基于激光拉曼光谱技术鉴别四种急性白血病细胞系的方法研究

急性白血病的诊断基于一系列检测方法,细胞遗传学和荧光原位杂交方法旨在鉴定涉及白血病发生过程的特定基因和染色体改变,通过流式细胞术和分子生物学进行的免疫表型分析也是目前可用于明确诊断的检查手段。这些检查的侵入性和时效性方面的不足促使人们寻找以拉曼光谱技术为代表的新的方法和技术,以减少假设和诊断结论之间的时间间隔,有利于患者获得更好的预后。拉曼光谱技术可用来非标记识别血液中存在的血细胞和生化元素的光谱信息,例如氨基酸、蛋白质、脂质、核酸和类胡萝卜素,并且该技术在使用细胞系、血涂片和血清样本进行的不同类型血液学疾病的诊断中变得愈为重要,具有广阔的应用前景。实验研究了人急性T细胞白血病细胞系(Jurkat)、人急性骨髓性白血病细胞系(KG-1α)、人急性早幼粒细胞白血病细胞系(NB4)和人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1)的拉曼光谱特征,建立使用拉曼光谱非标记鉴别四种白血病细胞系的新方式,为临床实验研究提供科学基础。分别培养并收集四种急性白血病细胞系细胞,使用Horiba Xplora拉曼光谱仪获取拉曼光谱,每种细胞系捕获25~30个白血病细胞光谱。联合运用主成分分析法、偏最小二乘判别分析和聚类分析等光谱分析方法,对四种细胞系细胞的光谱展开深入分析和建立鉴别模型,联合两两组合分析,对细胞光谱进行甄别。四种细胞的拉曼光谱具有差异,主要通过769, 826, 844, 957, 1 048, 1 141, 1 255, 1 313, 1 415, 1 539和1 575 cm^(-1)等峰位进行区分,反映了jurkat细胞活跃的增殖代谢, KG-1α细胞活跃的与核酸相关的能量代谢以及NB4细胞较强的细胞呼吸等生物学信息。结果表明:依据PLS-DA建立的拉曼光谱辨别模型能准确甄别四种急性白血病细胞,模型具有良好的拟合稳定性、预判能力和应用前景。

RNA结合蛋白RBPMS调控急性髓系白血病细胞系THP-1增殖与迁移

目的研究具有多重剪接功能的RNA结合蛋白(RBPMS)对携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系THP-1功能的影响。方法使用GEO数据库分析造血系统中RBPMS的表达情况;通过慢病毒感染THP-1细胞,RT-qPCR和Western blot检测RBPMS过表达效率;通过高通量测序检测RBPMS过表达后对THP-1细胞转录组的影响。分别用CCK-8法和流式细胞仪检测RBPMS过表达对白血病细胞增殖以及迁移能力的影响。结果RBPMS在携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病干细胞中异常低表达。RBPMS过表达后THP-1细胞的增殖和迁移能力显著降低(P<0.0001,P<0.05)。结论RBPMS可以抑制携带MLL-AF9融合基因的急性髓系白血病细胞系的细胞增殖与迁移。

DLK1基因在急性白血病细胞系中的表达及其意义

目的:研究急性白血病细胞系DLK1基因的表达水平在红系分化中的作用。方法:采用RT-PCR、Western bltting对白血病细胞系K562、HL-60进行DLK1水平的检测。培养K562细胞,用氯化高铁血红素(hemin)诱导其分化,观察DLK1在红系分化中的变化。结果:K562细胞DLK1mRNA、蛋白水平存在明显表达,HL-60细胞DLK1则不表达。通过RT-PCR检测了hemin诱导K562细胞向红系分化过程中各时间点DLK1mRNA的变化,显示随着K562向红系分化,DLK1mRNA的水平逐渐下降。结论:K562细胞表达DLK1,HL-60不表达DLK1。DLK1基因可能参与K562细胞向红系分化的过程,可能抑制其分化。

