麻糖蛋白组分GGE2b。GGE2b60,120mg·kg-1能够显著降低急性血瘀模型大鼠高切、中切的全血粘度(P<0.05或0.01)和血浆粘度(P<0.01),降低红细胞聚集指数(P<0.05或0.01),增大红细胞变形指数(P<0.05)。结论:层析技术用于天麻糖复和物的分离纯化是可行的,且得到的糖蛋白组分GGE2b对急性血瘀大鼠异常的血液流变有良好的治疗效果。

人肺癌组织中热休克蛋白70(HSP70)的纯化

用快速蛋白液相色谱系统并结合ConA-Sepharose柱,建立了从人肺癌组织中分离纯化热休克蛋白70(HSP70)的方法,分离得到的蛋白经过聚丙烯酰胺凝胶电泳和免疫印迹法鉴定,结果表明该蛋白为HSP70;并且通过Brad-ford标准曲线法对蛋白进行定量,计算出HSP70的得率为:每克湿重肺癌组织可纯化得到约53.2μg HSP70。

克仑特罗偶联物的鉴定

克仑特罗经偶氮化后,与牛血清白蛋白在碱性条件下发生偶联反应生成偶联物。偶联物经红外光谱、紫外光谱、十二烷基磺酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳、快速蛋白液相色谱及免疫鉴定,确定偶联成功。对上述几种偶联物鉴定方法进行了简单比较,认为快速蛋白液相色谱是鉴定偶联物的最佳方法。

FPLC在纯化马铃薯酪氨酸酶中的应用

对马铃薯酪氨酸酶的分离纯化进行了初探。其粗酶最佳硫酸铵盐析浓度65%,最佳温度30℃,最佳pH7.5。分别预装Sephodex G75分子筛凝胶柱和Hi Trip QFF阴离子交换层析柱在FPLC自动分离得到纯化的酪氨酸酶,最高纯化倍数达60,并以L-DOPA作底物,测得比酶活为242.84 U/mg蛋白。对酶活最大的组分进行了SDS-PAGE表征,电泳呈现一条带,相对分子质量为5.6×104。米氏常数Km为2.0 mmol/L。

阳离子交换FPLC二步法制备级纯化单克隆抗体

作者在快速蛋白液相色谱系统（ＦＰＬＣ）建立的二步法制各级纯化单克隆抗体的方法．是将ＭｃＡｂ腹水用ｐＨ６．０，１０ｍｍｏｌ／ＬＰＢ透析或稀释８倍后，直接上ＳＰ－４０ＨＲＦＰＬＣ进行一次纯化，纯化的ＩｇＧ组分再用４０％饱和硫酸铵盐析进行二次纯化和浓缩，即得到ＭｃＡｂ纯品。每次上作量８０～８５ｍｌ腹水，可得到纯化抗体６００～６５０ｍｇ，得率约为７．３ｍｇ／ｍｌ腹水，回收率为７３％，一次色谱纯化周期仅需５０ｍｉｎ．用ＳＤＳ－ＰＡＧＥ法凝胶过滤色谱法和ＤＥＡＥ阴离子交换色谱法检测抗体纯度，一次纯化的ＭｃＡｂ大于９２％，二次纯化的ＭｃＡｂ大于９７％。用免疫组织化学ＡＢＣ测定抗体活性，一次纯化的ＭｃＡｂ为１：８００００（７．８×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ），二次纯化的ＭｃＡｂ为１：１０００００（６．２５×１０－１１ｍｏｌ／Ｌ）．纯化ＭｃＡｂ的热稳定性好，３７℃保温１４４ｈ后抗体活性无明显变化（Ｐ＞０．０５）；特异性高，与正常组和其它癌组织几乎无交叉反应。该法操作简单，既具有常压色谱的制备量，又具有ＨＰＬＣ法的纯化速度及分辨率，同时又解决了色谱纯化ＭｃＡｂ的浓缩问题，是获得高纯度、高活性ＩｇＧ类单克隆抗体的实用方法．用本方法提纯?

南京大学医药生物技术国家重点实验室

南京大学医药生物技术国家重点实验室南京大学医药生物技术实验室于１９８９年被列入世界银行贷款“重点学科发展项目”，开始建设国家重点实验室，１９９０年由国家教委批准边建设边开放。实验室主任由南京大学生命科学学院院长朱德熙教授担任。实验室主要从事生物工程技...

KANSL1蛋白的真核表达纯化及功能验证

目的利用昆虫杆状病毒表达系统(Bac-to-Bac)表达KANSL1蛋白并进行纯化,同时验证该蛋白在体外对微管蛋白聚合的影响。方法构建真核表达载体pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1,转化大肠杆菌DH10Bac感受态细胞获得重组穿梭质粒(Bacmid),用脂质体转染介导Bacmid进入草地贪夜蛾细胞(Sf9 cell),以产生可表达目的基因的重组杆状病毒。随后用此重组杆状病毒感染并扩增Sf9细胞使其大量表达His-mCherry-KANSL1融合蛋白。通过镍柱亲和层析对表达的His-mCherry-KANSL1融合蛋白进行初步纯化,再经快速蛋白液相色谱(FPLC)进一步纯化,利用Western印迹、考马斯亮蓝染色鉴定目的蛋白的表达纯化效果,最后通过体外微管聚合实验分析纯化的KANSL1蛋白对微管蛋白聚合的影响。结果质粒测序显示,pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒构建成功;考马斯亮蓝染色、Western印迹表明纯化得到正确的His-mCherry-KANSL1蛋白,体外微管聚合实验显示KANSL1蛋白显著促进微管蛋白的聚合。结论成功构建pFast-Bac-HTB-mCherry-KANSL1真核表达质粒并在真核表达系统中表达和纯化,重组KANSL1蛋白具有促进微管聚合的作用,为后续KANSL1蛋白功能研究奠定了基础。