恙虫病东方体Karp株56kD表膜蛋白基因的表达及免疫诊断应用研究

目的实现恙虫病东方体56kD表膜蛋白的原核表达并评价重组蛋白作为抗原的免疫诊断价值。方法亚克隆技术构建原核表达质粒载体pGEX-Sta56,转化宿主菌BL21(DE3),IPTG诱导表达GST-Sta56融合蛋白,亲和层析纯化融合蛋白,应用ELISA以评价其免疫诊断价值。结果pGEX-Sta56经测序鉴定Sta56基因以正确的表达框架连入载体,经过诱导表达得到正确大小的融合蛋白,应用纯化的GST-Sta56的ELISA检测结果与全细胞抗原有很高线性相关性,在小鼠血清检测中敏感性,特异性和准确性分别大于90%,70%和80%。结论成功表达重组的56kD表膜蛋白并可能替代传统的全细胞纯化蛋白,为建立快速、敏感和特异的免疫学诊断奠定了基础。

恙虫病东方体Karp株核酸疫苗的构建及其免疫功能初步研究

目的构建恙虫病东方体Karp株Sta56抗原候选核酸疫苗并初步探讨其可能诱导的免疫功能。方法从连有恙虫病东方体Karp株编码56000u表膜蛋白基因开放读码框全长的T载体质粒pMD18/Sta56中双酶切出目的基因,定向亚克隆构建核酸疫苗质粒载体pVAX1-Sta56,转染Hela细胞,WesternBlot分析Sta56蛋白的表达及其免疫原性,转染L929细胞,接种恙虫病东方体,Giemsa染色细胞内恙虫病东方体数目比较,初步探讨pVAX1-Sta56可能诱导的细胞免疫现象。结果pVAX1-Sta56连有正确读码框架的Sta56全长基因。转染有pVAX1-Sta56的Hela细胞培养上清可检测到被兔抗恙虫病东方体Karp株抗血清识别的特异条带。转染有pVAX1-Sta56的L929细胞内恙虫病东方体数目显著少于转染pVAX1的L929细胞(P<0.01)。结论成功构建能够表达Sta56表膜蛋白抗原的核酸疫苗载体pVAX1-Sta56,并能诱导产生细胞免疫功能。

恙虫病东方体Karp株Sta56基因的克隆及序列比较的研究

目的扩增恙虫病东方体Karp株主要表膜抗原Sta56的开放读码框(ORF)全长,并进行序列比较研究。方法小鼠接种传代和体外细胞扩增分离恙虫病东方体Karp株,用PCR方法扩增恙虫病东方体Karp株Sta56基因,并采用TA克隆技术构建测序载体,对测序结果进行同源性分析比较。结果 扩增出Sta56的ORF全长,并TA克隆到测序载体pMD18-T vector,测序结果与Karp标准株的同源性为99.4％。结论 Sta56全长ORF克隆扩增成功,为进一步构建表达载体,进行Sta56蛋白表达研究提供基础。

恙虫病东方体Karp株56-kDa外膜抗原基因片段的原核表达及免疫原性研究

目的探讨恙虫病东方体56-kDa蛋白在大肠埃希菌中的表达及作为诊断性抗原的可行性。方法用PCR扩增恙虫病东方体Karp菌株编码56-kDa蛋白长约1 100bp的DNA,克隆至表达载体pET30a(+)。表达产物经SDS-PAGE、质谱分析及western blot鉴定分析。重组蛋白质纯化后作为包被抗原,用方阵实验确定最佳浓度包被,ELISA法检测其与立克次体目16种成员及10种致病菌阳性血清的反应性。用此重组蛋白质免疫小鼠后制备抗血清,分别用ELISA及间接免疫荧光法(IFA)检测抗血清的效价。结果重组质粒经PCR及测序分析证明,56-kDa外膜抗原的基因片段以正确的读码框连入到pET30a(+)质粒载体中,SDS-PAGE结果表明重组蛋白质在约46-kDa处有表达的目的条带,western blot分析显示该条带可与1∶1 600稀释的兔抗Karp血清反应,证实其具有免疫活性。质谱分析鉴定该蛋白质为恙虫病东方体56-kDa蛋白;方阵滴定确定选择抗原的最佳稀释度为1∶1 600,特异性分析结果表明,重组蛋白质除与查菲埃立克体、嗜吞噬细胞无形体及五日热巴尔通体存在弱交叉反应外,与其他细菌均无交叉反应。IFA及ELISA检测表明抗血清效价可达1∶1 600。结论构建的重组蛋白质可以作为恙虫病东方体快速诊断的抗原。