二甲双胍抑制急性髓系白血病细胞增殖

目的探讨降糖药物二甲双胍对人急性髓系白血病细胞系U937细胞增殖的作用。方法将浓度梯度的二甲双胍(0、5、10、20、40、60 mmol·L^(-1))分别作用于U937细胞24、48 h,采用CCK-8试剂盒检测U937细胞活力,Annexin-V/PI assay试剂盒检测U937细胞凋亡率,JC-1检测U937细胞线粒体膜电位下降水平。同时基于细胞活力试验检测结果,将上述浓度梯度的二甲双胍分别作用于U937细胞48 h,采用Western blot检测Bcl-2蛋白表达水平。结果二甲双胍作用24 h对U937细胞增殖抑制作用较弱、无明显杀伤作用;作用48 h对U937细胞有抑制细胞生长、促进凋亡、降低线粒体膜电位作用,同时显著降低U937细胞Bcl-2蛋白水平。结论二甲双胍可杀伤人急性髓系白血病细胞系U937细胞。二甲双胍抗白血病作用可能与其下调线粒体膜电位、抑制Bcl-2蛋白表达有关。

4-1BBL分子在人急性单核细胞白血病细胞系U937和SHI-1的表达及促生长作用

目的研究4-1BBL分子在人急性单核细胞白血病细胞系U937和SHI-1的表达及促生长作用。方法用流式细胞术(FCM)和RT-PCR法检测4-1BBL分子在U937、SHI-1细胞系的表达;将激发型4-1BBL单抗(1F1)与U937、SHI-1细胞系分别进行培养,细胞计数分析2个细胞系的生长情况;收集U937细胞的培养上清,ELISA法检测细胞因子。结果FCM测得U937和SHI-1细胞有4-1BBL分子表达,RT-PCR法测得4-1BBLmRNA;细胞计数表明,1F1明显促U937、SHI-1细胞系生长(P<0·01);ELISA示1F1与U937细胞共培养48h,其上清液中IL-6含量(55·91±10·23)pg/ml,显著高于IgG1同型对照组的(12·14±3·8)pg/ml(P<0·01)。结论U937和SHI-1细胞系组成性表达4-1BBL分子;1F1与U937、SHI-1细胞的4-1BBL分子交联后,可促进U937、SHI-1细胞系生长,诱导U937细胞分泌细胞因子IL-6。

累及单核细胞系急性白血病的免疫表型和遗传学研究

目的 探讨急性髓系白血病-M4、M5亚型的细胞遗传学、免疫表型特征。方法 应用染色体G显带、间期荧光原位杂交技术和流式细胞术对30例M4、M5患者进行遗传学分析和免疫表型检测。结果 染色体分析:30例M4、M5中共发现13例伴有11q2 3染色体异常,总发生率为4 3 3% ,其中M5a 1例、M5b 8例、M4b 4例,异常核型有6种:t (11;19) 4例;t(11;17) 2例;t(9;11) 2例;t(10 ;11) 1例;t(6 ;11) 1例;t(11;?) (q2 3;?) 1例;del(11)(q2 3) 2例。I-FISH检测MLL基因异常共13例阳性,其中M5 8例,M4 5例。免疫表型检测各种抗原阳性率依次为HLADR(92 % ) ,CD33(92 % ) ,CD6 4 (85 % ) ,CD11b(80 % ) ,CD15 (79% ) ,CD117(79% ) ,CD13(6 9% ) ,CD34(6 1% ) ,CD5 6 (38 5 % ) ,CD14 (31% ) ,CD3(14 % ) ,CD2 (7% ) ,CD7(7% )。结论 11q2 3异常在AML -M5 /M4中发生率高,该组患者高表达早期干祖细胞标志CD34、CD117、HLA -DR ,具有独特的遗传学、免疫学特点。

