湖南省部分地区禽致病性大肠杆菌分离鉴定及生物特性分析

为探究湖南省禽致病性大肠杆菌的生物特性,从部分地区规模肉鸡场采集122份病死鸡临床肝脏样品,采用传统细菌培养方法进行分离培养和初步鉴定,利用大肠杆菌持家基因phoA进行PCR扩增,对纯化鉴定后的分离株进行血清型鉴定、种系发育群检测、多位点序列分型(MLST)、毒力基因检测、动物致病性试验及耐药性分析。结果显示:共分离出83株禽致病性大肠杆菌,鉴定出15种血清型,其中O2、O1、O78、O14为优势血清型,种系发育群分为B2、B1、A和D群,高致病性株主要来自B2、B1群;MLST分析共得到12种ST型,其中ST95、ST481、ST350为主要ST型;分离株irp2、fyuA、iutA、fimC毒力基因携带率为100%,其中38.55%菌株同时携带irp2、afa、fyuA、iutA、hlyF、iss、papC、fimC毒力基因;雏鸡致病性试验检出高致病性菌株46株(55.42%)、中等致病性菌株31株(37.35%)、低等致病性菌株6株(7.23%);分离株对10种常用抗生素有不同程度耐药,其中对四环素和新生霉素耐药最严重,耐药率分别为96.38%和92.77%。结果表明,湖南省禽致病性大肠杆菌遗传关系整体复杂多态,且致病性较高,耐药广泛,提示该地区应加强对禽大肠杆菌病的防控。

禽致病性大肠杆菌HlyE蛋白的免疫原性研究

为评估禽致病性大肠杆菌(APEC)溶血素HlyE蛋白的免疫原性,本研究对APEC溶血素HlyE蛋白进行原核表达和纯化,并对表达的重组蛋白进行SDS-PAGE和western blot分析,将纯化蛋白利用透析袋在4℃透析后,利用血琼脂平板对其溶血活性进行检测。SDS-PAGE和western blot结果显示,表达并纯化到分子量约为36 ku的重组HlyE蛋白(rHlyE),经ND-2000超微量核酸蛋白测定仪测定纯化后蛋白浓度为0.65 mg/mL;溶血活性检测结果显示,rHlyE具有溶血活性。以透析后的rHlyE作为抗原,按照50μg/只的剂量免疫小鼠,对照组于相同时间点注射等量PBS,共免疫3次间隔14 d,并于首免后不同时间采血,采用间接ELISA方法检测两组小鼠血清特异性抗体水平,并于三免后18 d以2 LD_(50)的APEC菌液攻毒小鼠,观察7 d内小鼠的死亡情况;于首免后28 d剖杀各组小鼠取其脾脏制备脾淋巴细胞,采用流式细胞术分别检测CD3^(+)、CD4^(+)、CD8^(+)T淋巴细胞亚型比率,对rHlyE的免疫原性进行评估。间接ELISA检测结果显示,该蛋白能够诱导机体产生体液免疫应答,分泌高表达量的IgG抗体,抗体水平于三免后15 d达到最高水平。rHlyE免疫攻毒保护试验结果显示,免疫组小鼠基本无明显临床症状,7 d内存活率达80%;而对照组小鼠表现明显临床症状,于攻毒后3 d内全部死亡。流式细胞术结果显示,与对照组相比,免疫组小鼠的CD3^(+)、CD4^(+)和CD8^(+)T淋巴细胞亚型比率均升高。上述结果表明,rHlyE在大肠杆菌BL21中为部分可溶性表达,将其免疫小鼠后可诱导小鼠产生较高水平的体液免疫应答,并且可对小鼠产生较好的免疫保护效果。本研究明确了APEC HlyE蛋白的免疫原性,为APEC免疫保护蛋白的筛选以及疫苗研发提供了借鉴与参考。