实验室保存的恙虫病东方体Karp株与福建省分离株的sta56基因的序列分析

目的比较实验室保存的恙虫病东方体Karp株、福建省两个分离株的sta 56基因序列的差异。方法提取感染各株恙虫病东方体的Vero细胞的DNA,扩增出sta56的ORF。对不同株的ORF进行测序,对15株恙虫病东方体的sta56构建进化树并进行分析。结果实验室保存的Karp株的sta56基因序列有98%与参考株一致;FQ株和NA株仅有两个碱基的差异,有96%的序列与Karp株一致。结论实验室保存的Karp株sta56基因在长期传代中可发生变异,FQ株和NA株均属于Karp株。

恙虫病东方体Karp株47kDa蛋白成熟肽的克隆与表达

目的 :克隆表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株 4 7kDa表面蛋白的成熟肽 ,探索其作为疫苗及诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从 OtKarp株菌种基因组DNA中扩增出 4 7kDa成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建成重组质粒pQE30 4 7,转化大肠杆菌 (E coli) ,经IPTG诱导表达 ,SDS_PAGE和Western_blotting检测目的蛋白的表达。结果 :①获得长约 12 72bp的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因 ;②SDS_PAGE和免疫印迹显示该重组质粒转化的E coli有一相对分子量约为 4 3× 10 4 的独特蛋白带 ;③重组表达质粒序列分析结果显示pQE30 4 7中插入的基因片段的序列与已报告的OtKarp株 4 7kDa外膜蛋白基因序列基本一致 ,并与已知序列相同。结论 :获得了OtKarp 4 7kDa蛋白基因 ,并在E coli中实现了表达 。

恙虫病东方体Karp株56kDa与47kDa外膜蛋白基因的嵌合和嵌合基因在大肠杆菌的表达

目的 将恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi,Ot)Karp株的 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合 ,并使嵌合基因在大肠杆菌细胞内表达 ,产生双抗原融合蛋白。方法 采用PCR方法 ,从OtKarp株基因组DNA中扩增 5 6kDa蛋白基因片段 ,将该片段分别与原核表达载体pQE30及 4 7kD蛋白基因重组质粒 pQE30 / 4 7连接 ,构建 pQE30 / 5 6及pQE30 / 5 6 - 4 7重组质粒 ;用IPTG诱导转入大肠杆菌内的重组质粒的目的基因表达。结果 SDS -PAGE显示 ,pQE30 / 5 6转化的大肠杆菌产生一约 4 5kDa的融合蛋白和 pQE30 / 5 6 - 4 7转化大肠杆菌产生一约 90kDa融合蛋白 (5 6 - 4 7融合蛋白 ) ,免疫印迹分析显示两融合蛋白均与OtKarp株感染鼠血清产生特异性反应 ,5 6 - 4 7融合蛋白分别与 4 7kDa、5 6kDa重组蛋白免疫的小鼠血清产生特异性反应 ,以及 5 6 - 4 7融合蛋白免疫血清与 5 6kDa和 4 7kDa重组蛋白反应。结论 OtKarp株的 5 6kDa与 4 7kDa外膜蛋白基因嵌合后在大肠杆菌细胞内实现了表达 ,表达的融合蛋白具有 5 6kDa和 4 7kDa外膜蛋白的抗原特性。

恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体的构建及鉴定

目的:构建恙虫病东方体Karp株Sta22抗原基因原核表达载体,为表达该基因奠定基础。方法:以恙虫病东方体Karp株基因组为模板,通过PCR方法扩增Sta22抗原基因,并将其克隆到表达载体pEASY-E2上,通过PCR方法及核苷酸测序进行鉴定。结果:所构建的原核表达载体携带Sta22基因,基因序列与GenBank上所公布的信息完全一致。结论:成功构建了Sta22抗原基因的原核表达载体,为研制和开发新型的恙虫病疫苗及临床诊断试剂奠定理论基础及物质保障。

恙虫病东方体混合重组抗原应用于胶体金免疫层析试纸条的制备及效价检测

胶体金免疫层析试纸条具有携带方便、操作简单且敏感性、特异性高等特点,近年来开始广泛应用于疾病的诊断。为了实现对恙虫病的快速检测,笔者利用双抗原夹心法,以胶体金标记恙虫病东方体56 kDa混合重组蛋白,56 kDa混合重组蛋白和兔抗恙虫病东方体多克隆抗体分别喷在检测线及质控线上,制备了用于检测恙虫病东方体抗体的胶体金免疫层析试纸条。本研究制备的胶体金试纸条检测限为61 ng/mL,和疟疾、伤寒、血吸虫、出血热以及斑点热等阳性血清无交叉反应,特异性达90%(54/60),检测的敏感性为91.96%(103/112),在4℃下可稳定保存6个月。本试纸条能够应用于人体血清中恙虫病东方体总抗体的检测。

