恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因,并进行序列分析。方法根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因,并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序,用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株PfSSP2基因序列,酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明,所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp,编码559个氨基酸残基。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代,1处氨基酸序列增加;各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7%以上。结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 为了探讨恶性疟原虫FCC - 1/HN株裂殖子表面蛋白 - 2 (MSP - 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组真核表达质粒pBK/MSP - 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8w后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN -γ和IL - 2的产生。结果 与对照组相比 ,疫苗组CD+ 4CD8+ T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN -γ有一个高浓度的分泌。结论 恶性疟原虫FCC - 1/HNMSP -

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2 DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 探讨疟原虫FCC 1/HN株裂殖子表面蛋白 2 (MSP 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。 方法 将重组真核表达质粒PBK/MSP 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8周后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN γ和IL 2的产生。 结果 与对照组相比 ,疫苗组CD4+CD8+T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN γ有高浓度的分泌。 结论 恶性疟原虫FCC 1/HNMSP

恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体与按蚊cecropin A融合基因的构建、原核表达及生物学活性的初步分析

根据按蚊偏嗜性密码子对鼠源性恶性疟原虫环子孢子蛋白单链抗体2a10基因进行改造,并融合按蚊抗菌肽cecropin A编码基因。将获得的cecrop-m2a10融合基因克隆入原核表达载体pET32a(+)中,对表达产物进行SDS-PAGE、Western-blot分析并利用琼脂糖扩散法检测其抗菌活性。结果对鼠源性环子孢子蛋白单链抗体2a10中6种氨基酸的170个核苷酸进行了改造,融合cecropinA编码基因,成功构建了cecrop-m2a10融合基因。靶基因在大肠杆菌中以融合蛋白和包涵体的形式高效表达,包涵体经尿素溶解变性及透析复性后表达蛋白的纯度达75%并具备抗大肠杆菌DH5α的活性。本实验为进一步研究cecrop-m2a10在转基因蚊中的多重抗病原效应提供了基础。

环氧化酶-2、c-erbB-2和Ki67在结直肠癌中表达及其临床意义

目的:探讨环氧化酶-2(COX2)、c-erbB-2、Ki67在结直肠癌中的表达,相互关系及其临床意义。方法:采用免疫组化SP法检测结直肠癌中三者的表达。结果:结直肠癌组中,(1)COX2、c-erbB-2蛋白阳性表达与淋巴结转移及Duckes分期有关;(2)COX2、c-erbB-2、Ki67蛋白表达水平,两两间皆呈正相关;(3)三者联合分析显示:COX2(+)c-erbB-2(+)组的Ki67平均标记指数显著高于单独COX2或c-erbB-2阳性,或共同阴性组Ki67的表达。结论:COX2、c-erbB-2及Ki67在结直肠癌发生发展中起着重要作用,三者联合检测有助于结直肠癌的细胞增殖活性,恶性程度的判断。

BCG载体携带恶性疟MSP-1和MSP-2基因免疫小鼠实验研究

目的研究恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)和表面蛋白-2(MSP-2)与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法将重组pBCG/MSP-1和pBCG/MSP-1-2多价疫苗经皮下注射BALB/c小鼠,经多价疫苗免疫8周后,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化,并体外培养脾细胞,用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生;用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化,体外测定了抗体介导的抑制实验。结果与对照组相比,疫苗组CD4+和CD8+T淋巴细胞有显著性增高,体外培养的脾细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时,免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应,抗体对原虫的增殖产生明显抑制。结论恶性疟原虫FCC-1/HNpBCG/MSP-1和pBCG/MSP-2价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。

鼻腔鼻窦恶性肿瘤中Cox-2表达及临床意义

鼻腔鼻窦恶性肿瘤（sinonasal malignacies，SNMs）因位置隐蔽、诊断时局部浸润严重、淋巴结转移较少、术后局部复发多，且病理类型多，不同病理类型生存率差异较大，预后差［1］。近年来，研究发现环氧化酶-2（Cox-2）的高表达与多种恶性肿瘤的发生、发展相关，也有针对SNMs与Cox-2的研究报道［2］，但多数是小样本，且单一病理类型的研究。本文通过用免疫组化检测151例不同病理类型SNMs的肿瘤组织、瘤旁组织、鼻息肉及正常鼻黏膜中Cox-2蛋白的表达，探讨其临床意义。