39味中药及其复方对鸡源禽致病性大肠杆菌体外抑菌试验研究

试验旨在筛选抑制鸡源禽致病性大肠杆菌(Avian Pathogenic Escherichia coli,APEC)O78地方流行株的有效中药。采用打孔法测定39味中药及其复方对APEC的抑菌效果,使用二倍稀释法测定其最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC)。结果表明:39味中药中有9味中药对APEC有一定的抑菌效果,其中五味子、洛神花和黄柏对APEC高度敏感,MIC依次为31.25、31.25、500 mg/mL,MBC依次为62.5、125、500 mg/mL;蒲公英、红花和石榴皮中度敏感,MIC与MBC均大于或等于500 mg/mL;丹皮、何首乌和荷叶低度敏感;其余中药无抑菌效果。复方中五味子+洛神花配伍药效最好,MIC与MBC分别为31.25 mg/mL与125 mg/mL。说明在39味中药中五味子、黄柏、洛神花和复方五味子+洛神花(1∶1)对APEC有比较好的体外抑菌能力。

大熊猫源肠外致病性大肠杆菌的分子分型、耐药表型与耐药基因分析

【目的】明确四川大熊猫源肠外致病性大肠杆菌(Ex PEC)的耐药性与耐药基因流行情况,为大熊猫源Ex PEC感染的临床用药提供参考。【方法】从四川省绵阳市和雅安市野外死亡大熊猫的肠外器官采集病料,进行病原菌的分离,通过16S rRNA基因序列分析与Ex PEC多重PCR鉴定,继而对分离的Ex PEC进行系统进化群分群、MLST分型和PFGE分型,并采用K-B法与Wafergen Smartchip超高通量qPCR进行耐药表型测定和耐药基因分析。【结果】分离出9株Ex PEC,系统进化群分别为B2群和A群;MLST和PFGE分型均为3种分子型,其中MLST为ST555、U10和ST127型,PFGE为Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ型;9株Ex PEC对多黏菌素B、亚胺培南、左氧氟沙星与萘啶酸敏感率达100%;对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类等9类抗生素耐药基因(ARGs)的检测发现,β-内酰胺类和多重耐药类ARGs检出率较高。【结论】分离鉴定的9株大熊猫源Ex PEC系统进化群主要为B2群,MLST和PFGE分型主要为ST127/PFGE基因Ⅰ型,具有明显的多重耐药性,且β-内酰胺类和多重耐药类ARGs检出率较高,主要通过抗生素失活(antibiotic deactivate)和抗生素外排泵(efflux pump)两种耐药机制介导耐药性。

1株山鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定

为查明秦皇岛市某山鸡养殖场山鸡大批量死亡病因,试验对分离到的致病优势菌株进行生化鉴定和16S rRNA基因序列分析,并测试分离菌对21种抗生素的敏感性,进一步采用PCR方法检测分离菌的耐药基因。利用清洁级昆明小鼠和SPF鸡胚分别对分离菌进行致病性试验,并采用PCR方法检测分离菌的毒力基因。结果显示:分离菌为革兰氏阴性杆菌,在伊红美蓝培养基上生长出有金属光泽的菌落,生化特性与大肠杆菌生化特性符合率高达99%。BLAST分析发现,分离菌16S rRNA序列与大肠杆菌的基因相似性高达99.8%。分离菌对恩诺沙星和阿米卡星高度敏感,对青霉素、头孢曲松等15种药物耐药。分离菌的磺胺类、β-内酰胺类、四环素类的耐药基因与耐药表型基本相符,其余耐药基因与耐药表型不符,提示该分离菌可能存在其他的耐药机制。致病性试验结果显示,分离菌具有较强致病性,共检测到12种大肠杆菌主要毒力基因。研究表明,分离菌为山鸡源致病性大肠杆菌,且耐药情况复杂,具有较强的毒力和致病性。

双组份系统调控禽致病性大肠杆菌生物被膜的研究进展

禽致病性大肠杆菌是一种典型的肠道外致病性大肠杆菌,能够引起各种肠道外疾病,给禽类养殖业造成重大的经济损失。生物被膜作为一种保护细菌的物理屏障用于抵御抗生素的损伤及逃避宿主的免疫系统,从而导致宿主持续和反复性感染。双组份系统是普遍存在于各类细菌中主要的信号传导系统,参与调控细菌抗生素耐药性和生物被膜的形成。为了解由生物被膜造成的禽致病性大肠杆菌感染机制,文章详述了生物被膜的形成过程,并综述了双组份系统调控生物被膜形成的分子机制,以期探寻阻断双组份系统信号转导的新方法以破坏生物被膜的形成作为控制禽致病性大肠杆菌感染的治疗策略,从而为防治由生物被膜引起的抗生素耐药性以及持续或反复性感染提供研究方向。