Livin在白血病耐药细胞系THP-1R的表达

Livin是凋亡抑制蛋白（inhibitor of apoptosis protein,IAP）家族新成员,在正常组织极少表达,而在多数恶性肿瘤组织细胞中高表达,与肿瘤抗凋亡和耐药性有关。为探讨Livin与白血病细胞耐药的相关性,本实验主要从分子水平研究Livin在人急性白血病细胞系THP-1与耐药细胞系THP-1R中的差异表达情况，为Livin在白血病多药耐药（multi-drug resistance，MDR）方面的意义提供实验依据。

精胺-普鲁兰联合地氯雷他定介导的NOTCH1沉默对急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat的影响

目的以精胺-普鲁兰(Ps)作为NOTCH1 siRNA的载体,研究Ps联合溶酶体促渗剂地氯雷他定(DL)介导的NOTCH1沉默对急性T淋巴细胞白血病细胞系Jurkat的作用。方法采用动态光散射仪分析不同N/P比siRNA/Ps复合物的粒径和Zeta电位。将Jurkat细胞与siNOTCH1/Ps共孵育6 h,换液后加入含10μmol/L DL的RPMI 1640完全培养基继续孵育18 h;实时荧光定量PCR检测NOTCH1的沉默效率;流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡;Western blot检测NOTCH1下游蛋白C-MYC和凋亡相关蛋白caspase 3和cleaved caspase 3的表达。结果N/P比为5的siRNA/Ps复合物粒径为(203.97±1.07)nm,Zeta电位为(46.13±0.07)mV;复合物在10%FBS培养基中稳定。在Jurkat细胞中,与无DL组相比,siNOTCH1/Ps联合10μmol/L DL可高效沉默NOTCH1,诱导细胞周期阻滞在G 1期,促进细胞凋亡(P<0.05);同时,Jurkat细胞中cleaved caspase 3蛋白的表达水平升高,C-MYC及caspase 3蛋白的表达水平降低(P<0.05)。结论Ps联合溶酶体促渗剂DL有效介导Jurkat细胞中的NOTCH1沉默,从而诱导急性T淋巴细胞白血病细胞G 1期阻滞,并促进细胞凋亡。

CD14^+单核细胞系白血病细胞来源树突细胞体外刺激特异抗白血病T细胞应答(英文)

背景与目的:白血病细胞能在体外分化为树突细胞(dendriticcells,DCs),从而有希望用于白血病的免疫治疗。本研究旨在探讨CD14高表达的单核细胞系白血病(M4、M5)细胞分化而来的DCs体外诱导抗白血病T细胞应答的能力。方法:取5例初诊CD14高表达的M4或M5型白血病患者的骨髓标本,分离单个核细胞(bonemarrowmononuclearcells,BMMNCs),将白血病细胞分为3组:贴壁白血病细胞组、非贴壁白血病细胞组及总白血病细胞组。流式细胞术(flowcytometry,FCM)比较3组细胞的CD14表达。用含GM-CSF、IL-4和TNF-α或不含细胞因子的培养液培养细胞7～10天后,通过细胞形态学观察及FCM检测细胞表型,鉴定单核白血病细胞来源的DCs(monocyticleukemiacell-deriveddendriticcells,Mo-LDCs);采用异基因混合淋巴细胞反应(allogeneicmixedlymphocytereaction,Allo-MLR)以及细胞毒性T淋巴细胞(cytotoxicTlymphocytes,CTL)抗白血病细胞毒分析检测Mo-LDCs的免疫功能,染色体核型分析结合异常表面抗原确定Mo-LDCs的白血病来源。结果:3组中贴壁白血病细胞的CD14含量最高,在细胞因子联合诱导下,可分化为大量CD83+成熟DCs。在同一病例的3组细胞以及不同病例的总单核细胞组间,培养前CD14的表达率与诱导后CD83+DCs的产率成正相关(r=0.967,P=0.007)。Mo-LDCs具有典型的成熟DCs的形态及表型特征,在Allo-MLR中能刺激同种T细胞明显增殖,并能刺激扩增特异性抗白血病CTL。同时,Mo-LDCs持续存在所起源白血病的核型异常和异常表达的髓系抗原。结论:在细胞因子组合诱导下,M4、M5亚型AML的CD14+细胞可分化为具有免疫功能的Mo-LDCs,单核系白血病细胞的CD14表达高低可能预示其DCs分化能力。Mo-LDCs具有经典的DCs的表型及功能,还具有白血病的克隆异常,可用于M4、M5患者的免疫治疗。

