基于恒温指数扩增反应高灵敏度检测端粒酶活性

端粒酶延伸产物是具有(ggttag)n重复序列的DNA.设计1条与2个重复序列相匹配的特异性的DNA探针-(ctaacc)2使其与端粒酶延伸产物杂交,形成双链DNA.过量的DNA探针被磁性石墨烯吸附,通过磁分离去除.利用恒温指数扩增反应(IEXPAR)对端粒酶延伸产物捕捉的DNA探针进行快速的扩增.用与双链DNA特异性结合的SYBR Green I染料对扩增产物进行实时荧光检测.在优化条件下,可以检测到低至50个癌细胞中的端粒酶活性.实现了恒温扩增条件下端粒酶活性的高灵敏度检测.

实时荧光核酸恒温扩增试验和定量反转录-聚合酶链反应对血清乙型肝炎病毒RNA定量检测的一致性评价

为评价实时荧光核酸恒温扩增试验(simultaneous amplification testing,SAT)与定量反转录-聚合酶链反应(quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction,qRT-PCR)检测血清样本中乙型肝炎病毒(hepatitis B virus,HBV)RNA的相关性与一致性,本研究收集了在复旦大学附属公共卫生临床中心就诊的212例患者的血清样本,其中慢性乙型肝炎(chronic hepatitis B,CHB)患者HBV DNA≥100 IU/mL 81例、HBV DNA<100 IU/mL 76例,以及作为对照的非HBV感染患者55例。采用SAT和qRT-PCR方法分别检测所有血清样本中的HBV RNA,对检测结果进行统计学分析。在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中,SAT和qRT-PCR的HBV RNA阳性检出率均为95.06%(77/81)。2种方法具有较好的相关性与一致性(R 2=0.803和CCC=0.882)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.1 log copies/mL,相对偏倚为0.97%。配对t检验显示,结果无统计学差异(t=1.617,P=0.110)。在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者血清样本中,HBV RNA阳性检出率不同,SAT为98.68%(75/76),qRT-PCR为88.16%(67/76),2种方法相关性与一致性较差(R 2=0.326和CCC=0.438)。Bland Altman分析显示绝对偏倚为0.5 log copies/mL,相对偏倚为0.86%。配对t检验显示,结果有统计学差异(t=3.654,P<0.001)。在非HBV感染对照患者中,SAT和qRT-PCR均未检出HBV RNA阳性。结果提示,在HBV DNA≥100 IU/mL的CHB患者中应用SAT与qRT-PCR检测血清HBV RNA,其相关性与一致性较好,在HBV DNA<100 IU/mL的CHB患者中相关性与一致性存在一定差异。

双重荧光逆转录-聚合酶链式反应与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒

目的建立双重荧光逆转录-聚合酶链式反应(reverse transcription polymerase chain reaction,RT-PCR)与荧光逆转录-重组酶介导等温扩增(reverse transcription recombinase-aided amplification,RT-RAA)快速有效地检测食品中食源性GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的方法。方法根据GⅠ型、GⅡ型诺如病毒基因组保守序列设计引探,经过一系列引探浓度筛选,建立了双重荧光RT-PCR和恒温荧光RT-RAA两种检测方法,分别从敏感性、特异性、稳定性、重复性等方面进行了比较研究;同时将这两种方法应用于实际临床样本检测中,并与GB4789.42—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验诺如病毒检验》进行比对验证。结果建立的两种方法特异性良好,敏感性均可达10 copies/μL;双重荧光RT-PCR方法质粒梯度变异系数(coefficient of variation,CV)值在0.1%~1.5%区间,恒温荧光RT-RAA方法CV值在1.0%~10.0%区间,稳定性和重复性显示双重荧光RT-PCR优于恒温荧光RT-RAA检测方法;31份诺如病毒阳性食品核酸样本均能检出,且50份食品盲样检测结果与国标一致。结论本研究成功建立了双重荧光RT-PCR与恒温荧光RT-RAA快速检测食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒方法,两种方法各有优缺点,双重荧光RT-PCR稳定性和重复性好,恒温荧光RT-RAA检测时间短,仅20 min就能完成扩增,可根据不同需求选择一种或两种作为食源性GⅠ型、GⅡ型诺如病毒的检测方法。

