赤道几内亚恶性疟原虫分离株抗药分子标志物Pfmdr1和Pfcrt十年趋势分析

为了研究赤道几内亚恶性疟原虫多药耐药性蛋白1(Pfmdr1)基因和恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白(Pfcrt)基因的突变基因型和突变趋势走向特征.从非洲赤道几内亚采集2011-2022年恶性疟原虫感染者血样并提取基因组DNA.采用巢式PCR技术分别扩增Pfmdr1和Pfcrt基因,结合Sanger测序对扩增产物进行DNA测序.利用Snapgene 6.0.2对DNA序列进行比对,筛查相关突变位点,并用Haploview 4.2对突变位点进行连锁不平衡(LD)分析.结果表明赤道几内亚恶性疟原虫耐药基因Pfmdr1和Pfcrt的突变比例降低,并且野生型寄生虫种群数量超过突变种群.由此说明赤道几内亚停止使用氯喹(CQ),并将青蒿琥酯-阿莫地喹(ASAQ)作为一线治疗方案是有效的.

我国恶性疟原虫对抗疟药敏感性的现状

目的：了解恶性疟原虫对各种常用抗疟药的敏感性，以指导合理应用抗疟药。方法：采用ＷＨＯ标准体外微量法。结果：甲氟喹和奎宁分别测定３６例和３３例，未发现抗性病例。氯喹、氨酚喹和哌喹抗性率分别为８４．６％、８６．１％和３８．０％。有８．３％病例对咯萘啶有抗性，少数病例对青蒿素类药物敏感性下降。结论：云南和海南两省恶性疟原虫对氯喹、氨酚喹和哌喹有高度抗性，但停用氯喹后，恶性疟原虫对氯喹敏感性有所恢复。对哌喹抗性率和抗性程度呈现逐渐上升趋势。对咯萘啶和青蒿素类药物的敏感性在逐渐降低。上述抗疟药抗性之间有一定交叉关系。

海南省乐东县恶性疟原虫对氯喹抗性的变化

目的：监测海南省停用氯喹后抗氯喹恶性疟原虫对氯喹抗性的消长。方法：选择恶性疟原虫对氯喹有高度抗性且恶性疟发病率较高的海南省乐东县为观察点，采用ＷＨＯ标准体外微量法和体内四周法，间隔一定时间检测一次。结果：停用氯喹１８年，体外法，抗性率由１９８１年的９７．９％下降至１９９７年的２６．７％（Ｐ＜０．００１），完全抑制裂殖体形成的平均药浓度由１０．４６±７．１４ｐｍｏｌ／μｌ血降至１．６３±１．４７ｐｍｏｌ／μｌ血（Ｐ＜０．００１）；体内法，抗性率由１９８１年的８４．２％降为１９９７年的１８．４％（Ｐ＜０．００１），ＲⅢ占抗性病例的比例由５３．１％降为１４．３％。

量子点荧光微球免疫层析试纸条定量检测恶性疟原虫

以羧基化Cd Te/Zn Se量子点荧光微球为荧光标记物,采用1-乙基-（3-二甲基氨基丙基）碳酰二亚胺（EDC）法偶联抗恶性疟原虫富组氨酸蛋白（Pf）单克隆抗体制备荧光探针;以羊抗恶性疟原虫组氨酸多克隆抗体和驴抗鼠二抗分别喷涂硝酸纤维膜,形成试纸条检测线和质控线,建立了免疫层析试纸条定量检测血清中恶性疟原虫的方法。所使用的羧基化量子点荧光微球的荧光强度为单个量子点的2800倍。实验结果表明,该荧光试纸条定量检测血清中恶性疟原虫线性范围为5.8-8010 Parasite/μL,最低灵敏度达到5.8 Parasite/μL,单个样品检测时间只需15 min。加标回收实验显示,试纸条批内回收率为93.0%-111.8%,批间回收率为98.3%-115.1%,且批内、批间的相对标准偏差均小于5%。

