流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得

根据JEV病毒减毒株SA14-14-2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT-PCR扩增出4个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆。经过体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定。结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染BHK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CPE为 ,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT-PCR实验均为阳性。证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础。

SARS_CoV中国株基因组全长cDNA的构建及其恢复病毒的生物学性质

严重急性呼吸综合征是SARS-CoV引起的一种重要新发传染病,其致病机制的研究对于防治该病十分必要。为了利用反向遗传学技术研究SARS-CoV的致病机制,将覆盖SARS-CoVBJ01株基因组全长的7个cDNA片段纯化后进行体外连接,构建基因组全长cDNA分子,以其为模板,使用T7RNA聚合酶系统在体外进行转录,获得病毒RNA。用电穿孔转染法将转录体RNA导入VeroE6细胞,可观察到典型的SARS-CoV致细胞病变作用。对收获的恢复病毒采用RT-PCR方法进行鉴定,结果表明获得的恢复病毒与SARS-CoVBJ01株原病毒序列一致。以针对SARS-CoV的抗体对感染细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有特异感染性的恢复病毒。同时用细胞病变法和空斑试验测定了恢复病毒及其亲本毒株的病毒滴度,结果表明二者在致病性上没有明显差异,恢复病毒具有与原型株相似的生物学特性。SARS-CoVBJ01株基因组全长cDNA的成功构建及对恢复病毒生物学性质的研究将为进一步探索SARS-CoV致病的分子机制及研制新型疫苗奠定良好的基础。

陈志斌教授从“阴汗”理论辨治新冠病毒感染恢复期汗症经验

汗症是新型冠状病毒感染恢复期患者常见症之一。西医治疗汗症效果不稳定,中医立足整体病机,准确辨证用药,可收到较满意的临床效果。通过总结陈志斌教授对新冠病毒感染恢复期汗症的病机认识及治法方药,欲作引玉之砖,为汗症的中医药治疗提供一定独到见解。陈教授以阴阳辨证为纲、寒热辨证为辅,认为本病当从“阴汗”论治,主要与肺卫、心的生理功能失调相关,创“阳康止汗方”干预本病,效果满意。

新型冠状病毒感染恢复期合并糖尿病患者中医证候特征分析

目的分析新型冠状病毒感染恢复期合并糖尿病患者的临床特征和中医证候分布规律,对精细化治疗和护理伴有糖尿病的新冠病毒感染恢复期患者具有指导意义。方法收集湖北省武汉市新冠病毒感染恢复期合并糖尿病病史患者60例,分析中医证型分布情况。使用GeenCards等数据库检索证型主要临床表现和疾病的交集靶点,进行京都基因和基因组百科全书(KEGG)通路富集分析。结果60例伴有糖尿病的新冠病毒感染恢复期患者男28例,女32例,临床症状最多见的为乏力(占85%),其次为喘促气短(占81.7%),舌质以淡白舌为主(占46.7%),舌体偏胖大(占60%),舌苔大多为薄白苔(占31.7%)或白腻苔(占28.3%),脉象以沉、细、虚而无力为主,均占比50%以上。综合主证型与兼证型情况,肺脾气虚证37例(占61.7%),肺肾气虚证21例(占35%),气阴两虚证14例(占23.3%)。3个证型临床表现和新冠病毒感染恢复期合并糖尿病交集靶点个数为肺脾气虚证601个,肺肾气虚证613个,气阴两虚证596个。KEGG富集分析显示通路的种类基本一致,主要包括病毒感染在内的病原体感染相关通路和炎症、免疫反应相关通路,3个证型之间具体通路的相关性和基因数量又有各自的特点,但差异较小。结论患者中医证候特征与气候环境和体质密切相关。3个主证型临床表现和新冠病毒感染合并糖尿病交集靶点与病毒感染、炎症、免疫应答有密切的关系。