基于DNA“Y”型结构的指数型核酸恒温扩增策略检测microRNA

该文基于“Y”型DNA模板和恒温指数扩增反应(EXPAR)技术的信号放大功能,建立了一种快速低序列依赖性的miRNA检测方法(Y-EXPAR)。以let-7b为检测目标,设计两条部分互补的DNA模板,与目标miRNA共同构成“Y”型结构,能够同时进行双向扩增,反应效率高,反应时间短,并降低了放大性能对模板序列的依赖。方法检出限低至0.3 amol/L(相当于10μL溶液中有1.8拷贝的let-7b),并能区分单碱基差异的let-7家族同源序列。应用于肿瘤细胞裂解液let-7b的检测,POI值与细胞数目对数值呈线性关系,说明Y-EXPAR在实际样品miRNA的检测中具有优势。得益于扩增的高特异性、抗干扰性和低序列依赖性,该方法为miRNA的快速检测提供了新思路,在miRNA相关的疾病研究和临床诊断方面具有良好应用前景。

实时荧光核酸恒温扩增技术和实时荧光定量聚合酶链反应检测解脲脲原体的效果比较

目的比较实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)和实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)在解脲脲原体(UU)检测中的效果,以选择更为准确和快速的临床检验方法。方法选择2018年1月—2020年1月在福建中医药大学附属福鼎医院就诊的89例临床疑似UU感染患者作为研究对象,同时使用SAT和qRT-PCR检测所有患者尿液和分泌物样本。比较两种方法的阳性检出率、敏感度、特异度、准确度。结果SAT的阳性检出率明显高于qRT-PCR〔69.7%(62/89)比51.7%(46/89),P<0.05〕;SAT和qRT-PCR检测的敏感度分别为100.0%、78.0%,特异度分别为90.0%、100.0%,准确度分别为96.6%、85.4%,阳性预测值分别为95.2%,100.0%;阴性预测值分别为100.0%、69.8%。结论SAT对疑似UU感染的标本检测阳性率较高,有助于快速、准确筛查,值得临床推广。

痰液标本结核分支杆菌RNA恒温扩增检测及临床应用

目的探讨实时荧光核酸恒温扩增检测法(SAT)在肺结核患者实验诊断中的应用。方法设计特异性引物和探针,建立并优化SAT检测体系,对131例临床确诊并接受治疗的肺结核患者、73例非结核性肺部感染者痰液标本中的结核分支杆菌(TB)RNA进行检测,并与PCR法检测TB DNA,痰培养法、痰涂片抗酸染色法检测TB的结果进行比较。结果 131例肺结核患者痰液标本中,SAT对TB检出率为52.67%,高于痰培养法(39.69%,P=0.035)和痰涂片抗酸染色法(35.11%,P=0.004);以PCR法为参考标准,SAT的灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值依次是95.38%、90.91%、91.18%、95.24%。结论 SAT检测痰液标本中TB RNA灵敏度高,特异性强,操作简便、快速,具有临床推广应用价值。

非洲猪瘟病毒环介导恒温扩增快速检测技术的建立及应用

本研究基于非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)vp72基因设计引物,建立了能够快速检测非洲猪瘟病毒的环介导恒温扩增技术(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)。将LAMP与OIE参考的PCR检测方法进行比较,并且应用LAMP对非洲猪瘟参考实验室提供的非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组以及国内收集的50份猪的基因组、30份蜱的基因组进行检测。结果显示,本研究设计的引物具有良好的特异性和敏感性,所建立的LAMP能够成功扩增非洲猪瘟病毒17个毒株的基因组,而野外收集的猪和蜱的基因组检测均为阴性。因此,本研究所建立的方法能够用于非洲猪瘟的快速诊断以及防控。

实时荧光核酸恒温扩增技术检测尿液中淋球菌的分析

目的评价实时荧光核酸恒温扩增技术(SAT)检测淋球菌(NG)的特异性和敏感性。方法对218例疑似患者生殖道拭子行SAT,PCR和NG培养检测,同时对对应的218份尿液标本行SAT检测。结果 SAT平行检测同一来源的拭子标本和尿液标本,检测结果完全一致。与NG培养法相比,SAT对尿液/拭子标本的检测灵敏度为100.00%,特异性为99.27%;与PCR法相比,SAT对尿液/拭子标本的检测灵敏度为100.00%,特异性为97.08%。SAT法对拭子标本和尿液标本检测结果的符合率为100.00%,经卡方检验,差异无显著性(χ2=0,P>0.05)。结论 SAT技术检测拭子及尿液中的NG具有很高的灵敏度和特异性,与NG培养相比耗时短,与PCR相比其可用于判愈,防止过度治疗。为NG的实验室诊断提供新的检测方法。