我国恶性疟原虫对氯喹抗性的消长

目的 监测停止或减少使用氯喹防治恶性疟后恶性疟原虫对氯喹抗性的变化。 方法 采用世界卫生组织 (WHO)制定的体外微量法和体内四周法 ,在停用氯喹后不同时间测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。 结果 海南省乐东县抱由镇体外法测定抗性率由 1981年的 97 9%降至 1997年的 2 6 7% (P <0 0 1) ,完全抑制裂殖体形成的平均药浓度由 10 46± 7 14 pmol/μl血 降至 1 63± 1 47pmol/μl血 (P <0 0 1) ,用较高药浓度 (>6 4pmol/μl血)才能完全抑制裂殖体形成的病例所占比例由 83 3 %降为 6 7% (P <0 0 1)。体内法测定抗性率由 1981年的 84 2 %降为 1997年的 18 4% (P <0 0 1) ,三级抗性 (RⅢ )占抗性病例的比例由 5 3 1%降为 14 3 % (P <0 0 1) ,血中无性体疟原虫平均消失时间由 72 0± 2 1 6h变为 5 0 7± 16 1h。2 0 0 1年三亚市雅亮乡体外法测定抗性率为 5 9 8% ,平均抑制药浓度 3 5 6± 2 12 pmol/μl血 。 2 0 0 3年乐东县福抱乡体内法测定抗性率为 62 5 % ,RI、RⅡ和RⅢ分别占抗性病例 5 0 %、 3 0 %和 2 0 % ,无性体疟原虫平均消失时间 5 6 9± 17 2h。云南省勐腊县体外法测定抗性率由 1981年的97 4%降至 1999年的 77 8% (P <0 0 1) ,完全抑制裂殖体形成的平均药物浓度由 17 2± 12

云南省恶性疟原虫对氯喹、氨酚喹、哌喹、甲氟喹、奎宁敏感性的体外测定

目的：了解云南省恶性疟原虫对氯喹、氨酚喹、哌喹、甲氟喹及奎宁的敏感性。方法：采用Ｒｉｅｃｋｍａｎｎ体外微量法测定采自云南省瑞丽１１个县、市的恶性疟原虫对以上药物的敏感性。结果：云南省南部、东南部及西部恶性疟原虫对氯喹抗性率分别为９６．７％、７８．９％及９５．７％，ＩＤ５０依次为１２５ｎｍｏｌ／Ｌ、１３６ｎｍｏｌ／Ｌ、及１７６ｎｍｏｌ／Ｌ；对氯酚喹的抗性率分别为１００％、８５．３％及８８．９％，ＩＤ５０依次为５２ｎｍｏｌ／Ｌ、５４ｎｍｏｌ／Ｌ及７２ｎｍｏｌ／Ｌ；对奎宁均为敏感，ＩＤ５０依次为４８０ｎｍｏｌ／Ｌ、３５２ｎｍｏｌ／Ｌ及６０８ｎｍｏｌ／Ｌ。南部及东南部原虫对哌喹的抗性率分别为６８及８８ｎｍｏｌ／Ｌ；结论：云南省恶性疟原虫对４－氨基喹啉类药物普遍产生抗性，其抗性程度来自滇西及其相连的缅甸感染的疟原虫明显高于滇东南；对奎宁及甲氟喹敏感。氯喹。

用pfcrt点突变基因检测技术检测恶性疟原虫氯喹抗药性的初步研究

目的 建立一种恶性疟原虫氯喹抗药性基因pfcrt点突变的检测方法,以判断是否存在氯喹抗药性。方法 根据恶性疟原虫pfcrt基因序列设计巢式PCR引物,以恶性疟原虫DNA为模板扩增出一条包含第76位密码子的DNA片段;扩增产物经限制性内切酶Apo I消化,用琼脂糖凝胶电泳观察恶性疟原虫pfcrt等位基因是否为突变型。结果 31份样本经巢式PCR扩增均出现14 0 bp左右的特异性片段。酶切消化后,9份滤纸血样本中有4例出现1条14 0 bp左右的片段,为突变型pfcrt等位基因,其余5份出现97bp与4 8bp两种酶切片段,为野生型pfcrt等位基因;2 2份血涂片样本中有10份突变型,突变率为4 5 .16 %。14例突变样本中,有1例体内实验氯喹治疗有效。结论 巢式PCR- RFL P法可以快速、高效的检测恶性疟原虫pfcrt基因76位密码子的点突变,并且能够初步应用于恶性疟原虫氯喹抗药性的鉴别。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶的表达及免疫活性鉴定

目的 在大肠杆菌中表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶 (LDHp)与谷胱甘肽S 转移酶 (GST)融合蛋白 ,测定重组蛋白的免疫活性。方法 采用PCR方法特异性扩增恶性疟原虫 (海南株 )乳酸脱氢酶基因 ,经双酶切后克隆入 pGEX 4T 1表达载体中 ,重组蛋白纯化后免疫小鼠制备特异性血清 ,并用琼脂双向扩散法检测效价 ,ELISA、Western bloting检测重组抗原的免疫活性。结果 得到了重组表达的蛋白抗原 ,表达产物能与兔抗恶性疟原虫血清发生反应 ,并能诱导小鼠产生特异性体液免疫应答 ,免疫琼脂扩散法抗体滴度为 1∶16。结论 LDHp在大肠杆菌中获得高效表达且表达产物具有良好的抗原性。

