新冠病毒主蛋白酶特异性荧光底物ddRFP-M的制备与鉴定

传统的新冠病毒主蛋白酶(main protease, Mpro)多肽底物具有制备成本高、稳定性差和合成工艺复杂等缺点,积极开发廉价稳定的新型底物具有重要意义。本研究基于二聚化红色荧光蛋白(dimerization-dependent red fluorescent protein, ddRFP)原理,以AVLQS为连接肽,利用基因工程技术制备Mpro特异性荧光底物ddRFP-M,用于Mpro抑制剂的药理活性评价。将连接肽基因插入到密码子优化的RFP-A_1与RFP-B_1基因之间,构建ddRFP-M基因,再将其克隆到pET-28a载体中构建重组质粒。将重组质粒转化至大肠杆菌Rosetta(DE3)感受态细胞中,以卡那霉素抗性法筛选重组子。重组子经低温诱导后,在大肠杆菌中进行荧光底物ddRFP-M的可溶表达,并以HisTrap~(TM)层析柱进行分离纯化。以荧光动力学检测法和电泳法测定ddRFP-M的底物特异性,并利用荧光底物ddRFP-M评价恩赛特韦和黄芩素的药理活性。结果显示,荧光底物ddRFP-M在大肠杆菌中呈可溶表达并成功进行了分离纯化,其具有良好的底物特异性、灵敏性和可靠性。新冠病毒Mpro特异性荧光底物ddRFP-M的制备,为新冠病毒Mpro抑制剂的药理活性评价奠定了基础。