烟曲霉af-fadO基因敲除株构建揭示该基因在恩波吡维胺与唑类协同抗烟曲霉中的作用

恩波吡维胺(pyrviniumpamoate,PP)是一种传统抗寄生虫药,与唑类联合具有协同抗烟曲霉作用。af-fadO(FADbindingoxidoreductase,FAD依赖性氧化还原酶)基因的编码产物在烟曲霉中推定为一种与FAD结合的氧化还原酶,可能参与真菌的氧化呼吸过程。通过敲除烟曲霉af-fadO基因,构建烟曲霉af-fadO基因的敲除株,揭示该基因及其编码蛋白在PP与唑类协同抗烟曲霉中的作用,并探索了其对烟曲霉药物敏感性和渗透压、氧化压力物质敏感性的影响。本研究采用同源重组构建出af-fadO基因的敲除盒,筛选出符合的烟曲霉af-fadO敲除株Δaf-fadO。利用纸片法和棋盘法观察该突变株与野生株WT(ku80,pyrG^(+))在PP与唑类(泊沙康唑、伊曲康唑、伏立康唑)联合抗烟曲霉中的敏感性变化。同时,观察该突变株与野生株WT对氧化压力(H_(2)O_(2)和甲萘醌)、渗透压物质(NaCl、D-山梨醇)敏感性的变化。体外联合药物敏感性试验结果显示Δaf-fadO对PP与泊沙康唑的分级抑菌浓度指数(fractional inhibitory concentration index,FICI)为0.563,显示无相互作用,而对照组WT对PP与泊沙康唑的FICI值为0.5,存在协同作用。纸片法结果发现PP与泊沙康唑联合对Δaf-fadO的抑菌圈比对照组WT产生的抑菌圈直径明显变小,PP与泊沙康唑联合时对敲除株抑制作用更显著,差异有统计学意义(P<0.05)。在渗透压和氧化应激的培养试验中,与野生株WT相比较,Δaf-fadO对氧化剂H_(2)O_(2)、甲萘醌、NaCl和D-山梨醇更敏感。敲除烟曲霉af-fadO基因后,其对氧化和渗透压力的敏感性增加,逆转了PP与泊沙康唑的协同作用,af-fadO可能是PP作用于烟曲霉的靶点。本研究丰富了PP协同唑类抗真菌的机制研究,为将来的临床应用奠定了基础。