云南和海南两省不同地区恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2基因型的研究

目的 分析云南和海南两省恶性疟原虫的基因型及其分布。方法采用套式PCR法特异扩增MSP2基因中间多态区 ,对恶性疟原虫群体进行基因分型。结果 检测云南省 31例和海南省 2 9例恶性疟原虫患者血清 ,其中分别有 14和 18种不同的MSP2等位基因型 ,其等位基因株存在高度的多态性 ,基因片段大小及分布频率具有地区差异。海南省不同等位基因型虫株混合感染及多重感染现象比云南省严重。

青蒿琥酯与萘酚喹联用延缓恶性疟原虫抗性实验研究

目的 探讨青蒿琥酯与萘酚喹联用是否能延缓恶性疟原虫抗性。方法 用青蒿琥酯与萘酚喹联用(A组)和单用青蒿琥酯(B组)间断刺激体外连续培养的恶性疟原虫,在接触药物前后不同时间用Reickmann体外微量测定恶性疟原虫的敏感性,同时观察每次接触药物后恶性疟原虫恢复正常生长时间。结果 A组用药前及用药后65d青蒿琥酯/萘酚喹的ID50分别为2.42/37.81、1.70/26.73nmol/L。B组用药前及用药后68、129d青蒿琥酯的ID50分别为9.60、30.61nmol/L和85.10nmol/L。A组接触药物后恶性疟原虫第1、2次恢复正常生长时间分别为24、37d,第3次接触药物后连续观察90d,疟原虫未能恢复正常生长。B组疟原虫平均恢复正常生长时间为16.7d。结论 可用体外间断药物刺激培育抗青蒿琥酯恶性疟原虫;青蒿琥酯与萘酚喹联用能有效延缓恶性疟原虫抗性。

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白1基因的分型研究

目的 了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(PfMSP1)等位基因型的分型特征。方法 采用套式PCR方法 ,用几对PfMSP1特异引物扩增疟原虫虫株PfMSP1基因第 2区与第 3区部分片段 ,并对等位基因型代表株的基因片段进行序列分析。结果 39份血样中有 36份恶性疟患者共扩增出 44个PfMSP1基因片段 ,以MAD2 0型为主导型 (占 75 % ) ,K1型为次要型 ,未检出RO33型。两种不同等位基因型的混合感染率为 19 4%。序列分析表明 ,海南省恶性疟原虫虫株的MAD2 0型和K1型第 2区序列与MAD2 0和K1原型序列具有高度同源性。结论 海南省恶性疟原虫虫株存在MAD2 0型和K1型两种等位基因型 ,以MAD2 0型为优势虫株。

双氢青蒿素和奎宁对恶性疟原虫早期配子体作用的随机比较

【目的】研究双氢青蒿素对恶性疟原虫早期配子体的抑杀作用。【方法】仅骨髓带恶性疟原虫早期配子体而骨髓与外周血液均无成熟配子体的患者 11例 ,随机分为A、B 2组。A组 6例口服双氢青蒿素片 7d总量 4 80mg ;B组 5例口服硫酸奎宁片 7d总量 10 50 0mg ,定时取骨髓和外周血液涂片 ,观察两组配子体密度的变化。【结果】A组骨髓早期配子体药后 10d全部转阴 ;而B组全部阳性 ,至药后 14d仍有 2 / 5例阳性。外周血液配子体转阴时间 ,A组为 ( 4 .8± 0 .9)d ;B组为 ( 2 2 .0± 5.8)d。【结论】双氢青蒿素能杀灭恶性疟原虫早期配子体 。

标签引物-套式/多重PCR检测恶性疟原虫和间日疟原虫的研究

目的建立简便、灵敏、低本底、可同时检测恶性疟原虫和间日疟原虫的套式/多重聚合酶链反应(PCR)系统。方法应用标签引物扩增技术、PrimerPremier5.0软件、美国生物信息中心(NCBI-BLAST)网络资源和矩阵试验法优化套式/多重PCR,检测疟疾患者滤纸血样并与镜检结果进行比较。结果新建立的标签引物套式/多重PCR,检测模拟现场滤纸血样的敏感性为恶性疟原虫1～2个虫/μl血,间日疟原虫5～10个虫/μl血。检测71份现场采集的镜检疟原虫阳性滤纸血样(恶性疟24份和间日疟47份)的结果与镜检结果的符合率分别为87.5%和100%。结论通过标签引物扩增技术优化的套式/多重PCR系统,适用于检测现场采集的滤纸血样,其检出低原虫血症的敏感性和鉴定虫种的准确性均优于镜检法,是很有潜力的疟疾诊断技术。