复方中药制剂对急性髓系白血病细胞诱导分化与增殖的作用

目的:研究复方中药制剂对白血病细胞的作用及其机制。方法:用复方中药制剂处理体外培养的髓系白血病细胞株,用CCK8的方法观察中药制剂对白血病细胞增殖的影响,瑞氏染色法观察细胞形态学的变化,流式细胞术检测细胞凋亡并测定细胞表面分化抗原CD11b的表达水平。结果:与单纯的4种白血病细胞系HL-60,MOLM-13,MV4-11,AML-M5相比较,不同中药浓度处理的这4种白血病细胞增殖能力减弱(P<0.05)且其增殖抑制作用呈剂量依赖性(r=0.9236;r=0.7488;r=0.8889;r=0.8119);与单纯的HL-60和AML-M5白血病细胞系相比,药物处理的这2种白血病细胞有明显的分化形态改变;与单纯的HL-60白血病细胞系相比,IC50中药浓度处理的HL-60细胞表面抗原CD11B增加85%±7.13%;与单纯的AML-M5白血病细胞系相比,1.5μl和2μl剂量中药制剂处理的AML-M5细胞的凋亡率增加(P <0.05)。结论:复方中药制剂对白血病细胞具有抑制增值作用,其机制可能与诱导白血病细胞分化和凋亡作用相关。

2例典型的急性杂和性白血病形态学特点分析及国内文献复习

急性杂和性白血病（HAL）是急性白血病中髓细胞和淋巴细胞系共同累及的一组疾病,比较罕见,国内刘本叔于1983年首例报告,目前由于诊断技术不断提高,研究数据显示发病率有增加趋势.该类疾病在临床表现和治疗上有一定的特殊性.根据细胞来源与表达不同可分为：双表型、双克隆型和双系列型.单纯形态学对后两种类型部分可以诊断,但对双表型根本无法确定,流式细胞技术进行急性白血病细胞系列相关抗原表达检测与细胞形态学联合应用于白血病的诊断分型、治疗方案的选择和预后的判断具有重要意义.

EGCG干预抗β_2GPI/β_2GPI复合物对THP-1细胞的诱导活化作用

目的探讨表没食子儿茶素没食子酸酯(EGCG)干预抗β2GPI/β2GPI复合物诱导人急性单核细胞白血病细胞系(THP-1细胞)活化的作用。方法用一定剂量的EGCG、脂多糖(LPS)、抗β2GPI/β2GPI复合物等不同刺激物处理THP-1细胞,实时荧光定量PCR检测细胞组织因子(TF)及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)mRNA表达;发色底物法检测TF活性;ELISA测定TNF-α蛋白的表达。结果 50 mg/L EGCG能抑制抗β2GPI/β2GPI复合物刺激的THP-1细胞TF mRNA和活性的表达(t值为6.97、3.89,P均<0.05),同时下调该复合物诱导的THP-1细胞TNF-αmRNA和蛋白质的表达水平(t值为3.23、4.65,P均<0.05)。结论 EGCG可干预抗β2GPI/β2GPI复合物诱导THP-1细胞TF及TNF-α的表达,抑制THP-1细胞活化。

