中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂对慢性炎症气道高分泌的干预作用

目的 了解慢性炎症气道黏液高分泌发生的分子机制。方法 利用大鼠慢支炎模型 ,对其进行中性粒细胞弹性蛋白酶 (NE)抑制剂 - Sivelestat干预后 ,采用酶联免疫吸附试验 (EL ISA)及原位杂交方法分别检测支气管肺泡灌洗液 (BAL F)中黏蛋白 (MUC)含量以及肺组织粘蛋白基因 MUC5 AC转录水平的表达。结果 Sivelestat明显降低慢性气道炎症大鼠气道黏蛋白含量 ,并从转录水平降低 MUC的分泌。结论 NE是炎症气道黏液高分泌发生的重要始动因素 。

侧孢短芽孢杆菌碱性蛋白酶基因BLG4在枯草芽孢杆菌WB600中的高效表达

侧孢短芽孢杆菌G4菌株在侵染线虫的过程中可以分泌蛋白酶,降解线虫体壁,从而帮助细菌侵入宿主体内.在本文中,侧孢短芽孢杆菌的胞外蛋白酶BLG4基因经克隆后插入到改造后的枯草芽孢杆菌表达载体pWT22中,构建重组表达质粒pWT22-BLG4.构建成功的重组质粒通过化学转化法转入枯草芽孢杆菌蛋白酶缺失菌株WB600中,转化子pWT22-BLG4/WB600在IPTG(1.0 mmol.L-1)的诱导下,发酵液上清中的蛋白酶活可达到620 U.mL-1,高于出发菌株G4的BLG4酶活(240 U.mL-1).经SDS-PAGE分析,重组子pWT22-BLG4/WB600产生了一条分子质量约为30 ku的条带,该条带的大小与侧孢短芽孢杆菌G4上清发酵液中BLG4条带的大小一致.而未经IPTG诱导的重组子pWT22-BLG4和经IPTG诱导的WB600则未出现该条带.结果证明侧孢短芽孢杆菌G4的碱性蛋白酶基因BLG4已在枯草芽孢杆菌WB600中获得了成功表达.重组蛋白酶具有与侧孢短芽孢杆菌G4产生的BLG4蛋白酶同样的酶学性质.同时,重组蛋白酶具有明显的杀线虫和体壁降解能力,表明其在线虫生物防治中将有广泛的应用前景.

牛肉的外源性蛋白酶嫩化技术研究进展

牛肉嫩度是一项肉质评定的重要指标,也是消费者评判肉质优劣的最常用指标。外源性蛋白酶嫩化技术具有方法简单,条件要求相对低,能显著提高牛肉的品质等优点,且处理后的牛肉具有柔软、适口、多汁和易于咀嚼等特点,多年来一直受到肉类加工行业的重视,并已得到了广泛的研究和应用。本文主要论述了外源性蛋白酶对牛肉的嫩化机理和近年来在利用各类外源性蛋白酶嫩化处理牛肉的研究上取得的进展,以期为牛肉嫩化的研究提供参考。

菌源性胞外弹性蛋白酶应用特性研究

研究菌源性胞外弹性蛋白酶对弹性蛋白、明胶、酪蛋白、大豆分离蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白等的分解情况。表明菌源性胞外弹性蛋白酶对于弹性蛋白含量丰富的肉类有较强的水解力;对于较韧的肉类(牛肉、猪肉),其水解力可达59.9%,对于较嫩的肉类(鱼肉)水解力仅为22.8%。