环介导等温扩增技术检测恶性疟原虫的研究

目的环介导等温扩增(LAMP)技术检测恶性疟原虫。方法酚氯仿法提取恶性疟原虫基因组DNA,设计四条扩增恶性疟原虫环子孢子蛋白基因的LAMP引物,以间日疟原虫、弓形虫、卡氏肺孢子虫、人全血DNA为对照,进行LAMP反应。LAMP产物经显色、电泳鉴定。将原虫血症为1.5%的恶性疟原虫血样用正常人血按1∶10倍比稀释为1.5×10-3、1.5×10-4、1.5×10-5、1.5×10-6、1.5×10-7、1.5×10-86个浓度后进行LAMP,检测其敏感性。结果恶性疟原虫检测管经显色后呈绿色(阳性),对照组均呈棕色(阴性)。恶性疟原虫LAMP产物经电泳后呈LAMP特征性梯状条带,对照组均无扩增产物。LAMP可检测恶性疟原虫的敏感度为1.5个疟原虫/107RBC。结论检测恶性疟原虫的LAMP方法特异、敏感及简便。

PCR-RFLP检测输入性恶性疟原虫Pfcrt基因多态性

目的了解来自不同流行区输入性恶性疟原虫Pfcrt基因K76T的点突变情况,探讨恶性疟原虫Pfcrt基因多态性。方法采集2008-2012年从非洲(尼日利亚、赤道几内亚、刚果、利比里亚、安哥拉和马里)和东南业(缅甸和印度尼西亚)等疟疾流行区回国人员恶性疟现症患者血样共72份,根据恶性疟原虫Pfcrt基因序列设计巢式PCR引物,以血样中的恶性疟原虫DNA为模板,进行巢式PCR,扩增产物经限制性内切酶ApoⅠ酶切后鉴定。结果 72份输入性恶性疟现症患者血样中,71份扩增出目的条带。扩增产物酶切结果显示,突变型Pfcrt等位基因41份(57.7%,41/71),野生型Pfcrt等位基因30份(42.3%,30/71)。其中非洲6国.50份血样中,野生型和突变型各25份(50%,25/50);缅甸和印度尼西亚21份血样中,野生型5份(23.8%,5/21),突变型16份(76.2%,16/21)。结论来自不同流行区的恶性疟原虫分离株Pfcrt基因突变出现率不同。

间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因的序列和重组抗原表位分析

目的对间日疟原虫和恶性疟原虫乳酸脱氢酶(LDH)基因的序列及重组抗原的表位进行比较分析。方法根据GenBank中已知的pLDH基因序列(登录号为DQ198262和DQ060151)设计特异性引物,体外扩增间日疟原虫和恶性疟原虫LDH的全长基因,对两序列进行比对分析,用SYFPEITHI软件进行表位预测分析。将Pv-LDH和Pf-LDH基因克隆入pET28a表达载体,转化至大肠埃希菌BL21(DE3)株,加入异丙基-β-D硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,Westernblotting和中和ELISA法鉴定重组蛋白。结果Pv-LDH和Pf-LDH基因的编码区全长均为951bp,编码316个氨基酸,Pf-LDH与参考序列DQ198262完全一致,而Pv-LDH与参考序列DQ060151仅在第666位有一个核苷酸的变异;两者的核苷酸和氨基酸序列的一致性分别为75.1%和90.2%。T细胞表位预测分析结果显示,能识别pLDH抗原表位的人类白细胞抗原(HLA)分子类型共28种,预测的表位数约为180个,相同或相似的表位约占总表位数的75%,Pv-LDH和Pf-LDH特异性表位分别为38个和45个。Westernblotting分析显示,Pv-LDH重组抗原可被疟疾患者血清识别,但反应强度明显低于Pv-LDH重组抗原免疫兔血清。中和ELISA试验结果显示,Pv-LDH抗原对多克隆抗体最高抑制率可达70.3%,而Pf-LDH抗原的最高抑制率仅为30.5%。结论Pv-LDH和Pf-LDH基因的核苷酸序列及其重组抗原均有差异,特异性表位诱导的抗体在整个抗体谱中相对较少。