HL-60细胞及其耐药细胞株HL-60/ADM超弱发光的检测

目的:探讨人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60)和其耐药株抗阿霉素人急性早幼粒白血病细胞系(HL-60/ADM)的超弱发光与耐药性的关系。方法:应用MTT比色法、流式细胞术、细胞生长曲线和免疫组化染色法,检测HL-60细胞、HL-60/ADM细胞对阿霉素(ADM)的敏感性、细胞周期变化及P-糖蛋白(P-gp170)的表达。用IFFM-D型流动式化学发光仪检测HL-60细胞及HL-60/ADM细胞的超弱发光强度。结果:HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性明显低于亲本HL-60细胞;HL-60/ADM细胞中G0/G1期的细胞为44·80%±1·97%,G2/M期的细胞为9·90%±0·27%,较其亲本细胞增多,S期的细胞为45·30%±1·93%,较其亲本细胞减少(P<0·05);HL-60/ADM细胞倍增时间是HL-60细胞的1·8倍,P-gp170的表达呈阳性,HL-60细胞呈阴性。在1×10-4mol/L鲁米诺及3mL/L双氧水条件下,密度分别为8×107/L、1×108/L、1·26×108/L及2·73×108/L的HL-60/ADM细胞超弱发光强度低于HL-60细胞(P<0·05)。结论:HL-60/ADM细胞对ADM的敏感性降低,细胞生长延缓,P-gp170表达呈阳性等均提示HL-60/ADM细胞出现了耐药性;且随着HL-60/ADM细胞耐药性的产生其超弱发光强度较其亲本细胞HL-60降低,提示细胞超弱发光强度明显降低可作为细胞耐药性产生的一项指标。

miR-146a对THP-1细胞靶基因AUF1调控及细胞因子表达的影响

目的探讨miR-146a对人急性单核白血病细胞系(THP-1)靶基因AU碱基富集区结合降解因子1(AUF1)表达的调控及细胞因子表达的影响。方法构建miR-146a过表达及抑制表达慢病毒载体并转染THP-1细胞,以正常培养的THP-1细胞为对照。用实时定量PCR法检测THP-1细胞AUF1 mRNA表达;蛋白质印迹法检测THP-1细胞AUF1蛋白的表达;酶联免疫吸附试验检测THP-1细胞培养基上清液白细胞介素-8(IL-8)及白细胞介素-35(IL-35)浓度。结果过表达miR-146a,可导致THP-1细胞AUF1 mRNA及蛋白表达下调(P<0.01,P<0.05);THP-1细胞上清液IL-8及IL-35浓度降低(P<0.01,P<0.05)。抑制miR-146a表达,导致THP-1细胞上清液IL-8及IL-35浓度明显增高(P<0.01,P<0.01)。结论 AUF1是miR-146a的靶基因。miR-146a可以调控THP-1细胞上清液IL-8、IL-35浓度。IL-8的改变引起相应IL-35的改变,一起参与炎性反应。

Sorcin基因和mdr1基因的相关性及临床意义

目的 探讨急性髓细胞系白血病 (AML)患者可溶性耐药相关钙结合蛋白基因 (sorcin)和多药耐药基因 (mdr1)的相关性表达及其与临床耐药和疗效的关系。方法 Northernblot检测K5 6 2 /A0 2细胞株sorcin和mdr1基因的表达 ,用半定量逆转录聚合酶链反应 (RT PCR)检测 6 5例AML患者、2 7例非白血病患者和健康人的sorcin基因和mdr1基因表达 ,并分析sorcin基因和mdr1基因表达的相关性及其临床意义。结果 AML患者中 ,sorcin和mdr1基因表达明显高于正常对照组 ,差异有非常显著性 (P <0 .0 0 1) ;在AML和对照组中 ,sorcin和mdr1基因的表达有较好的相关性 ;sorcin和mdr1基因的共表达与AML患者的临床耐药和预后具有较高的符合率。Sorcin+ 和mdr1+ 组患者临床耐药发生率为 92 .9% ,完全缓解 (CR)率为 7.1% ;sorcin-和mdr1-组患者临床耐药发生率为 8.6 % ,CR率为91.4 %。结论 白血病患者的sorcin和mdr1基因共表达与其临床耐药和预后密切相关 ,可作为检测临床耐药和判断预后的有效手段之一。