蛋鸡禽致病性大肠杆菌分离鉴定及噬菌体制剂体外杀菌研究

为研究噬菌体制剂对蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗效果,从某蛋鸡养殖场采集疑似禽致病性大肠杆菌感染的病料,进行病原的分离鉴定、生物学特性分析和药物敏感试验等操作,选择其中代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验。结果可见有深紫黑色且带金属光泽细菌生长;镜检可见呈红色两端钝圆的短杆菌;生化鉴定,符合大肠杆菌的生化特性;PCR检测和序列分析结果表明为大肠杆菌。累计从152份样品中分离到大肠杆菌49株,药敏试验结果显示49株分离菌对环丙沙星、阿莫西林、头孢他啶、强力霉素、复方新诺明、林可霉素等耐药率分别高达89.8%、89.8%、93.6%、98.0%、85.7%、100%,临床耐药情况严重。选用5株代表性菌株开展噬菌体制剂体外杀菌试验,与氟苯尼考相比,噬菌体制剂体外杀菌效果更优。复合噬菌体制剂可用于蛋鸡禽致病性大肠杆菌病的治疗。

江苏省部分地区水禽肠道外致病性大肠杆菌的分离鉴定及生物学特性研究

本研究旨在明确江苏地区水禽致病性大肠杆菌的血清型、进化分群、毒力基因分布和耐药情况,以期为水禽大肠杆菌病的防控提供依据。本研究从江苏省部分规模化水禽养殖场疑似大肠杆菌感染病例中,分离得到24株水禽肠道外致病性大肠杆菌,并检测分离菌株的血清型、毒力基因分布、系统进化分群和耐药情况。血清型检测结果表明,O65血清型菌株共8株,占全部菌株的33.3%,O16、O68、O87、O126、O138、O164血清型菌株各1株,其他未鉴定血清型10株;毒力基因检测结果表明,fimA、ECs3737、ECs3703、tsh和irp2基因在分离菌株中的阳性率分别为83.3%、75.0%、66.7%、33.3%和4.2%,其中含有4个毒力基因组合的菌株占29.2%;系统进化分群结果表明,非致病群A占45.8%,低致病群B1占33.3%,高致病群B2和D分别占8.3%、1.3%;药敏试验结果表明,24株分离菌株均对恩诺沙星、强力霉素100%耐药,对四环素、万古霉素、红霉素的耐药率为91.7%,对阿莫西林/棒酸的敏感率为100%。本研究结果表明,江苏省水禽致病性大肠杆菌血清型较为复杂、耐药性严重。

致泻性大肠杆菌的流行及耐药现状

致泻性大肠杆菌（DEC）是细菌性腹泻的常见病原菌，它包括肠致病性大肠杆菌（EPEC）、产肠毒素大肠杆菌（ETEC）、侵袭性大肠杆菌（EIEC）、肠出血性大肠杆菌（EHEC）和肠聚集性大肠杆菌（EAEC）以及近来发现的肠产志贺样毒素且具侵袭力的大肠杆菌（ESIES）。DEC感染主要见于婴幼儿，近年来其在成人腹泻病人中的检出率有所增加，并成为部分地区致腹泻的主要病原菌，且对常用药物出现了较高的耐药性，因此受到了广泛的关注。