恙虫病东方体Karp株主要外膜蛋白基因的克隆与表达

目的 :表达恙虫病东方体 (Orientiatsutsugamushi)Karp株 5 6 0 0 0表面蛋白 ,探索其作为诊断抗原的可能性。方法 :采用PCR方法 ,从Ot.Karp株菌种基因组DNA中扩增出 5 6 0 0 0成熟蛋白基因片段 ,将该片段克隆于原核表达载体pQE30 ,构建重组质粒pQE30 / 5 6 ,转化大肠杆菌 ,经IPTG诱导表达、SDS_PAGE电泳和免疫印迹检测目的蛋白的表达。结果 :(1)获得长约 15 0 0bp的Ot.Karp株 5 6 0 0 0外膜蛋白基因 ;(2 )SDS_PAGE电泳和免疫印迹显示该重组质粒转化的大肠杆菌有一相对分子质量约为 5 6 0 0 0的独特蛋白带 ;(3)表达后菌体超声破碎后 ,目的蛋白主要以包涵体形式存在 ;(4)重组表达质粒序列分析结果显示 ,pQE30 / 5 6中插入的基因片段的序列与已报道的Ot.Karp株5 6 0 0 0外膜蛋白基因序列基本一致。结论 :获得了Ot.Karp 5 6 0 0 0蛋白基因 ,并在大肠杆菌中实现了表达 ,表达的重组蛋白具有免疫反应性。

恙虫病东方体Karp株47kD蛋白基因的表达及DNA免疫初步研究

目的 观察恙虫病东方体Karp株相对分子质量 (Mr)为 47× 10 3 蛋白基因的DNA免疫效果。方法 将恙虫病东方体Karp株Mr 为 47× 10 3 的蛋白基因插入真核表达载体pcDNA3.1( +) ,构建重组质粒pcDNA3.1 47。在证明该重组质粒可在哺乳动物COS7细胞中表达的基础上 ,单独和将其与Mr 为 40× 10 3 重组蛋白联合免疫小鼠。在每次加强免疫之后 10d ,检测小鼠体液和细胞免疫反应。结果 质粒DNA和蛋白联合免疫组所诱导的抗体水平和脾淋巴细胞增殖反应均高于重组质粒DNA和蛋白单独免疫组 ,而第二次加强免疫后重组质粒诱导脾淋巴细胞的增殖情况则显著弱于其它免疫组 (P <0 .0 5 )。结论 重组质粒pcDNA3 .1 47和重组Mr 为 47× 10 3 蛋白在刺激小鼠免疫反应上具有相互加强作用。

以神经系统为首发症状的老年恙虫病1例诊治体会

恙虫病是一种急性自然疫源性传染病,主要由恙虫病东方体感染引起,好发于南方,北方地区比较少见,但近年来我国恙虫病的流行地区逐渐由南向北扩展。该病临床表现多样,多表现为发热、皮疹、淋巴结肿大,焦痂对于诊断具有较高特异性。部分患者临床症状不典型,可伴有神经系统症状,容易漏诊或误诊,延误病情。当患者无特异性临床表现,且传统血清学检测不能明确诊断时,宏基因组高通量测序(mNGS)有助于快速诊断,提高治愈率,改善预后。

恙虫病东方体平潭岛株重组抗原的制备及快速诊断试剂的研制

目的制备重组抗原,利用胶体金技术研制恙虫病快速诊断试剂。方法用PCR扩增出Ptan株编码56kD外膜蛋白长约1352bp的DNA,克隆至原核载体pET28a,构建了表达载体。表达产物经SDS-PAGE及Western-blot进行鉴定分析。将Ptan株和Gilliam56kD截短重组抗原混合作为诊断抗原,研制胶体金免疫层析诊断试纸检测血样中的恙虫病特异性总抗体、IgM和IgG。结果SDS-PAGE表明重组蛋白在相对分子质量约52kD处有表达目的条带,Western-blot证实该蛋白具有免疫活性。胶体金免疫层析法检测抗恙虫病东方体总抗体、IgM、IgG和IFA法检测IgG的敏感性分别为94.5%,81.4%,91.6%和86.2%,胶体金免疫层析法检测总抗体、IgM、IgG特异性分别为98.1%,100%,98.9%。结论胶体金层析法可替代常规IFA法用于恙虫病诊断。

应用PCR/RFLP对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型分析

目的 鉴定辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的基因型。方法 采用 PCR/ RFL P技术对辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的 sta5 6目的基因进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。结果 辽宁、吉林地区 6株分离株的 PCR特异性产物经 Hinf 、Hha 、Rsa 酶切后呈现 2种不同的 RFL P图谱 :HCAa92 0 2株、HCAp92 0 3株及 HCM95 0 1株与 Gilliam参考株具有相似的酶切图谱 ,但缺乏 Hinf 的酶切位点 ;KDCt940 2株、KDCp940 3株及 KDCt940 4株与 Karp参考株具有相同的酶切图谱。结论 KDCt940 2株、KDCp940 3株及 KDCt940 4株属于 Karp型 ;HCAa92 0 2株、HCAp92 0 3株及 HCM95 0 1株属于 Gilliam型 ,但基因序列可能存在遗传差异。