新冠病毒感染患者恢复期血浆抗体效价的相关因素分析

目的研究新冠病毒感染康复者恢复期血浆IgG、IgM、中和抗体效价与性别、年龄、采集间隔等因素的关系,从而指导新冠病毒感染康复者血浆采集。方法采集新冠恢复期患者血浆,测定抗体效价,采用SPSS统计学分析软件,分析各组数据差异性及相关性。结果不同性别与3种抗体效价(男性IgG、IgM、中和抗体效价中位数分别为484.24 AU/mL、2.13 AU/mL、1124.74 AU/mL;女性IgG、IgM、中和抗体效价中位数分别为516.04 AU/mL、1.73 AU/mL、1143.99 AU/mL)组间比较无差异(P>0.05),年龄与IgG、中和抗体有弱的正相关,Spearman相关系数为0.188(P<0.05);30名重复捐献者,首次捐献IgG、IgM、中和抗体效价中位数分别为522.3 AU/mL、2.64 AU/mL、1174.6 AU/mL,再次捐献3种抗体效价中位数为332.08 AU/mL、0.63 AU/mL、708.96AU/mL,前后浓度水平比较有差异(P<0.05)。结论不同年龄、性别的新冠病毒感染康复者恢复期血浆IgG、IgM、中和抗体效价水平无差异,其效价水平均可达到临床治疗指南要求。重复捐献者抗体水平虽有所下降,但仍具有临床价值。

徐伟辉“针、灸”治疗新型冠状病毒感染恢复期经验

随着新型冠状病毒感染大面积爆发,许多患者在感染新型冠状病毒感染后随着疾病的发生发展进入了新型冠状病毒感染恢复期。新型冠状病毒感染恢复期是指患者符合相关出院指征而未达到在临床上治愈的标准,患者出院后仍存在有咳嗽、乏力、焦虑等多功能障碍,影响社会各行各界复工复产,同时严重降低个人生活质量。针对新型冠状病毒感染恢复期,目前西医常规口服药物治疗都为对症治疗,大多无明显疗效。徐伟辉主任医师在临床工作多年,有充足完备的理论知识储备及专业操作技能,基于对新型冠状病毒感染恢复期的认识,再结合临床上大量收治新型冠状病毒感染恢复期患者的经验,基于扶正祛邪的治疗原则提出以腹针结合雷火灸治疗新型冠状病毒感染恢复期的具体运用方案,可以为临床上治疗新型冠状病毒感染恢复期患者提供更具有中医特色的可行建议,为临床中医治疗此类疾病提供新思路。

桑青苇茎汤治疗痰湿郁肺型新型冠状病毒感染恢复期的回顾性研究

目的:回顾性分析桑青苇茎汤治疗痰湿郁肺型新型冠状病毒感染(COVID-19)恢复期患者的临床疗效并分析其作用机制。方法:选取2022年12月~2023年2月期间入住某院呼吸科病房的67例痰湿郁肺型COVID-19恢复期患者为研究对象。所有患者均给予桑青苇茎汤治疗2周。观察中医证候疗效、临床主要症状评分以及血常规、尿常规、生化指标、胸部CT影像学等安全性指标的变化。结果:桑青苇茎汤的临床治疗总有效率为83.58%;治疗后,咳嗽、喘憋、乏力3项主要症状的评分均降低(P<0.05);白细胞数目、淋巴细胞和中性粒细胞百分比降低(P<0.05);治疗前后尿常规及生化指标比较无统计学差异(P>0.05);治疗后患者的胸部CT显示病灶较前吸收。结论:桑青苇茎汤可有效改善痰湿郁肺型COVID-19恢复期患者的临床症状,促进患者机体功能的恢复且安全性较高。

新冠恢复期,明辨临床特点;中医药特色,重视综合治疗

新型冠状病毒感染恢复期的临床表现复杂多样,需要分辨不同的临床特点,针对性治疗。中医认为其基本病机是正虚邪恋,把握主病、主症的病机特点非常关键。中医药治疗新型冠状病毒感染恢复期具有显著疗效,中药、针灸、推拿、气功等多种治疗方法综合运用,能够更好地发挥优势。

新型冠状病毒感染恢复期健康管理专家共识

当前,新型冠状病毒感染全球流行,奥密克戎变异株已成为新型冠状病毒感染全球流行的优势毒株。据预测,奥密克戎将感染世界50%以上的人口,不仅侵犯呼吸系统,还多有累及胃肠道、心血管系统、肾脏等全身其他器官,部分患者甚至存在感染后诸如疲劳、咳嗽、味/嗅觉的长期异常等。本共识对国内外相关文献进行总结,结合各领域专家临床经验,为新冠病毒感染恢复期人群的健康管理提供参考。