复式PCR检测恶性疟原虫与间日疟原虫的研究

目的： 建立在同一次扩增中即可鉴别患者感染的疟原虫虫种的复式ＰＣＲ检测方法。方法： 根据恶性疟原虫（Ｐ．ｆ．）中度重复基因序列ｐＢＲＫ１－１４ 和间日疟原虫（Ｐ．ｖ．）线粒体细胞色素Ｃ氧化酶基因ＣＯＩＩＩ合成引物，采用经优化的ＰＣＲ反应体系， 对疟原虫ＤＮＡ模板进行扩增。结果： Ｐ．ｆ．与Ｐ．ｖ．分别被扩增出２０６ 和３７０ ｂｐ 大小的ＤＮＡ片段，与人白细胞ＤＮＡ 无交叉；用该反应体系至少可检测出原虫血症为５×１０－ ７的Ｐ．ｆ．感染和１．０２×１０－ ６ Ｐ．ｖ．感染； 自云南疟疾流行区采集的７８３份滤纸干血滴样本中， 复式ＰＣＲ法阳性检出率为８５．８％ ， 误诊率为０， 漏诊率为０．１％ ， 而镜检法依次分别为８４．９％ 、３．１％ 和１．０％ ， 两者符合率为９５．８％ 。结论： 本复式ＰＣＲ检测疟原虫较镜检敏感、特异， 适用于我国恶性疟与间日疟混合流行区的疟疾诊断、流行病学调查、药物的疗效考核和献血员的筛选等。

云南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1基因分型及测序

目的：确定云南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１（ Ｍ Ｓ Ｐ １）基因分型和探讨 Ｍ Ｓ Ｐ １ 基因多态性的遗传及地理特征。方法：采用巢式 Ｐ Ｃ Ｒ法和引物标记周期反应测定法，对云南疫区恶性疟原虫群体 Ｍ Ｓ Ｐ１ 基因分型，并对代表株进行基因序列分析。结果：３０ 例云南恶性疟患者，检出３８ 个基因型虫株，其中 Ｍ Ａ Ｄ２０ 型是优势虫株， Ｋ１ 次之， Ｒ Ｏ３３ 最少，并存在不同基因株混合感染现象。扩增片段序列分析表明，云南疫区的 Ｍ Ａ Ｄ２０ 型、 Ｋ１ 型和 Ｒ Ｏ３３型均分别与国际上典型的 Ｍ Ｓ Ｐ１、 Ｍ Ａ Ｄ ２０、 Ｋ１ 和 Ｒ Ｏ ３３ 等位基因代表株具有高度的同源性。结论：以 Ｍ Ｓ Ｐ１ 为基因标记物的基因分型法，有助于掌握流行区疟原虫种群的基因特点、分布及流行特征。

恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体的制备

目的制备恶性疟原虫乳酸脱氢酶特异性单克隆抗体.方法克隆、表达恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,并以表达的重组蛋白免疫BALB/c小鼠,采用杂交瘤技术制备单克隆抗体,对所制备的单克隆抗体确定其亚类和效价,蛋白质印迹法(Western blotting) 分析其特异性.结果成功克隆并表达了恶性疟原虫乳酸脱氢酶基因,以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白作为免疫源制备单克隆抗体,共筛选了15株能高效分泌效价在 1∶6 400～1∶51 200 特异抗体的细胞株,抗体亚类为IgG1或IgG2.所有抗体均能唯一识别恶性疟原虫虫源蛋白 Mr 33 000组分,而与疫区非疟疾发热病人的红细胞组分无交叉反应.结论以重组恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白为免疫源成功制备了能识别天然恶性疟原虫乳酸脱氢酶蛋白的特异性单克隆抗体.

Nest-PCR和PCR-RFLP在恶性疟原虫地理株基因分型及多态性研究中的应用

目的分析套式PCR(nest-PCR)和限制性内切酶片段长度多态性(PCR-RFLP)方法在恶性疟原虫地理株裂殖子表面蛋白(MSP2)基因多态性研究中的分型效率及特异性。方法分别在海南省三亚市和云南省腾冲县等地通过静脉采血法采集疟疾患者血样98份,其中恶性疟88份,间日疟10份。另从上海地区的健康人群中抽取10份血样作为阴性对照。用nest-PCR和PCR-RFLP方法分别对疟原虫地理株进行MSP2等位基因分型,并对分型结果进行归纳和比较分析。结果常规nest-PCR方法对于恶性疟原虫地理株MSP2等位基因的总检出效率为79.8%(166/208),其中,对于FC27家族等位基因的检出效率为92.7%(101/109),但对3D7家族等位基因的检出率仅为65.7%(65/99),且无法鉴定具体的等位基因。PCR-RFLP分型法检出效率比nest-PCR法提高了20.2%,且特异性好。结论PCR-RFLP相对于常规的nest-PCR分型法具有检出效率、分辨率和特异性皆高的优点,可以鉴定地理株中具体的等位基因类型。