恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白ELISA定量检测方法的建立及其应用

目的建立恶性疟原虫合子/动合子表面25蛋白（25 KDa Plasmodium falciparum sexual stage protein,Pfs25）的ELISA定量检测方法。方法以双抗体夹心ELISA法为基础,建立Pfs25蛋白的ELISA定量检测方法,并对该方法进行重复性和准确性验证。用建立的方法检测不同重组菌株、CHO细胞中,以及经10 L发酵罐培养菌株纯化各阶段样品中Pfs25蛋白的表达量。结果建立的方法线性范围为0-1.6μg/ml,R2=0.984,检测灵敏度为0.032μg/ml,回收率为81%-119.0%,CV﹤15%。Pfs25-Pet42a/DE3表达后的Pfs25蛋白浓度在2.03-7.26μg/ml;Pfs25-p GAPZαA/GS115、Pfs25-p PICZαA/GS115和（α-Pfs25）8-p AO815/GS115表达后的Pfs25蛋白浓度分别为113、105和280μg/ml;3株Pfs25/CHO细胞表达的Pfs25蛋白浓度分别为106.11、116.89和155.01μg/ml。p PICZαAPfs25/GS115菌株发酵液中,Pfs25蛋白的增加呈先快后慢的趋势,72 h后,目的蛋白增加逐渐平缓;纯化洗脱液3个峰中Pfs25蛋白浓度分别为22.67、42.12和55.27μg/ml,流穿液中Pfs25蛋白浓度仅为0.096μg/ml。结论建立的Pfs25蛋白ELISA定量检测方法可用于疟疾疫苗研究中Pfs25蛋白的定量分析。

恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统的构建及表达

目的构建恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统并进行表达。方法应用基因重组技术构建含pfs25基因的醇氧化酶启动子1(Alcohol oxidase promoter 1,AOX1)重组质粒pICpfs25和三磷酸甘油醛脱氢酶启动子(Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAP)重组质粒pGAPpfs25,取酶切鉴定和测序正确的重组质粒电转化毕赤酵母菌GS115,获得毕赤酵母重组体ICpfs25和GAPpfs25,并构建含两种启动子的酵母重组体IC-GAP/2pfs25,甲醇诱导pfs25基因表达,Western blot分析表达产物的反应原性,ELISA分析各重组体表达上清中Pfs25蛋白的含量。结果各重组体的表达产物经SDS-PAGE分析均可见相对分子质量约25 000的Pfs25蛋白条带,双启动子重组体Pfs25蛋白的表达量约占表达上清的70%,明显高于单一启动子重组体,且双启动子重组体Pfs25蛋白的表达量随着补加甲醇量的增加而逐渐增加;各重组体的表达产物均可与小鼠抗Pfs25单抗4B7特异性结合;双启动子重组体表达上清的ELISA反应明显强于其他重组体表达上清。结论已构建了恶性疟原虫合子表面蛋白Pfs25毕赤酵母双启动子表达系统,两种启动子共同作用可明显提高目的蛋白的表达量。

干扰性疟疾疫苗的研究进展

疟疾仍然是严重危害人类健康的传染性疾病之一,随着疫苗和佐剂的研究进展,疟疾疫苗的研发与应用面临着巨大机遇,现就干扰性疟疾疫苗的研究进展进行简要综述,并从候选疫苗面临的问题、安全性和抗原免疫原性等方面介绍干扰性疟疾疫苗的现状,为进一步优化干扰性疟疾疫苗的研究提供参考。