红色毛癣菌分泌性蛋白酶的分析

分泌性蛋白酶是红色毛癣菌致病的潜在毒力因子。在构建红色毛癣菌6个不同时间段cDNA文库的基础上,共获得了9683条uniqueESTs,通过生物信息学分析从中得到了18个可能的分泌性蛋白酶的EST序列,包括4个分泌性肽酶、1个分泌性金属蛋白酶、2个细胞外丝氨酸蛋白酶、1个分泌性天冬氨酸蛋白酶、9个分泌性枯草杆菌蛋白酶样丝氨酸蛋白酶、1个空泡丝氨酸蛋白酶。这些分泌性蛋白酶在红色毛癣菌感染过程中可能分别与其获得营养、扩大侵袭范围及激起宿主免疫应答有关,这些结果为进一步研究红色毛癣菌感染和发病机制提供了重要的分子基础和线索。

pH值对白念珠菌分泌性蛋白酶产量的影响

随机选取20株白念珠菌,采用含不同pH值的牛血清白蛋白培养基(BSA)分别测定其分泌性蛋白酶产量,以研究pH值对白念珠菌分泌性蛋白酶产量的影响。pH值4.0时白念珠菌分泌性蛋白酶产量最高;pH值7.0时白念珠菌分泌性蛋白酶产量最低(P<0.01)。白念珠菌分泌性蛋白酶的产生与其生长培养基的pH值有关。

中性粒细胞性弹性蛋白酶与炎症性肺部疾病

中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)是由多形核中性粒细胞释放的弹性蛋白酶,在肺部炎症性疾病发病机制中,既有有利作用,又有不利作用,与体内NE-抗NE平衡有关。本文又综述了通过维持NE-抗NE平衡来治疗几种炎症性疾病的研究进展及目前存在的问题。

白念珠菌分泌性蛋白酶活力与其对氟康唑耐药性之间关系的研究

目的研究白念珠菌分泌性蛋白酶(Sap)活力与其对氟康唑耐药性之间的关系。方法将对氟康唑敏感的白念珠菌培养在含氟康唑浓度逐渐增加的液体培养基中,体外诱导为氟康唑耐药株;运用牛血清白蛋白培养基(BSA)的方法测定了对氟康唑敏感的白念珠菌和对氟康唑耐药的白念珠菌的分泌性蛋白酶活力。结果40株对氟康唑敏感的白念珠菌均在体外被成功的诱导成为对氟康唑耐药的耐药株。耐药株的分泌性蛋白酶活力明显强于敏感株(P<0.001)。结论白念珠菌Sap活力的增加与其对氟康唑耐药性增加是一致的。

阴道白念珠菌氟康唑敏感性与分泌性蛋白酶活力的相关性研究

目的探讨阴道白念珠菌对氟康唑敏感性与分泌性蛋白酶活力之间的关系。方法应用美国国家临床试验室标准化委员会(NCCLS)颁布的抗真菌药物敏感性试验方案(M27-A文件)检测自外阴阴道念珠菌病患者及携带者所分离的白念珠菌对氟康唑的体外最小抑菌浓度(MIC),将其分为敏感组、剂量依赖敏感组、耐药组三组。同时采用牛血清白蛋白培养基氨基黑染色法分别测定三组阴道白念珠菌的分泌性蛋白酶活力,然后对二者结果进行相关性分析。结果经线性回归及菌株分组间两两比较统计结果显示阴道白念珠菌对氟康唑的药物敏感性与其分泌性蛋白酶活力无显著相关性(r=0.004,P=0.979),三组阴道白念珠菌的分泌性蛋白酶活力之间无显著差异(P>0.05)。结论阴道白念珠菌对氟康唑的敏感性与分泌性蛋白酶活力可能为两个相互独立的因素。

血小板源性生长因子影响血管弹性蛋白酶表达

探讨球囊损伤后血管平滑肌细胞丝氨酸弹性蛋白酶表达增加的机理。用球囊导管损伤Wistar系雄性大鼠主动脉或颈总动脉。以血小板源性生长因子A和大鼠胰腺丝氨酸弹性蛋白酶的地高辛标记RNA探针进行原位杂交 ,并用抗 5 溴脱氧尿嘧啶抗体进行双重染色。用抗血小板源性生长因子AA、抗血小板源性生长因子BB、抗胰腺弹性蛋白酶、抗人增殖细胞核抗原等抗体进行免疫染色或免疫双重染色。电镜观察细胞的超微结构。结果发现 :①在球囊损伤后 0 .5～ 4h ,血小板源性生长因子mRNA表达细胞多于弹性蛋白酶mRNA表达细胞 ;②增殖细胞和迁移细胞既有血小板源性生长因子mRNA和其蛋白表达 ,又有弹性蛋白酶mRNA和其蛋白表达 ;③迁移细胞多为增殖细胞核抗原染色阳性 ,细胞内可见到核分裂像。提示血小板源性生长因子可能是刺激中膜平滑肌细胞增殖、迁移并使其弹性蛋白酶增加的影响因子之一。

凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)消化性蛋白酶的分布及种类

为探究凡纳滨对虾（Litopenaeus vannamei）消化性蛋白酶的分布及种类,文章采用偶氮酪蛋白（Azocasein）水解法检测p H值和温度对凡纳滨对虾肝胰腺、胃和肠道中总蛋白酶活力的影响及在30℃和最适p H值条件下消化蛋白酶的分布,并利用酶抑制剂实验（Inhibition assays）和含底物的十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（substrate-SDS-PAGE）法对消化性蛋白酶的种类进行对比分析。结果得到：肝胰腺、胃和肠道中消化性蛋白酶均在p H值8.5和温度50℃时蛋白酶比活力最大;对比三种消化腺蛋白酶的比活力得到肝胰腺〉胃〉肠道（P〈0.05）;酶抑制剂实验表明,一种丝氨酸蛋白酶抑制剂——PMSF对肝胰腺、胃和肠道中消化性蛋白酶表现出最强的抑制效果,抑制率分别为（79.43±0.58）%、（71.18±0.18）%和（71.72±1.37）%,抑制效果最差的为半胱氨酸蛋白酶抑制剂碘乙酰胺（IAM）;substrate-SDS-PAGE实验中发现三种消化腺中均至少发现含有8种分子量不同的蛋白酶,且以丝氨酸蛋白酶为主,分子量分别为～48.4、～32.5、～26.9、～25.2、～21.6、～19.8、～15.4、～13.6 kDa。

中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂在疾病中的作用

中性粒细胞衍生的弹性蛋白酶破坏组织、增加血管的通透性、促进中性粒细胞移行。中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂可以通过抑制中性粒细胞弹性蛋白酶活性减少组织损伤,此外,它还具有抗炎、调节免疫功能。近年来研究发现,它可以保护器官损伤,尤其是中性粒细胞介导的组织损害。现就中性粒细胞弹性蛋白酶抑制剂在些疾病中的作用做一综述。

猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子的原核表达及单克隆抗体制备

【目的】制备猪源分泌性白细胞蛋白酶抑制因子(SLPI)及其单克隆抗体,为建立猪源SLPI检测方法及其功能研究提供试验材料。【方法】将经串联的猪源SLPI基因克隆至pET-28a(+)、pGEX-6P-1载体构建重组表达载体;利用大肠杆菌表达系统表达重组蛋白,采用SDS-PAGE分析重组蛋白的诱导表达情况;重组菌经超声破碎以镍柱对重组蛋白进行纯化,并进行SDS-PAGE和Western blotting鉴定。用纯化后的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,经细胞融合制备杂交瘤细胞,采用间接ELISA筛选和鉴定所制备单克隆抗体和亚类,利用Western blotting及间接免疫荧光(IFA)方法鉴定单克隆抗体的特异性。【结果】试验成功构建了pGEX-6P-1-SLPI、pET-28a-SLPI重组质粒,获得纯度较高的His-SLPI、GST-SLPI重组蛋白,分子质量分别为27和50 ku,前者为包涵体表达,后者为可溶性表达;获得3株可稳定分泌抗猪SLPI单克隆抗体的杂交瘤细胞株,其中,9D10为IgG3亚类,9G11、10E2为IgG2b亚类;3株单克隆抗体均可与猪肠上皮细胞内的SLPI结合,9D10在细胞核中显示较强的荧光信号,而9G11、10E2在细胞浆和细胞核中均有荧光信号。【结论】本研究成功制备了重组His-SLPI和GST-SLPI蛋白,获得3株稳定分泌抗猪源SLPI单克隆抗体,特异性良好,为进一步研究猪源SLPI特性及其在黏膜免疫中的作用搭建技术平台。

