云南省现场恶性疟原虫3个抗药性基因点突变特征

目的 研究云南省现场恶性疟原虫 3个与抗疟药抗性有关的dhfr、pfmdr1和pfcrt的点突变特征 ,为抗药性恶性疟原虫的分子生物学研究提供背景资料。 方法 应用特异性套式多聚酶链反应 (PCR)和限制性酶切片段长度分析 (RFLP)方法 ,检测恶性疟现症病人干滤纸血样的恶性疟原虫 3个抗药性基因点突变情况。 结果 恶性疟原虫dhfr基因内 16,5 1,10 8和 164位氨基酸有不同程度的突变 ,突变型比例高 ,以Asn -10 8和Ⅰle -5 1为甚 ,频度分别为94 3 %和 81 3 %。野生型 ( 3D7型 )Ser -10 8出现较低频率 8 6% ,而AIa -16出现频率较高 68 6% ;pfcrt基因的 76位点由K突变为T ,突变型 (含混合 )占 96 7% ;野生型仅占 3 4% ;pfmdr1基因 86位点由Asn突变为Tyr ,突变型占 3 4 % ;野生型点 48 7% ;混合型占 16 7%。未发现 12 46位点突变的存在。 结论 云南现场恶性疟原虫与抗疟药抗性有关的3个pfdhfr、pfmdr1和pfcrt基因有较广泛的点突变特征。

恶性疟原虫多药抗性蛋白pfMRP1研究新进展

近几年在疟疾的治疗中，抗疟药抗药性的产生成为疟疾控制的最大难题，随着分子生物学技术的发展，从分子水平上研究恶性疟原虫的抗药性的产生取得了重大突破性进展，恶性疟原虫多药抗性蛋白声fMRPl（TheP．falciparumMultidrugResist—anteProtein1）被认为是和多种药物抗性产生有关的ABC转运蛋白，与抗疟药抗性的产生有密切关系。

恶性疟原虫氯喹抗性机制的研究新进展

参照恶性肿瘤多药抗性(MDR)研究模式而发现的恶性疟原虫的pfmdr1基因不能完全解释其氯喹抗性,但通过氯喹敏感株HB3与氯喹抗性株Dd2杂交而发现的和氯喹抗性有关的cg2基因结合起来,或许能对恶性疟原虫的氯喹抗性作出较为满意的解释。恶性疟原虫的氯喹敏感株可被氯喹诱导发生细胞凋亡样改变而抗性株却不能,又为恶性疟原虫的氯喹抗性机制研究提供了新思路。

海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1(Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征,为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。方法采用巢式PCR(nested-PCR)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法,检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织(WHO)推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果检测的36份血样中,28份成功扩增Pfcrt基因,导致第76位氨基酸由赖氨酸(K)变为苏氨酸(T)的突变型占64.3%,混合型占14.3%,野生型占21.4%;29份成功扩增Pfmdr1基因,导致第86位氨基酸由天冬酰胺(N)变为酪氨酸(Y)的突变型占3.4%,混合型占6.9%,野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示,72.2%(26/36)分离株存在抗性。治疗前恶性疟原虫Pfcrt76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义(P<0.05),而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶性疟原虫Pfcrt基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。

中缅边境恶性疟原虫Pfcrt基因76位点突变研究

目的检测分析中缅边境恶性疟原虫氯喹抗性基因(pfcrt)及其76位点氨基酸的突变情况。方法采用巢式PCR方法扩增含76位点的pfcrt基因,并对扩增产物进行限制性内切酶及测序分析。结果对恶性疟现症病人血样作pfcrt基因的巢式PCR扩增,目的基因片段(145bp)检出率为74.05%(117/158),对PCR扩增阳性的产物进行RELP分析,检查突变型酶切片段,突变率为95.73%(112/117)。结论恶性疟原虫pfcrt基因可以作为一个分子标记用于监测中缅边境地区恶性疟原虫的氯喹抗性。

恶性疟原虫抗药性基因研究现状

目前恶性疟原虫几乎对所有抗疟药物都产生了抗药性,研究与恶性疟原虫抗药性相关的恶性疟原虫氯喹抗药转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗药性基因(Pfmdr1)以及恶性疟原虫Kelch螺旋体蛋白基因(K13)突变有助于建立快速有效的疟原虫抗药性分子监测技术,对实现全球消除疟疾目标有着重要的意义。本文对恶性疟原虫药物抗性基因研究现状进行了综述。

