基于功能化适配体与双重恒温扩增反应的荧光传感技术用于中药材中黄曲霉毒素的超灵敏检测研究

目的 建立一种基于功能化适配体与双重恒温扩增反应结合的荧光传感技术,对中药材中黄曲霉毒素进行精准检测。方法 通过可行性分析,验证双重恒温扩增反应和本传感器的理论正确性与实验准确度;对Vent(exo^(-))DNA聚合酶浓度、Nt.BstNBI切口酶浓度、反应时间进行实验条件优化,以提高检测的灵敏度;在最佳反应条件下建立标准曲线,确定检测范围;检测多种毒素,以验证本方法的特异性;通过与商品化试剂盒检测范围比较,研究该方法的优越性;检测多种中药饮片中的黄曲霉毒素,探究该方法在实际样品中的应用潜力。结果 最佳反应条件是Vent(exo^(-))DNA聚合酶浓度为0.06 U·μL^(-1)、Nt.BstNBI切口酶浓度为0.2 U·μL^(-1)、反应时间为75 min。标准曲线为Y=1141.6162X+4271.1145(R^(2)=0.9935),检测范围为0.02 ng·mL^(-1)至10.00 ng·mL^(-1)。该方法对黄曲霉毒素响应好,其他4种无关毒素无荧光响应。商品化试剂盒检测的标准曲线为Y=2.2768X+0.4594(R^(2)=0.9818),检测范围为0.1 ng·mL^(-1)至1.0 ng·mL^(-1),对12种中药饮片中黄曲霉毒素的检出率为41.67%;该方法对黄曲霉毒素的检出率为50%。结论 该法的灵敏度高、特异性强,比商品化试剂盒的检测范围更宽、检测限低,且检测结果基本一致,具备较强的实际应用能力、更大的应用潜力。

恒温扩增反应检测在检测非小细胞肺癌EGFR基因突变中的应用

目的:探讨恒温扩增反应检测在检测非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变中的应用价值.方法:选取存在EGFR基因外显子19或外显子21突变的10例非小细胞肺癌患者作为研究对象.设计重组酶恒温扩增反应专用特异性引物,对上述患者组织样本中的已知突变位点进行扩增检测,并将检测的结果与实际情况进行比对.建立突变比例检测模型,观察用恒温扩增反应检测法检测这些患者EGFR基因突变的敏感度.结果:这些患者中5例EGFR基因外显子19缺失突变患者及5例EGFR基因外显子21单碱基突变患者EGFR基因恒温扩增反应检测的结果与实际情况一致.在其突变基因占正常基因的比例为0.005%时,仍能够采用恒温扩增反应检测法成功检测出其突变基因的外显子.结论:恒温扩增反应检测在检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变中的应用价值较高.

基于毛细管电泳的环介导恒温扩增技术检测方法研究

以大肠杆菌（E.coli）为对象,采用环介导恒温扩增技术（LAMP）对其扩增,在实验室自制的毛细管电泳-诱导荧光平台上建立了LAMP产物的检测新方法。引物F3,B3,FIP,BIP扩增的E.coli LAMP产物大小为240 bp。优化的毛细管电泳条件为：毛细管有效长度/总长度（10 cm/15 cm）,筛分介质溶液为0.5%羟乙基纤维素（1 300 K）,电场强度（100 V/cm）,进样条件（100 V/cm,1.0 s）。毛细管电泳时,DNA长度在100~500 bp范围内与其迁移时间呈线性关系,相关系数为0.996。在相同毛细管电泳条件下对E.coli LAMP产物进行分析,并利用这种线性关系在电泳图中对E.coli LAMP产物与假阳性产物做区分,结果表明,毛细管电泳技术不仅可在15 min内实现LAMP产物及附加产物的快速检测,而且可快速区分LAMP阳性及假阳性实验产物。采用建立的毛细管电泳快速检测LAMP产物的方法,对AB0174 E.coli基因实施了LAMP,结果表明该方法适合DNA LAMP产物的快速检测。

基于恒温指数扩增反应高灵敏度检测端粒酶活性

端粒酶延伸产物是具有(ggttag)n重复序列的DNA.设计1条与2个重复序列相匹配的特异性的DNA探针-(ctaacc)2使其与端粒酶延伸产物杂交,形成双链DNA.过量的DNA探针被磁性石墨烯吸附,通过磁分离去除.利用恒温指数扩增反应(IEXPAR)对端粒酶延伸产物捕捉的DNA探针进行快速的扩增.用与双链DNA特异性结合的SYBR Green I染料对扩增产物进行实时荧光检测.在优化条件下,可以检测到低至50个癌细胞中的端粒酶活性.实现了恒温扩增条件下端粒酶活性的高灵敏度检测.

基于DNA“Y”型结构的指数型核酸恒温扩增策略检测microRNA

该文基于“Y”型DNA模板和恒温指数扩增反应(EXPAR)技术的信号放大功能,建立了一种快速低序列依赖性的miRNA检测方法(Y-EXPAR)。以let-7b为检测目标,设计两条部分互补的DNA模板,与目标miRNA共同构成“Y”型结构,能够同时进行双向扩增,反应效率高,反应时间短,并降低了放大性能对模板序列的依赖。方法检出限低至0.3 amol/L(相当于10μL溶液中有1.8拷贝的let-7b),并能区分单碱基差异的let-7家族同源序列。应用于肿瘤细胞裂解液let-7b的检测,POI值与细胞数目对数值呈线性关系,说明Y-EXPAR在实际样品miRNA的检测中具有优势。得益于扩增的高特异性、抗干扰性和低序列依赖性,该方法为miRNA的快速检测提供了新思路,在miRNA相关的疾病研究和临床诊断方面具有良好应用前景。

马铃薯PLRV的RT-LAMP检测方法的构建

为了建立高效、便捷且成本较低的检测方法以应用于马铃薯卷叶病毒(Potato leaf roll virus,PLRV)检疫防控工作,本研究构建了PLRV的逆转录环介导恒温扩增反应(Reverse transcription loop-mediated isothermal amplification,RT-LAMP)检测方法。结果表明:本研究构建的马铃薯PLRV的RT-LAMP检测方法,最低检测下限为10 copies/mL,与PVX、PVM、PVV、PVS、CMV等其他马铃薯病毒无交叉反应,具有良好的特异性,为马铃薯病毒检测技术应用奠定一定基础。