基于胃蛋白酶耐受性的变性胶原蛋白定量分析方法

基于胶原蛋白的蛋白酶耐受性,建立变性胶原蛋白的定量分析方法。制备6组已知含量比的变性/非变性胶原蛋白混合样品,在液态胶原pH值约2.0的条件下,添加胃蛋白酶对样品中的变性胶原蛋白进行酶切,使其成为短肽,胃蛋白酶与胶原蛋白的质量比为1∶5,温度为30℃,消化24 h;然后采用NaCl沉淀法(NaCl终浓度为2 mol/L)对样品中的非变性胶原蛋白进行沉淀回收,并通过羟脯氨酸测定法检测其含量比。结果显示,6组样品中非变性胶原蛋白的回收率为89.96%~99.24%,表明本方法可以充分酶解变性胶原蛋白,而非变性胶原蛋白得以沉淀回收,可用于定量分析液态或海绵状、粉末状等酸溶性胶原蛋白原料和产品中变性胶原蛋白的含量比。

神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂在自发性脑出血患者中的表达与作用

目的 探讨自发性脑出血患者神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(NSP)的表达与其预后的关系。方法 选取发病24 h之内的自发性脑出血住院患者65例,用双抗体夹心酶联免疫分析法测定其入院次日血清NSP水平,收集患者的基线资料,所有患者随访至起病后3个月,并通过改良Rankin量表(mRS)评估神经功能恢复情况,将mRS≥2分者作为预后不良组(n=25),mRS<2分为预后良好组(n=37)。同时选择50例健康体检者为对照组。结果 脑出血组入院时NSP浓度较健康对照组明显升高(P<0.001)。对预后不同两组分析,入院时NIHSS评分、发病时收缩压水平、发病时有无意识障碍、脑出血量、入院时NSP浓度均存在统计学差异(P<0.05),预后良好组入院时NSP浓度高于预后不良组。对两组差异有统计学意义的指标进行Logistic回归分析显示,入院时NIHSS评分、脑出血量是影响自发性脑出血患者预后的独立因素,NSP浓度暂未得统计学意义,可能与样本量较小有一定关系。结论 自发性脑出血患者发病时NSP水平升高,对其预后可能有一定保护作用。

COPD患者急性加重期呼吸道分泌性白细胞蛋白酶抑制剂含量调节机制研究进展

慢性阻塞性肺疾病(COPD)患者稳定期呼吸道内分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)含量增加,急性加重期反而下降,这种现象以蛋白酶的反向调节、TGF-β1/Smads信号通路的下调、病原体多种机制参与SLPI含量的调控等假说为主,但确切机制尚未完全阐明。

分泌性白细胞蛋白酶抑制剂(SLPI)在前列腺癌组织中表达下调及意义

目的探讨分泌性白细胞蛋白酶抑制剂在不同前列腺组织中表达情况。方法运用半定量聚合酶链反应(RT-PCR)方法检测来源于正常前列腺(5例)、良性前列腺增生(BPH)及BPH细胞株(13例)、前列腺癌及前列腺癌细胞株(8例)的上皮细胞中SLPI mRNA表达水平;运用蛋白印迹方法(western blot)检测不同前列腺组织的上皮细胞中SLPI蛋白表达水平;免疫组化分析正常前列腺(20例)、良性前列腺增生(50例)、前列腺癌(103例)组织中SLPI表达水平。根据染色强度及阳性率,分为四个等级,进行分析。结果SLPI mRNA水平在肿瘤上皮中下调表达,在正常组织和良性前列腺增生组织中未发现表达差异。Western blot结果提示SLPI在前列腺肿瘤上皮中表达下调。免疫组化证实SLPI在前列腺肿瘤中表达低于良性前列腺组织,SLPI表达水平在正常前列腺组织和良性增生前列腺组织中差异无显著性。结论SLPI在前列腺肿瘤组织中表达下调,提示SLPI在前列癌的发生和进展中可能扮演一定角色。