禽致病性大肠杆菌tonB基因缺失株的构建及其生物学特性研究

为了研究摄铁蛋白TonB对于禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)铁摄取能力及致病性的影响,试验采用同源重组技术构建了APEC tonB基因缺失及回复株,通过测定在正常和贫铁环境下的生长曲线、铁摄取能力等研究tonB对APEC生物学特性的影响,并通过鸡攻毒模型评价了其与APEC毒力之间的关联性。结果显示:APEC TZ18ΔtonB缺失株在正常环境中的生长速度与野生株相比没有差异,但其在贫铁环境中的生长速度显著下降(P<0.05);TZ18ΔtonB缺失株菌体内摄入的铁含量明显低于野生株;TZ18ΔtonB缺失株感染1日龄雏鸡的半数致死量(104.236)高于野生株(103.328),显示其毒力下降了8.1倍(P<0.05);此外,TZ18ΔtonB缺失株在21日龄SPF鸡体内心血、肝脏和肺脏中的载菌量显著低于野生株感染水平(P<0.01),而tonB基因回复株的感染水平接近野生株。结果表明:tonB参与APEC铁摄取进程并影响其毒力。

一株鸡源致病性大肠杆菌的分离鉴定及耐药性检测

大肠埃希菌(E.coli)俗称大肠杆菌,为埃希菌属的代表菌。大肠杆菌在肠道菌鉴别培养基,如麦康凯琼脂培养基上生长,因发酵乳糖产酸,使指示剂变红,形成红色菌落。大肠杆菌对多种消毒药敏感,对各种广谱抗菌药也敏感,但易产生耐药性。多数大肠杆菌为人和动物肠道内的正常菌群成员之一,少数为致病性细菌。致病性大肠杆菌对动物具有致病性,能引发人和动物的败血症、腹泻、肺炎、心内膜炎、泌尿道感染、幼畜或幼儿腹膜炎、脑炎等。笔者在学校兽医实验室分离鉴定了一株致病性鸡源大肠杆菌,并进行耐药性检测,现予以介绍。

禽致病性大肠杆菌病疫苗研究进展

禽致病性大肠杆菌病是一类由禽致病性大肠杆菌(Avian pathogenic Escherichia coli,APEC)引起的、严重危害家禽养殖业的禽类重要疾病。APEC血清型众多,容易产生耐药性并且还具备感染人的潜力,对公共卫生安全造成严重影响。疫苗接种能针对APEC产生较高保护效力,从而减少禽养殖业经济损失。禽致病性大肠杆菌病疫苗主要包括灭活疫苗、减毒活疫苗和亚单位疫苗等。文章综述了禽致病性大肠杆菌病及其疫苗的研究进展,旨在为禽致病性大肠杆菌病的防控和疫苗的研发应用提供一定的理论参考。

ZnuA基因缺失对致病性大肠杆菌生物学特性的影响

目的为研究Zn 2+转运系统ZnuABC关键分子ZnuA对致病性大肠杆菌生物特性的影响。方法利用λRed同源重组方法构建大肠杆菌CL-1菌株ZnuA基因缺失菌株,对比ZnuA基因缺失前后大肠杆菌生长、生化特性的改变,以及大肠杆菌的生物被膜产生、抗生素敏感性及其对结肠腺癌细胞的黏附能力的差异。结果成功构建大肠杆菌CL-1菌株ZnuA基因缺失菌株CL-1ΔZnuA和回补菌株CL-1ΔZnuA/pZnuA,生长曲线结果显示,在低浓度Zn 2+条件下,CL-1ΔZnuA的生长明显弱于野生型菌株和回补菌株,但生化特性无改变。生物被膜形成测定试验结果显示,ZnuA基因缺失能够减少40%大肠杆菌生物被膜形成能力,并明显增加大肠杆菌对氧氟沙星的敏感性。黏附试验结果显示,在细菌培养时添加螯合剂处理,缺失菌株CL-1ΔZnuA对CaCO-2细胞的黏附能力明显下降。小鼠模型显示,ZnuA基因缺失会引起大肠杆菌毒力的显著下降。结论锌获取蛋白ZnuA的缺失会导致大肠杆菌多种生物特性的改变,揭示了锌元素对致病性大肠杆菌致病的重要作用,为后续大肠杆菌病的防控提供了依据。

