4种猪腹泻病毒恒温隔绝式荧光RT-PCR检测方法的建立及应用

为鉴别猪流行性腹泻病毒(PEDV)、猪传染性胃肠炎病毒(TGEV)、猪轮状病毒(PoRV)和猪德尔塔冠状病毒(PDCoV)这4种猪主要腹泻病毒,本研究分别针对PEDV M基因、TGEV M基因、PoRV NSP5基因、PDCoV M基因设计特异性引物和探针,经过方阵法优化恒温隔绝式荧光RT-PCR(iiRT-PCR)反应条件,建立了检测这4种猪腹泻病毒iiRT-PCR方法。用建立的iiRT-PCR方法分别检测PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV、猪瘟病毒(CSFV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、日本脑炎病毒(JEV),并对iiRT-PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳,结果显示该方法特异性强,对PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的检测下限分别为10^(2)、10^(2)、10^(3)、10^(3)TCID_(50)/mL,并具有良好的组内和组间重复性;而荧光定量PCR方法的检测下限分别为10^(1)、10^(2)、10^(2)、10^(2)TCID_(50)/mL,敏感性略高于iiRT-PCR。2种方法对22份临床样品的检测结果符合率为100%,PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV阳性率分别为40.91%、9.09%、45.45%、9.09%,其中PEDV与PoRV混合感染率为18.18%,PDCoV与PoRV混合感染率为4.55%。本研究建立的iiRT-PCR为临床现场检测4种猪腹泻病毒提供了一种简便快速的方法。

检测牛副流感病毒3型恒温隔绝式荧光RT-PCR方法的建立及应用

牛副流感病毒3型(bovine parainfluenza virus type 3,BPIV3)是引起牛呼吸道疾病综合征(bovine respiratory disease syndrome,BRDC)的重要病原,为建立一个基于恒温隔绝式RT-PCR(insulated isothermal RT-PCR,iiRT-PCR)的方法实现现场检测BPIV3,本研究根据BPIV3 P基因的保守区域,设计合成引物和探针、优化检测体系和预混检测试剂,成功建立了能够检测BPIV3 A,B和C 3种基因型的iiRT-PCR方法。该方法只能特异性检出BPIV3,而对牛冠状病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛传染性鼻气管炎病毒、牛腺病毒3型、牛鼻病毒、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌和牛支原体等无关病原不检出。敏感性试验结果显示该方法对构建的重组质粒阳性标准品的检测下限为4.23 copies/μL。重复性结果显示,批内和批间的变异系数分别为1.37%~1.73%和2.16%~2.58%。采用建立的iiRT-PCR方法和报道的2种TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法对2020-2021年采集自我国内蒙古、河南、宁夏、山西、四川和福建6个省的141份患BRDC肉牛鼻腔棉拭子样本和50份患BRDC牦牛肺脏样本进行检测,iiRT-PCR方法自肉牛样本中检出55份BPIV3阳性(阳性率为39.01%),自牦牛样本中检出22份BPIV3阳性(阳性率为44.00%),而2种TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法自肉牛样本中分别检出40份和48份BPIV3阳性(阳性率为28.39%和34.04%),自牦牛样本中分别检出15份和19份BPIV3阳性(阳性率为30.00%和38.00%),iiRT-PCR检测结果优于2种TaqMan-MGB荧光定量RT-PCR方法。将优化的各检测试剂预混后配合使用商品化PetNAD核酸萃取试剂盒,获得检测结果仅需1 h,可实现BPIV3的现场检测。本研究丰富了国内BPIV3的分子流行病学调查资料,并为BRDC的诊断和防控提供了有力的工具。

牛传染性鼻气管炎病毒恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

为建立检测牛传染性鼻气管炎病毒(IBRV)的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)方法,本研究采用文献报道的引物和探针,通过优化反应体系,首次建立了检测IBRV核酸的iiPCR方法。结果显示该方法仅特异性检测出IBRV,而对牛病毒性腹泻-黏膜病病毒、牛副流感3型病毒、牛呼吸道合胞体病毒、牛腺病毒3型、牛冠状病毒、牛支原体、多杀性巴氏杆菌和溶血性曼氏杆菌等病原则不能检出。该方法的检测下限为2.4拷贝/μL质粒标准品,并具有良好的重复性。对临床样品的检测结果与OIE推荐的荧光定量PCR方法的检测结果一致;该方法配合PetNAD核酸萃取试剂盒,从核酸提取到报告检测结果仅需1h,具有操作简便、快速、可现地化的特点。对9个省29份商品化冻精检测结果显示,IBRV阳性率为24%(7/29),表明我国流通的商品化冻精携带IBRV情况普遍。本研究为IBRV的现地检测提供了一个可靠的方法。

恒温隔绝式荧光PCR检测非洲猪瘟病毒核酸方法的建立

恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)是一种简便、快速及可使用于现场检测的荧光PCR方法。本研究采用农业农村部推荐的检测非洲猪瘟病毒(African swine fever virus,ASFV)核酸的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过对引物、探针、Taq酶等反应体系的优化,建立了基于恒温隔绝式荧光PCR的ASFV检测方法。所建立的方法可特异性检出ASFV核酸,对猪常感染的其他6种病毒核酸进行检测,结果均为阴性;检测下限为2.55 copies/μL,组内和组间变异系数均<2%。100份临床样本的检测结果均与农业农村部推荐的荧光定量PCR方法检测结果一致。综上,本研究建立的ASFV核酸iiPCR检测方法的特异性、稳定性及敏感度与传统荧光定量PCR方法一致,实现了ASFV检测的规范化和现场化,为ASFV的快速检测提供了可靠手段。

ASFV核酸防污染恒温隔绝式荧光PCR检测方法的建立

本研究基于UNG酶的生物学特性(能特异性识别并切割DNA分子中出现的尿嘧啶核苷),在PCR反应体系中引入UNG酶,使用农业农村部172号公告推荐的荧光定量PCR方法的引物和探针,通过对上下游引物、探针、Taq酶等反应体系的优化,建立防污染的恒温隔绝式荧光PCR(iiPCR)检测方法。结果显示:优化后的iiPCR方法特异性好,只扩增出ASFV的特异片段,对猪瘟病毒、高致病性蓝耳病病毒、伪狂犬病毒、流行性乙型脑炎病毒、猪细小病毒、猪流行性腹泻病毒等病原不能检出,检测下限为25.5拷贝/μL;具有良好的稳定性,组内和组间变异系数均<5%。该方法对实验室环境及操作人员的要求不严格,对PCR反应的反应性、便捷性和时效性无影响,也不影响后续实验,同时可以解决阳性对照物及扩增产物对PCR扩增体系污染的问题,减少假阳性的出现,提高检测方法的可靠性,为ASFV的诊断提供了可靠的手段。