基于网络药理学的扶土生金康复方调节新型冠状病毒肺炎恢复期免疫功能机制研究

目的探讨扶土生金康复方治疗新型冠状病毒肺炎恢复期免疫抑制的作用机制。方法采用中医药网络药理学智能信息平台,检索扶土生金康复方的化学成分以及对应的靶点,通过GeneCards数据库获得免疫抑制相关靶点,将药物成分靶点与免疫抑制相关靶点对应,筛选交集靶点及相关功效成分。利用Cytoscape软件,构建“中药-成分-作用靶点-疾病”网络。通过STRING平台,进行PPI网络构建,找出核心靶点,再对交集靶点进行GO、KEGG富集分析。结果扶土生金康复方作用于免疫抑制的活性成分主要为槲皮素、木犀草素、山柰酚、柚皮素等,关键靶点为mTOR、TLR2、TNF、AKT1、MAPK3等,GO与KEGG富集分析提示通过T细胞活化、氧化应激等参与体内生物过程以及调控PI3K-Akt信号通路、EGFR酪氨酸激酶抑制剂耐药通路等方式调节免疫功能。结论阐述了扶土生金康复方治疗新型冠状病毒肺炎恢复期免疫抑制的作用机制,为未来研究提供了理论基础和研究方向。

从“三因制宜”理论探析西南地区新型冠状病毒肺炎恢复期的辨证思路

新型冠状病毒肺炎现已成为全球大流行传染病,严重影响人类生命健康。目前我国新冠肺炎形势已得到控制,但患者恢复期治疗不当及后遗症可能会造成患者后期生存质量的下降,中医药的及时介入在本次抗疫期间发挥出巨大作用,故合理应用中医药干预恢复期以促进康复进程,减少后遗症有重大意义。笔者基于“三因制宜”理论,参考叶天士“络病”理论,构建西南地区新冠肺炎恢复期“余毒未清(湿邪为主)-肺脾双亏、痰瘀阻络”疾病模型,并将恢复期分为前期、中期、后期,前期清散余热、健脾除湿,中期养阴,后期益气活血通肺络,但不拘泥于分期,三期杂合而至,从因时、因地、因人制宜指出西南地区新冠肺炎恢复期诊治思路特殊性,为其提供一个简易的临床治疗思路。

基于网络药理学探讨补中益气汤对新型冠状病毒肺炎恢复期的作用机制

目的:基于网络药理学探讨补中益气汤治疗新型冠状病毒肺炎(COVID-19)恢复期的分子机制。方法:通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP)检索补中益气汤的成分及靶点,基于ADME参数筛选主要成分,使用Cytoscape3.6.0软件构建中药-成分-靶点网络,在OMIM、GeneCards数据库中检索COVID-19靶点,绘制韦恩图得到交集靶点,导入STRING数据库,构建交集靶点的蛋白质-蛋白质相互作用(PPI)网络,生成分值最佳的MCODE组件。使用Cytoscape3.6.0软件的BisoGenet插件绘制疾病及药物PPI网络,并用Merge功能取交集,根据拓扑参数筛选出核心节点。通过Metascape平台进行基因本体与京都基因和基因组百科全书富集分析,绘制气泡图和通路-靶点网络图对结果可视化处理。结果:检索出8味中药的135个主要成分、258个药物靶点、446个疾病靶点,中药-成分-靶点网络得到槲皮素、β-谷甾醇、木犀草素等10个关键化合物,PPI网络筛选出351个核心靶点,发现10个关键靶点:STAU1、FUS、TARDBP、CUL4B、EEF1A1、EIF4A3、TUBG1、RPS3、RPL6、RPS2,核心靶点主要富集在爱泼斯坦-巴尔病毒感染、甲型流感、麻疹、军团杆菌病、系统性红斑狼疮病等疾病通路,及核糖体、病毒致癌、蛋白酶体等信号通路中。结论:补中益气汤可通过多靶点、多通路消除炎症,减轻肺部损伤以及调节免疫等方面对COVID-19恢复期发挥潜在的治疗作用,本研究为新药的研发和COVID-19恢复期的治疗提供了新思路和理论基础。