云南省恶性疟原虫氯喹及青蒿素抗性相关基因的联合突变分析

目的分析云南省恶性疟原虫抗氯喹转运蛋白(Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter,Pfcrt)基因和青蒿素抗性相关(K13)基因的联合突变特性。方法收集2012年8月-2015年12月寄生虫病防治信息管理系统登记和报告的云南省恶性疟病例滤纸血样和流行病学史等相关信息,提取疟原虫DNA,巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt基因exon2区和K13基因kelch结构域并测序,测序序列与2655199、PF3D7_1343700参比序列进行比对,用MEGA 5.04、Arlequin 3.01软件分析Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域的单倍型、单倍型间期望杂合度(He)及其群体间的遗传分化指数(Fst)等,用Network 4.6.0软件制作单倍型中介网络进化图,采用Epi Data 3.1软件建立数据库,SPSS 21.0统计学软件进行数据分析。结果共收集恶性疟病例血样234份,Pfcrt基因exon2区、K13基因kelch结构域巢式PCR扩增产物同时成功测序192份。其中,云南省本地感染病例血样12份,自非洲、缅甸感染的病例血样分别为30和150份。218份血样的Pfcrt基因exon2区DNA序列有7种单倍型,He为0.238 5,错义突变序列占83.0%(181/218),72~76位点呈单重突变(CVMNT)、双重突变(SVMNT)、三重突变(CVIET)的比例分别为1.8%(4/218)、6.4%(14/218)和74.8%(163/218),7种单倍型以氯喹敏感型CVMNK为起始,再按单重、双重及三重突变的路径逐步进化。192份血样的K13基因kelch结构域DNA序列有21种单倍型,He为0.044 9,错义突变序列占35.9%(69/192),在16、446、676等9个位点均只发生单重突变,F446I的突变率最高,为25.0%(48/192),21种单倍型的中介网络图显示"星状"布局。云南省本地恶性疟原虫种群与缅甸种群间的Fst最小,为0.020 3。Pfcrt基因的氯喹敏感型CVMNK血样中,K13基因kelch结构域位点突变的比例为20.6%(7/34),氯喹抗性型CVMNT、CVIET血样中的检出比例分别为1/4和36.4%(51/140)。结论云南省疫情报告病例中恶性疟原虫的氯喹、青蒿素相关抗性基因的联合突变率为27.1%,且青蒿素抗性基因突变型之间可能存在种群扩张模式。

2012年和2018年我国输入性恶性疟原虫氯喹抗性基因多态性分析

目的对2012年和2018年我国输入性恶性疟原虫样本氯喹抗性分子标记位点基因多态性进行检测,分析恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Plasmodium falciparum chloroquine re sistant transporter,Pfcrt)第72~76位密码子抗性相关位点突变类型,并分析不同输入来源样本的特异性。方法收集2012年和2018年国家疟疾诊断参比实验室674例输入性恶性疟病例滤纸血样本,以样本中恶性疟原虫7号染色体上Pfcrt基因第72~76位点为扩增片段,采用巢式PCR法进行扩增并测序,对目的产物片段测序结果、地理分布等特征进行统计分析。结果2012年和2018年我国674例输入性恶性疟病例中,95.5%(644/674)来自非洲,其余4.5%(30/674)来自东南亚和大洋洲(巴布亚新几内亚);非洲又以西非和中非为主(占非洲样本的80.4%,518/644)。共检测到C72S、M74I、N75E、K76T 4个位点突变和5种单体型类型(CVMNK、CVIET、SVMNT和两种混合型),其中CVMNK与CVIET为非洲和东南亚地区恶性疟原虫共有的单体型类型,SVMNT仅在东南亚(缅甸)和巴布亚新几内亚输入样本中检测出;2种混合型为CVMNK/CVIET和CVMNK/SVMNT,前者在非洲和东南亚输入样本中分布,后者仅在东南亚缅甸来源样本中检出。自非洲输入的样本野生型较多,占77.7%(478/615);而自东南亚和巴布亚新几内亚输入的样本中,抗性分子标记样本占68.0%(17/25),两者差异有统计学意义(χ^2=28.5,P<0.05)。非洲不同地区来源样本中,抗性基因比例和野生型构成差异有统计学意义(P<0.01),西非野生型所占比例最低。结论2012年和2018年我国674例输入性恶性疟病例样本中,自东南亚输入的恶性疟原虫Pfcrt基因第72~76位点抗性基因比例和分子多态性均较非洲来源样本高。