尿路致病性大肠杆菌与宿主相互作用的研究进展

泌尿系感染(UTI)是泌尿外科常见的感染性疾病,通常由尿路致病性大肠杆菌(UPEC)引起。UPEC入侵及定殖于尿路上皮细胞,造成泌尿系感染以及复杂的宿主免疫清除和病原体免疫逃逸,包括物理屏障的防御、中性粒细胞迁移、募集和吞噬以及细胞因子的分泌等。病原体与宿主之间复杂的免疫反应与免疫逃避是疾病发生发展的关键,也是UTI治疗的基础。本文针对最新的UTI中宿主-尿路致病大肠杆菌相互作用作一综述。

gltS基因缺失对禽致病性大肠杆菌生物学特性的影响

为研究谷氨酸转运蛋白GltS编码基因对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究利用λ-Red同源重组方法构建APEC CE129(WT)株gltS基因缺失株CE129ΔgltS(KO)和基因回补株CE129ΔgltS/gltS (RS),并均经PCR及测序鉴定,结果显示,gltS基因缺失株及回补株均正确构建。通过连续10 h测定各菌株OD600nm值绘制WT、KO、RS菌株的生长曲线,利用梅里埃自动生化鉴定系统测定3株菌的生化特性;利用K-B纸片法检测3株菌对8类16种药物的敏感性;利用半固体培养基检测3株菌的运动能力。结果显示,3株菌的生长特性、生化特性、药敏特性和运动能力均无明显差异。利用细菌平板计数法计算检测WT与KO菌株的体外竞争指数(CI),分析KO菌株是否致弱。利用结晶紫染色法测定3株菌的生物被膜(BF)的形成能力,并利用刚果红琼脂板及含荧光增白剂的琼脂板分别检测菌株BF中curli菌毛及纤维素的形成情况。结果显示,WT与KO菌株的体外CI为0.32,表明KO菌株轻度致弱。BF形成能力检测结果显示,相对于WT、RS菌株,KO菌株BF的形成能力极显著降低(P<0.001),且KO菌株BF的主要组成成分curli菌毛有明显变化,表明gltS基因参与APEC BF中curli菌毛的形成,而3株菌在含荧光增白剂琼脂板的荧光强度均一致,表明gltS基因与APEC BF中纤维素的形成无关。采用细菌计数法统计WT、KO、RS菌株在6种应激条件下的生存率,结果显示,除氧化应激条件下3株菌的生存率无显著差异外,在酸、碱、热、铁饥饿应激环境中,与WT和RS菌株相比,KO菌株的生存率均极显著降低(P<0.001、P<0.0001)。在50 mg/L、100 mg/L NaNO2中,KO菌株的生存率显著降低(P<0.01);在150 mg/L NaNO2中,KO菌株的生存率极显著降低(P<0.001)。采用菌落计数法测定WT和KO菌株抗不同浓度血清的杀菌作用,结果显示,在高浓度的血清中(50%~100%),WT、KO菌的数量显著高于DH5α对照菌株(P<0.05);但在不同浓度血清中KO菌的数量与WT菌的数量差异不显著。本研究结果首次证实gltS基因参与APEC部分生物学特性的形成,为进一步阐释gltS基因功能及该菌的致病机制奠定了基础。

肠出血性大肠杆菌传播模式

大肠杆菌是寄居在哺乳动物和禽类胃肠道中的正常菌群之一，然而少数具有致病性，可引起机体肠道和肠道外感染。依其毒力特征和所致疾病症状不同，现已报道的肠道感染性大肠杆菌有：产肠毒素性大肠杆菌（enterotoxigenic E．coli，ETEC）；肠致病性大肠杆菌（enteropathogenic E．coli，EPEC）；肠出血性大肠杆菌（enterohaemorrhagic E．coli，EHEC）；肠聚集性大肠杆菌（enteroaggregative E．coli，EAggEC）； （enteroinvasiveE．coli，EIEC）；