分泌性白细胞蛋白酶抑制因子在结肠癌中的表达及其临床意义

目的探讨结肠癌组织中白细胞蛋白酶抑制因子（SLPI）的表达及其临床意义。方法选择150例结肠癌及癌旁正常组织制成微阵列芯片作为研究对象，用免疫组织化学方法检测组织芯片中SLPI蛋白表达并评分，采用f检验比较不同SLPI表达水平和结肠癌临床病理f生特征，包括年龄、性别、组织分化程度、TNM分期、淋巴结转移及远处转移之间的关系。结果SLPI在结肠癌组织中相对于正常结肠组织高表达，SLPI蛋白高表达与肿瘤分化[低分化：8（42．1％）”s11（57．9％）；中腐分化：3（2．3％）w128（97．7％）、TNM分期：[Ⅲ～Ⅳ：25（29．4％）口s60（70．6％）]、Ⅰ～Ⅱ：2（3．1％）郴63（96．9％）、淋巴结转移[18（28．6％）w45（71．4％）]及远处转移[11（84．6％）傩2（15．4％）]相关（P〈O．05），而与患者的性别和年龄差异无统计学意义（P〉0．05）。结论SLPI表：g_Jk平与肿瘤分化程度、TNM分期、淋巴结转移及远处转移有关，有可能作为判断结肠癌患者预后的指标。

蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体基因的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

AX15是一种比天然睫状神经营养因子具有更高的生物学活性、更好的稳定性和可溶性的hCNTF突变体。在巴斯德毕赤酵母中表达时AX15易发生降解。氨基酸序列分析表明降解位于由 12和 13位氨基酸残基组成的双碱性氨基酸之后。根据KEX2蛋白酶的底物专一性把双碱性氨基酸从RR变为RK ,构建了KEX2抗性的AX15突变体AX15 (R13K)。AX15 (R13K)的稳定性得到了显著的提高 ,在诱导 10 0h后也未发生降解。利用超滤浓缩和凝胶过滤得到了纯度 >90 %的AX15 (R13K)。TF 1细胞存活实验表明AX15 (R13K)具有与AX15相同的生物学活性。蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体可能具有更好的体内稳定性 ,在临床应用上具有潜在的优势。

神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂在大鼠小胶质细胞缺氧／复氧模型上的作用

目的探讨神经源性丝氨酸蛋白酶抑制剂(neuroserpin,NSP)是否可以改变组织型纤溶酶原激活物(tissueplasminogen activator,tPA)对于小胶质细胞(microglia,MG)活化的影响。方法体外原代培养的大鼠皮层MG并鉴定。建立缺氧-复氧模型并鉴定。首先,使用ELISA试剂盒测定MG在缺氧/复氧(hypoxia/reoxygenation,H/R)状态下自身释放tPA的含量,细胞被分为正常组、PBS对照组和OGD3h复氧不同时间组(1、3、5、7、24 h)。其次,研究NSP在MG缺氧/复氧时的作用,本部分实验分3组,分别为缺氧/复氧干预组、tPA干预组及tPA+NSP干预组。以上各组均设3个复孔,实验重复3次。采用倒置相差显微镜直接观察盖玻片上细胞形态学变化,CCK-8法检测各组间细胞增殖率,ELISA试剂盒测定IL-1β和NO含量。结果 MG在H/R时合成tPA,OGD3h复氧3h时释放量最多。H/R时MG激活,炎性因子IL-1β和NO的释放增多。tPA干预MG后,细胞活化并增殖、IL-1β和NO的释放增多。各NSP预处理组细胞活化、增殖和炎性因子的释放增多均没有tPA或H/R干预组明显。结论 MG在H/R时合成tPA。H/R早期即诱发了MG的活化。tPA可以进一步诱发MG的增殖和活化。H/R和tPA的干预均引起IL-1β和NO的释放。NSP可减轻H/R和tPA干预引起的MG活化和增殖,减少MG中IL-1β和NO的释放。