2015年河南省输入性恶性疟原虫Pfcrt基因的多态性分析

目的 对河南省2015年输入性恶性疟患者血样的恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白（Plasmodium falciparum chloroquine resistant transporter，Pfcrt）基因进行检测，分析其基因多态性。 方法 采集河南省2015年132例输入性恶性疟患者的血样，并收集患者相关信息。提取患者血样中恶性疟原虫基因组DNA，采用已有的Pfcrt基因序列引物，进行巢式PCR扩增，扩增产物经ApolⅠ酶切和测序，分析输入性恶性疟原虫Pfcrt基因多态性及其分布情况。 结果 132例输入性恶性疟患者以男性青壮年为主，均为自非洲19个国家的劳务返乡人员，其中以西非居多，占38.6%（51/132），其他依次为中非（占26.5%，35/132）、南非（25.0%，33/132），东非（占8.3%，11/132）和北非（占1.5%，2/132）。患者血样DNA经巢式PCR扩增，均获得约145 bp的特异性片段。扩增产物经ApolⅠ酶切，66.7%（88/132）患者血样的扩增产物被完全酶切，出现114 bp和31 bp两个片段；32.6%（43/132）不能被酶切，仅出现145 bp单个片段；0.8%（1/132）则酶切不完全，产生145 bp、114 bp和31 bp等3个片段。测序结果显示，132份患者血样的扩增产物经测序获得的Pfcrt基因序列，与氯喹敏感株3D7序列比对，其中43份血样（占32.6%）的Pfcrt基因序列编码的74、75和76位氨基酸碱基由ATG、AAT和AAA突变为ATT、GAA和ACA，即M74I、N75E和K76T，为突变型（CVIET）；1份血样（占0.8%）的Pfcrt基因序列编码的74～76位氨基酸碱基则突变为ATG/T、A/GAA/T和AA/CA，为混合型（CVM/I、N/E/D/K、T/K）；88份血样（占66.7%）的Pfcrt基因序列未发生改变，为野生型（CVMNK）。自西非输入的恶性疟病例突变型所占比例最多，为41.2%（21/51），其他依次为东非（4/11）、南非（30.3%，10/33）和中非（22.9%，8/27），三者比较差异无统计学意义（χ^2=4.07，P＞0.05）。自北非输入的2例均为野生型；1例基因混合型自西非输入。 结论 2015年河南省自非洲19个国家输入的恶性疟原虫Pfcrt基因存在3种类型，野生型（CVMNK）、突变型（CVIET）和混合型（CVM/I、N/E/D/K、T/K），野生型（CVMNK）所占比例最高（66.7%）；自西非地区输入的突变型（CVIET）所占比例最多（41.2%）。

输入性恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因突变关联性分析

目的了解输入性恶性疟原虫氯喹抗性转运蛋白基因(Pfcrt)和恶性疟原虫多药抗性基因1(pfmdr1)相关位点突变情况及其关联性。方法 2009-2016年,采集武汉市从非洲和东南亚等回国人员恶性疟患者血样,利用巢式PCR扩增恶性疟原虫Pfcrt和pfmdr1基因,分别用限制性内切酶ApoⅠ、AseⅠ和EcoRv对产物进行酶切,分析相关位点的突变性。结果 232例输入性恶性疟患者Pfcrt76和pfmdr186、1042、1246位点的突变率分别为55.2%、17.2%、5.2%和8.6%,pfmdr1总突变率为26.3%;东南亚患者血样未检出pfmdr186和pfmdr11246位点突变;非洲输入性恶性疟患者Pfcrt76突变和未突变中pfmdr186、1042、1246位点及pfmdr1总突变率分别为28.6%、3.8%、12.4%、36.2%和10.4%、2.1%、7.3%、17.7%。患者症状与Pfcrt76、pfmdr186、1042、1246位点突变连锁不平衡分析,D′和r^2分别为0.230和0.018、0.290和0.004、0.996和0.012、0.150和0.035。结论输入地为非洲和东南亚缅甸的恶性疟原虫pfmdr1基因突变位点存在差异,Pfcrt76突变与pfmdr1突变和pfmdr186点突变呈正相关。