恒温扩增反应检测在检测非小细胞肺癌EGFR基因突变中的应用

目的:探讨恒温扩增反应检测在检测非小细胞肺癌患者表皮生长因子受体(EGFR)基因突变中的应用价值.方法:选取存在EGFR基因外显子19或外显子21突变的10例非小细胞肺癌患者作为研究对象.设计重组酶恒温扩增反应专用特异性引物,对上述患者组织样本中的已知突变位点进行扩增检测,并将检测的结果与实际情况进行比对.建立突变比例检测模型,观察用恒温扩增反应检测法检测这些患者EGFR基因突变的敏感度.结果:这些患者中5例EGFR基因外显子19缺失突变患者及5例EGFR基因外显子21单碱基突变患者EGFR基因恒温扩增反应检测的结果与实际情况一致.在其突变基因占正常基因的比例为0.005%时,仍能够采用恒温扩增反应检测法成功检测出其突变基因的外显子.结论:恒温扩增反应检测在检测非小细胞肺癌患者EGFR基因突变中的应用价值较高.

实时荧光核酸恒温扩增技术在解脲脲原体检测中的应用

目的应用实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)对不孕不育症患者的泌尿生殖道拭子及尿液进行解脲脲原体(UU)检测,并评价其敏感性和特异度。方法对452例不孕不育症患者的泌尿生殖道拭子标本,采用SAT检测法、培养法、荧光定量聚合酶链反应(PCR)进行UU检测,同时再对同一患者的尿液标本进行SAT检测,根据实验结果评估SAT在拭子及尿液标本UU检测中的灵敏度和特异度;同时UU培养阳性的标本经过临床UU规范治疗后,仍采用上述方法对患者进行UU复查,根据实验结果评估SAT在UU检测中的判断预后效果。结果初检时与UU培养结果作比较,UU-SAT拭子标本的检测灵敏度为97.1%(170/175),特异度为97.8%(271/277),差异无统计学意义(χ2=0.010 2,P=0.919 7);UU-SAT尿液标本的检测灵敏度为96.0%(168/175),特异度为98.9%(274/277),差异无统计学意义(χ2=0.163 5,P=0.686 0)。结论 SAT检测泌尿生殖道患者拭子及尿液UU检测具有很高的灵敏度和特异性,同时又有很好的判愈效果,为UU的临床实验室诊断提供了新的检测手段。

基于毛细管电泳的环介导恒温扩增技术检测方法研究

以大肠杆菌（E.coli）为对象,采用环介导恒温扩增技术（LAMP）对其扩增,在实验室自制的毛细管电泳-诱导荧光平台上建立了LAMP产物的检测新方法。引物F3,B3,FIP,BIP扩增的E.coli LAMP产物大小为240 bp。优化的毛细管电泳条件为：毛细管有效长度/总长度（10 cm/15 cm）,筛分介质溶液为0.5%羟乙基纤维素（1 300 K）,电场强度（100 V/cm）,进样条件（100 V/cm,1.0 s）。毛细管电泳时,DNA长度在100~500 bp范围内与其迁移时间呈线性关系,相关系数为0.996。在相同毛细管电泳条件下对E.coli LAMP产物进行分析,并利用这种线性关系在电泳图中对E.coli LAMP产物与假阳性产物做区分,结果表明,毛细管电泳技术不仅可在15 min内实现LAMP产物及附加产物的快速检测,而且可快速区分LAMP阳性及假阳性实验产物。采用建立的毛细管电泳快速检测LAMP产物的方法,对AB0174 E.coli基因实施了LAMP,结果表明该方法适合DNA LAMP产物的快速检测。

恒温扩增技术在分子诊断中的应用

聚合酶链反应(PCR)技术是近年来广泛应用于科学研究和临床检验的一项技术。目前传统的PCR技术中核酸的扩增存在效率不高且需要专用的仪器设备等缺陷,而恒温扩增技术由于引物种类多样,检测方法多变,从而克服了传统PCR核酸扩增技术的缺点,使其越来越多地被应用于分子诊断中。经国内外学者的研究证实,恒温扩增技术有着广泛的应用前景,现着重对恒温扩增技术予以综述。