论中医药治疗在新型冠状病毒肺炎恢复期的优势和价值

新型冠状病毒肺炎自2019年12月从湖北武汉爆发以来,迅速蔓延全国乃至全世界,传染性极强,被认定为恶性传染病,新型冠状病毒肺炎爆发后,中医药一直参与其中,为临床治疗提供方案,经过国家卫生健康委和国家中医药管理局联合颁布的《新型冠状病毒肺炎诊疗方案》已发至第7版,随着疫情的严防控制,现有大批量病人处于恢复期,传统医学的汤剂内服、针药外治、芳香疗法等在瘥后劳逸方面发挥积极作用,多地联合发布的新型冠状病毒肺炎恢复期患者的中医康复治疗指南,在积极推行中,随着方舱医院的清零,疗效已显现,现将新冠肺炎恢复期传统中医药治疗的优势进行详细探讨。

中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160病毒株感染性全基因组cDNA克隆的构建与分析

报告了中国首次分离的辛德毕斯病毒XJ-160株的感染性全基因组cDNA克隆的构建与鉴定.利用RT-PCR方法获得覆盖病毒全长基因组的cDNA片段,以低拷贝质粒pBR322作为骨架,将基因组cDNA置于SP6 RNA聚合酶启动子之后,基因组3'末端带有35个连续的A,通过DNA重组技术组装成病毒基因组全长cDNA克隆.该克隆可在大肠杆菌DH5a中稳定扩增.经体外转录,RNA转录体转染BHK-21细胞,细胞发生病变,恢复病毒滴度达到107～108pFU/ml.全基因组cDNA克隆构建过程中引入的沉默突变(8 453位核苷酸由C变为T)产生Xba Ⅰ酶切位点作为遗传标记,在子代恢复病毒的基因组中稳定存在.从细胞病变的特征、BHK-21细胞的空斑形态、病毒的抗原性、病毒在细胞中的生长动力学特征以及对乳鼠的致病性等方面比较,恢复病毒和亲本病毒XJ-160没有显著区别,提示获得了具有感染性的XJ-160病毒全长cDNA克隆.该病毒感染性全基因组cDNA克隆可以作为反向遗传学系统,为进一步研究病毒复制和致病机制,以及开发相应的载体表达系统提供分子生物学工具.

新型冠状病毒感染恢复期(肺脾气虚证)疲劳影响因素分析

目的探究新型冠状病毒感染恢复期(肺脾气虚证)患者疲劳的相关影响因素。方法选择2024年1—3月在浙江中医药大学附属第一医院就诊的新型冠状病毒感染恢复期(肺脾气虚证)门诊患者为研究对象,由统一培训的调查员在门诊区域发放电子调查问卷,采用SPSS 26.0统计学软件分析数据。结果本研究最终获得有效样本462份,其中疲劳者366例(79.2%),无疲劳者96例(20.8%)。单因素分析结果显示,新型冠状病毒感染恢复期(肺脾气虚证)疲劳者与无疲劳者文化程度、睡眠时长、每周压力时间、胃口变化、排便情况、新冠感染次数差异均有统计学意义(P<0.05)。Logistic回归分析显示,睡眠时长、每周压力时间、胃口改变、排便情况、新冠感染次数均是新型冠状病毒感染恢复期(肺脾气虚证)疲劳的独立影响因素(P<0.05)。结论受睡眠时长、每周压力时间、胃口改变、排便情况、新冠感染次数等因素影响,新型冠状病毒感染恢复期(肺脾气虚证)疲劳发生率较高,针对不同影响因素采取针对性的干预措施可能在一定程度上改善此类患者的疲劳状态。

登革2型病毒中国分离株感染性全长cDNA克隆的构建与鉴定

目的:构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的感染性全长cDNA克隆。方法:根据我室测定的DEN2-43株病毒全基因组序列,利用长链RT-PCR及融合PCR技术扩增此病毒基因组全长cDNA分子,并将其克隆至低拷贝载体pW SK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆。将此克隆体外转录后,通过电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒。结果与结论:构建的DEN2-43基因组全长cDNA克隆具有感染性,所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及小鼠乳鼠神经毒力,且可稳定传代。该感染性克隆的构建为深入探讨登革病毒的致病机制及研制新型登革疫苗奠定了基础。