恙虫病东方体Gilliam株56kDa蛋白部分基因的原核表达及初步鉴定

目的 对恙虫病东方体Gilliam株 5 6kDa蛋白部分基因进行原核表达 ,以获得高效表达、有生物活性目的蛋白 ,为恙虫病诊断试剂的研制打下基础。方法 根据Gilliam株东方体 5 6kDa蛋白基因序列设计特定引物 ,用PCR法扩增出编码5 6kDa抗原富含亲水区及同源性高的C端一段长约 70 0bp的DNA ,插入原核载体PGEX - 4T - 2 ,转化大肠杆菌TGI ,抽提质粒 ,酶切鉴定 ,含插入片段的重组质粒进行序列分析 ,再转化表达宿主菌大肠杆菌BL2 1(DE3) ,IPTG诱导表达 ,用SDS -PAGE及Western -blot进行分析鉴定。结果 SDS -PAGE检测表明该截短片段以融合蛋白的方式得到成功表达 ,在相对分子量 5 8kDa处有表达条带 ,经薄层扫描分析 ,目的蛋白条带占全菌蛋白的 30 5 %。Western -blot证实该融合蛋白能被恙虫病患者阳性血清识别。结论 表达产物初步鉴定具有生物活性 。

我国辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株的PCR分型

为鉴定我国东北地区恙虫病东方体 (Ot)型别 ,本文应用Ot外膜主要蛋白型特异抗原 5 6ku构建的群、型引物 ,采用PCR技术对分离自辽宁、吉林地区的 6株恙虫病东方体目的基因进行分析研究 ,并与Gilliam ,Karp ,Kato国际参考株进行比较。结果表明 ,辽宁、吉林恙虫病东方体分离株至少存在Gilliam和Karp

恙虫病东方体黑龙江分离株的PCR分型

目的 鉴定恙虫病东方体黑龙江分离株的基因型。方法 采用PCR技术对分离自黑龙江省密山地区的 6株恙虫病东方体sta5 6kD目的基因进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。结果 MSAa930 1株、MSAa930 3株、MSAa930 4株及MSAp930 5株属于Gilliam型 ;MSAa930 6株属于Karp型 ;MSAp930 2株属于Kato型。 结论 黑龙江密山地区恙虫病东方体存在Gilliam、Karp和Kato 3种型别。

我国东北地区恙虫病东方体分离株基因型的研究

为了准确鉴定我国东北地区恙虫病东方体基因型 ,采用PCR ,PCR/RFLP及PCR/SSCP等技术对我国东北地区的恙虫病东方体Sta 5 6目的基因进行分析 ,并与国际参考株进行比较。结果表明 ,东北地区恙虫病东方体分离株至少存在 2种型别 ,但基因序列可能存在遗传差异。

应用PCR/SSCP分析恙虫病东方体分离株基因型的研究

目的 对分离自辽宁、吉林地区的 6株恙虫病东方体目的基因进行分析研究 ,并与国际参考株进行比较。方法 经PCR/SSCP检测 ,呈现出 2种不同的单链构象图谱 :HCAa92 0 2株、HCAp92 0 3株及HCM95 0 1株图谱与Gilliam参考株相同 ,而KDCt940 2株、KDCp940 3株及KDCt940 4株的图谱则与Karp参考株相同。结果 辽宁、吉林地区恙虫病东方体分离株至少存在 2种型别。结论 应用PCR/SSCP方法分析恙虫病东方体基因型 ,简便、经济、省时、结果准确。

恙虫病东方体CMY株sta 56基因片段序列分析

目的 了解恙虫病东方体 Ｃ Ｍ Ｙ 株与其它株的关系。方法 测定 Ｃ Ｍ Ｙ 株 ｓｔａ５６ 基因片段的核苷酸序列并与其它株相应序列进行比较。结果 在测定的３２４ｂｐ 序列中， Ｇ Ｃ 含量为４３５ ％ ； 与 Ｋａｒｐ 、 Ｇｉｌｌｉａｍ 、 Ｋａｔｏ 、ｋｕｒｏｋｉ、 Ｋａｗａｓａｋｉ 及 Ｓｈｉｍｏｋｏｓｈｉ 株相应序列的同源性分别为９１０ ％ 、８７３ ％ 、８７０ ％ 、８７３ ％ 、８６１ ％ 及７３８ ％ 。结论 Ｃ Ｍ Ｙ 株与已报道的恙虫病东方体菌株不同， 与 Ｋａｒｐ 株有很高的同源性。