RNA实时荧光恒温扩增技术在儿童支原体肺炎中的治疗效果及意义

目的寻找评价儿童支原体肺炎治疗效果的有效方法。方法收集72例利用血清支原体抗体检测法确诊为儿童支原体肺炎的患者,平均年龄(5.7±2.8)岁,给予同剂量阿奇霉素进行治疗。使用RNA实时荧光恒温扩增技术(SAT)检测治疗前后超敏C反应蛋白(CRP)和血清乳酸脱氢酶(LDH)的差异。结果相对于治疗前,治疗后CRP、LDH明显降低(P<0.05),随着SAT转阴时间的延长,CRP、LDH水平逐渐升高(P<0.05);相对于治疗前最大呼气流量(PEF)和1秒用力呼气容积(FEV1),治疗后PEF明显改善,两组数据分别比较均具有显著性差异(P<0.01)。结论 SAT和血清LDH、CRP联合检测,对临床诊断支原体肺炎演变和发展具有重要意义。

RNA恒温扩增实时检测技术联合荧光定量PCR技术对痰涂片阴性肺结核患者的诊断价值分析

目的研究核糖核酸(RNA)恒温扩增实时检测技术和荧光定量聚合酶链式反应(PCR)技术联合应用于痰涂片阴性肺结核患者诊断中的临床价值。方法80例痰涂片阴性肺结核患者,在治疗前分别采用RNA恒温扩增实时检测技术、荧光定量PCR技术、两项技术联合方式对肺泡灌洗液标本进行检测。比较三种检测方法的阳性率、操作时间、确诊时间、住院时间、满意度。结果联合检测阳性率96.25%高于RNA恒温扩增实时检测技术的75.00%、荧光定量PCR技术的78.75%,差异有统计学意义(P<0.05)。RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR技术检测的阳性率比较,差异无统计学意义(P>0.05)。联合检测操作时间(42.19±8.10)min长于RNA恒温扩增实时检测技术的(28.16±5.08)min、荧光定量PCR技术的(26.73±6.95)min,确诊时间(1.68±0.35)h、住院时间(10.27±2.55)d短于RNA恒温扩增实时检测技术的(4.24±0.46)h、(19.76±2.51)d及荧光定量PCR技术的(4.69±0.72)h、(18.20±2.68)d,差异有统计学意义(P<0.05)。RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR技术的操作时间、确诊时间、住院时间比较,差异无统计学意义(P>0.05)。联合检测的总满意度为96.25%,高于RNA恒温扩增实时检测技术的78.75%与荧光定量PCR技术的82.50%,差异有统计学意义(P<0.05)。RNA恒温扩增实时检测技术与荧光定量PCR技术的总满意度比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论RNA恒温扩增实时检测技术和荧光定量PCR技术联合应用于痰涂片阴性肺结核诊断,可缩短确诊时间,提高患者满意度,值得临床应用。

核酸恒温扩增技术在生物分析检测中的应用

近年来,研究人员致力于发展高效、灵敏检测生物大分子的分析方法,以满足生物分析领域对其越来越高的要求。逐渐发展成熟地核酸恒温扩增技术可实现对生物大分子的高灵敏检测,已经成为生物分析领域研究的重点。因此,本论文根据已开发的核酸恒温扩增技术在生物大分子领域的研究进行综述。

实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测解脲脲原体的临床价值分析

目的探讨实时荧光核酸恒温扩增检测技术(SAT)检测解脲脲原体(UU)的临床价值。方法选取2018年5月至2020年5月于本院就诊的疑似泌尿生殖道感染患者80例,采集所有受检者的尿道/宫颈口拭子及尿样标本,分别采用液体培养法、实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)法、SAT法检测拭子标本中UU阳性表达情况,以液体培养法结果为金标准,评估SAT技术在UU检测中的临床价值。结果液体培养法结果显示,80例患者中31例(38.75%)UU检测呈阳性,49例(61.25%)UU检测呈阴性;31例UU阳性患者中SAT(拭子)检出29例,检出率为93.55%,SAT(尿样)检出27例,检出率为87.10%,qRT-PCR检出28例,检出率为90.32%;3种检测方法检测UU阳性表达情况比较差异无统计学意义。SAT(拭子)、SAT(尿样)、q RT-PCR检测UU的灵敏度、特异度、误诊率、漏诊率、正确指数比较差异无统计学意义。结论实时荧光核酸恒温扩增检测技术检测解脲脲原体具有较高的灵敏度、特异度,且取材方便、检测快速、污染较低、结果准确,值得临床推广应用。