登革1型病毒广州06株基因组全长感染性克隆的构建与鉴定

目的:构建本室新分离的登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,为深入研究登革病毒致病机制奠定基础。方法:根据登革1型病毒广州06株基因组全序列中单一酶切位点设计特异引物,分别扩增并克隆5个病毒亚基因组cDNA片段,将其逐一拼接连入pW SK 29低拷贝质粒载体,获得病毒全长cDNA克隆,并将其体外转录为RNA,再转染细胞获得恢复病毒。进一步通过RT-PCR扩增病毒5′和3′非编码区序列和特异性间接免疫荧光对其恢复病毒进行鉴定。结果和结论:构建获得登革1型病毒广州06株基因组全长感染性cDNA克隆,其恢复病毒与野生型病毒具有相似的生物学特性。

中国登革2型病毒反向遗传系统的构建与鉴定

为构建登革2型病毒中国分离株(DEN2-43)的反向遗传系统,根据已测定的DEN2-43全基因组序列,利用长链RT-PCR及融合PCR扩增此病毒基因组全长cDNA分子,并将其克隆至低拷贝载体pWSK29中构建该病毒株的全长cDNA克隆.将此克隆体外转录后,经电穿孔导入宿主细胞获得恢复病毒.结果表明,获得的基因组全长cDNA克隆具有感染性,所获得的恢复病毒具有与原型病毒类似的生物学性质及乳鼠神经毒力,且可稳定传代.该反向遗传系统的构建为深入探讨登革病毒的致病机理及新型疫苗的研制奠定了基础.

登革病毒4型Ban18HK20株感染性克隆的构建、鉴定及稳定性分析

目的构建稳定的登革病毒4型Ban18HK20株感染性克隆,为深入研究登革病毒毒力位点及嵌合疫苗研发提供参考。方法根据登革病毒4型Ban18HK20株基因组序列设计特异引物,将病毒全长cDNA分6段进行亚克隆构建,再将其逐一拼接连入高拷贝质粒pSPTM中,获得稳定的病毒全长cDNA克隆,以其为模板体外转录RNA,并将RNA电转染Vero细胞,获得恢复病毒。通过蚀斑法、间接免疫荧光法、生长动力学试验、小鼠脑内致病力研究对恢复病毒的生物学特性进行鉴定,并利用RT-PCR扩增对传代病毒进行遗传稳定性研究。结果酶切及测序表明感染性克隆构建成功。获得的恢复病毒在蚀斑形态、病毒E蛋白表达、生长特征及小鼠脑内致病力等生物学特性方面同母本株一致,测序表明恢复病毒基因组序列与母本病毒相同,且遗传稳定。结论构建获得了稳定的Ban18HK20感染性克隆,建立了用于登革病毒研究的反向遗传学技术平台。

携带Kpn1酶切位点的日本脑炎病毒全长感染性克隆的构建与鉴定

目的构建携带特定酶切位点的日本脑炎病毒全长感染性克隆,并对拯救病毒的生物学特征进行鉴定。方法利用分子克隆和反向遗传学技术,在日本脑炎病毒全长感染性克隆pJE70质粒的基础上引入Kpn1单酶切位点,获得pJE70_Kpn1重组质粒。将质粒线性化后进行体外转录,将转录体RNA转染BHK-21细胞,拯救获得恢复病毒E70-Kpn1。通过间接免疫荧光、蚀斑形成实验、生长曲线测定、小鼠神经毒力评价等方法鉴定恢复病毒E70-Kpn1的生物学特性。结果成功构建了携带Kpn1的日本脑炎病毒全长感染性克隆,该克隆能拯救出重组的日本脑炎病毒E70-Kpn1,其生物学特征与亲本株E70无显著差异。结论研究获得携带Kpn1酶切位点的日本脑炎病毒全长感染性cDNA克隆,并成功拯救获得一株重组日本脑炎病毒,为下一步进行反向遗传学操作提供了可靠的工具。