细胞溶素HlyE变体对禽致病性大肠杆菌致病力的影响

为了探究细胞溶素HlyE突变体(HlyE-V)对禽致病性大肠杆菌(APEC)致病力的影响,采用Red同源重组法构建了APEC菌株CBE59的HlyE-V基因缺失株CBE59ΔHlyE-V和回补株CBE59CΔHlyE-V,测定缺失株生长曲线、溶血活性、胞内存活曲线,并用细胞毒性试验和动物试验来评估HlyE-V对APEC致病力的影响。结果表明∶缺失HlyE-V基因对APEC的生长速率影响较小,野生株、缺失株和回补株均无溶血活性,证明HlyE-V不是孔道形成毒素,不能溶解哺乳动物的红细胞;HlyE-V缺失株致细胞毒性和对雏鸡的致病力显著降低,缺失株的半数致死量(LD50)值为4.9×10^(6)CFU/只,而野生株和回补株的LD50分别为8.2×10^(5)CFU/只、4.2×10^(5)CFU/只;在HD11巨噬细胞内的存活能力显著下降,在野生株CBE59感染的HD11中有一半的细胞中含有6~8个细菌,且有56.7%的细胞中观察到超过6个细菌;而在观察缺失株CBE59ΔHlyE-V时,菌量超过6个的仅为10.7%,相较野生株下降了46%。研究表明,HlyE-V对APEC的致病力起着关键作用。

四味穿心莲散水煎剂防治禽致病性大肠杆菌病疗效研究

为考察四味穿心莲散水煎剂(DSCS)对禽致病性大肠杆菌(APEC)的抗菌活性,本试验用微孔-平板法测定最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MBC);用10日龄雏鸡制备APEC感染模型,随机分为5组,每组20只,设DSCS高、中、低三个剂量组,氟苯尼考阳性对照组和感染组,另设一组健康对照组,口服给药,连用5 d,观察疗效。结果显示:DSCS对APEC的MIC为7.82 mg/mL,MBC为31.25 mg/mL;DSCS组对APEC病的治愈率为50%~82%,与氟苯尼考组相当,DSCS高剂量组有效率显著高于氟苯尼考组(P <0.05)。由此表明,四味穿心莲散水煎剂能够有效治疗APEC病。

禽致病性大肠杆菌fdtACB基因缺失株的生物学特性研究

为研究O抗原侧链岩藻糖合成酶基因fdtACB对禽致病性大肠杆菌(APEC)生物学特性的影响,本研究以O_(2)血清型APEC DE17为亲本株,通过Red同源重组构建fdtACB基因缺失株与回补株,经PCR及测序鉴定确认缺失株ΔfdtACB和回补株CΔfdtACB均正确构建。采用硝酸银染色法鉴定细菌脂多糖(LPS)图谱,采用western blot鉴定缺失株与O_(2)血清型O因子血清的反应性。硝酸银染色法结果显示,ΔfdtACB缺失株未产生与野生株一样完整的LPS图谱,表现为部分O抗原梯状条带缺失和移位;western blot结果显示,ΔfdtACB与大肠杆菌O_(2)血清型O因子血清无反应条带。各菌株培养16 h后每隔1 h测定OD600nm值,绘制生长曲线;于半固体培养基培养各菌株,通过测量细菌运动圈直径分析各菌株的运动能力,通过结晶紫染色法检测各菌株生物被膜(BF)形成能力,结果显示,ΔfdtACB缺失株、野生株和回补株间生长速率无明显差异(P>0.05);与野生株相比,ΔfdtACB缺失株的运动能力显著降低(P<0.01),BF形成能力显著升高(P<0.01)。以上结果表明fdtACB影响细菌O抗原完整性、运动及BF的形成。将各菌株分别感染DF-1细胞后通过细菌计数分析APEC对细胞的黏附及侵袭力,结果显示,ΔfdtACB对DF-1细胞的黏附及侵袭力均较野生株极显著降低(P<0.01)。以不同浓度各菌株腹腔注射感染大蜡螟后,根据5 d内各组大蜡螟死亡数量计算各菌株LD50,结果显示,除高剂量各菌株外,其它剂量各菌株注射后,ΔfdtACB组大蜡螟死亡数较其它组少,经计算野生株LD50为1.85×10^(2) cfu/mL,缺失株LD50为9.16×10^(2) cfu/mL,回补株LD50为8.0×10^(1) cfu/mL,缺失株致病力比野生株降低约5倍,表明fdtACB影响细菌感染性和致病力。综上所述,本研究首次证实大肠杆菌岩藻糖合成酶FdtACB参与O_(2)型APEC O的抗原合成,在细菌运动、BF形成和感染过程中发挥作用,该结果对掌握APEC O抗原侧链的生物学功能具有重要意义。