核酸扩增技术在动物源性食品掺假中的研究进展

核酸扩增技术是一种在体外快速扩增特定DNA片段的分子生物学技术,目前已广泛应用于传染病检测、生物勘测、食品安全检测、临床诊断和公共卫生监测等研究领域。其中,食品安全领域的问题日渐成为人们关注的焦点,尤其是动物源性食品掺假的现象屡禁不止。在过去的科学研究中,动物源性食品掺假的核酸扩增技术发展迅速,取得了很大进展。该文就核酸扩增技术中的凝胶电泳PCR、实时荧光定量PCR、数字液滴PCR、环介导等温扩增、交叉引物扩增、滚环扩增、重组酶聚合酶扩增等技术的原理及在动物源性食品掺假检测中的应用进行综述。讨论了各类核酸扩增技术的关键优势和局限性,简要介绍了现有的挑战和进一步的研究进展,旨在为动物源性食品掺假核酸扩增技术的发展指明方向。

全血改进线性指数聚合酶链式反应用于焦磷酸测序检测基因多态性

焦磷酸测序是目前基因多态性检测的主要方法之一,但是其前期的样本制备工作较为繁琐,限制了其在临床检测中的应用。为了简化焦磷酸测序的流程,本研究根据不对称PCR原理,改进了线性指数聚合酶链式反应(LATE-PCR)的引物设计方法,增加过量引物的长度和浓度,并结合全血直接扩增技术,建立了基于普通r Taq聚合酶和高p H缓冲液(Hp H Buffer)的全血改进LATE-PCR(Improved LATE-PCR,im LATE-PCR)方法。考察了方法的最优扩增体系、血液抗凝剂对其影响以及全血模板量。采用单管、一步法直接扩增出单链测序模板,成功地对24例临床血样的乙醇脱氢酶基因多态性进行了检测,检测结果可用于指导临床个体化用药。24例样本的基因型分别为ADH1B位点AA纯合6例、AG杂合14例、GG纯合4例;ADH1C位点GG纯合20例、AG杂合4例、AA纯合0例。

基于功能化适配体与双重恒温扩增反应的荧光传感技术用于中药材中黄曲霉毒素的超灵敏检测研究

目的 建立一种基于功能化适配体与双重恒温扩增反应结合的荧光传感技术,对中药材中黄曲霉毒素进行精准检测。方法 通过可行性分析,验证双重恒温扩增反应和本传感器的理论正确性与实验准确度;对Vent(exo^(-))DNA聚合酶浓度、Nt.BstNBI切口酶浓度、反应时间进行实验条件优化,以提高检测的灵敏度;在最佳反应条件下建立标准曲线,确定检测范围;检测多种毒素,以验证本方法的特异性;通过与商品化试剂盒检测范围比较,研究该方法的优越性;检测多种中药饮片中的黄曲霉毒素,探究该方法在实际样品中的应用潜力。结果 最佳反应条件是Vent(exo^(-))DNA聚合酶浓度为0.06 U·μL^(-1)、Nt.BstNBI切口酶浓度为0.2 U·μL^(-1)、反应时间为75 min。标准曲线为Y=1141.6162X+4271.1145(R^(2)=0.9935),检测范围为0.02 ng·mL^(-1)至10.00 ng·mL^(-1)。该方法对黄曲霉毒素响应好,其他4种无关毒素无荧光响应。商品化试剂盒检测的标准曲线为Y=2.2768X+0.4594(R^(2)=0.9818),检测范围为0.1 ng·mL^(-1)至1.0 ng·mL^(-1),对12种中药饮片中黄曲霉毒素的检出率为41.67%;该方法对黄曲霉毒素的检出率为50%。结论 该法的灵敏度高、特异性强,比商品化试剂盒的检测范围更宽、检测限低,且检测结果基本一致,具备较强的实际应用能力、更大的应用潜力。