川芎嗪对人皮肤恶性黑素瘤A875细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响

目的探讨川芎嗪对人皮肤恶性黑素瘤A875细胞增殖和凋亡相关蛋白表达的影响。方法体外培养A875细胞,采用不同浓度(0 mg/mL、0.5 mg/mL、1 mg/mL、2 mg/mL)川芎嗪分别作用A875细胞48 h、72 h,采用四甲基偶氮唑盐法检测各组细胞存活率。采用不同浓度川芎嗪(0 mg/mL、2 mg/mL)分别作用A875细胞0 h、48 h、72 h,采用蛋白免疫印迹法检测环氧化酶-2(COX-2)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(Caspase3)蛋白相对表达水平,并分析经2 mg/mL川芎嗪干预48 h、72 h后两者表达水平的相关性。结果经川芎嗪干预48 h、72 h后,A875细胞的细胞存活率随着川芎嗪浓度的升高而降低(均P<0.05);当川芎嗪浓度为1或2 mg/mL时,A875细胞的细胞存活率随着药物作用时间延长而下降(均P<0.05)。2 mg/mL川芎嗪干预0 h、48 h、72 h,A875细胞中COX-2蛋白表达水平依次降低,Caspase3蛋白表达水平依次升高;与0 mg/mL川芎嗪干预比较,应用2 mg/mL川芎嗪干预48 h和72 h后细胞中COX-2蛋白表达水平更低,Caspase3蛋白表达水平更高(均P<0.05)。2 mg/mL川芎嗪干预A875细胞48 h、72 h后,A875细胞的COX-2蛋白与Caspase3蛋白的相对表达水平均呈负相关(均P<0.05)。结论川芎嗪能抑制A875细胞增殖,并可抑制COX-2活化、上调Caspase3表达水平而促进细胞凋亡。

新型N-(2-芳基氨基苯基)-2,3-二苯基喹喔啉-6-磺胺类药物作为潜在抗疟疾、抗真菌和抗细菌药物的合理药物设计、合成和生物学评价

目的磺胺、磺胺嘧啶和氨苯砜是第一批通过破坏叶酸生物合成过程来治疗疟疾的磺胺类药物,叶酸生物合成过程是寄生虫存活的关键。因此,我们旨在通过合理的药物设计方法合成新型N-(2-芳基氨基苯基)-2,3-二苯基喹喔啉-6-磺酰胺衍生物。方法按常规方法合成所有化合物,并用光谱分析(1H核磁共振和质谱)对产物进行表征。使用薄层色谱法(TLC)监测反应进程。分析了所有衍生物在疟原虫半胱氨酸蛋白酶falcipain-2变构位点的有效结合模式。采用肉汤稀释法测定抗菌和抗真菌活性。结果S6(N-(2-噻唑-4-基)-乙酰基-氨基苯基)-2,3-二苯基喹喔啉-6-磺酰胺与S9(N-(1H-苯并[d]咪唑-2-基)氨基苯基)-2,3-二苯基喹喔啉-6-磺酰胺形成5个氢键;S8(N-(2-1H-咪唑-2-基)氨基苯基)-2,3-二苯基喹喔啉-6-磺酰胺和S10(N-(1-苯并[d]咪唑-5-基)氨基苯基)-2,3-二苯基喹喔啉-6-磺酰胺与酶的变构位点形成四个氢键。考虑到与目标酶的对接分数和氢键的形成,新的衍生物被加工用于湿实验室合成。所有新合成的衍生物都具有体外抗疟疾、抗真菌和抗菌活性。与标准品相比,所有衍生物对恶性疟原虫株表现出足够的敏感性。此外,化合物S9和S10显示出最有效的双重抗微生物和抗疟疾活性。它们在分子对接研究中也显示出强大的分子相互作用。结论基于以上结果,我们认为N-(2-芳基氨基苯基)-2,3-二苯基喹喔啉-6-磺酰胺衍生物具有作为抗疟药、抗真菌药和抗菌剂的优异生物潜力。

胃肠道间质瘤基质金属蛋白酶-9、环氧化酶-2和血管生长因子的表达及其临床意义

研究结果表明,环氧化酶-2（COX-2）、基质金属蛋白酶-9（MMP-9）和血管生长因子（VEGF）在多种肿瘤组织中高表达,参与肿瘤的血管形成、局部浸润和转移,与肿瘤的发生、进展关系密切[1-2].本实验旨在检测COX-2、MMP-9和VEGF在恶性胃肠道间质瘤（GIST）中的表达,探讨其表达与GIST临床病理特征的关系.

BCG/恶性疟MSP-2、CSP多价疫苗免疫小鼠应答类型研究

目的 探讨恶性疟原虫FCC 1/HN株裂殖子表面蛋白 2 (MSP 2 )和环子孢子蛋白 (CSP)与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组pBCG/MSP 2和pBCG/CSP多价疫苗经皮下注射BALB/c小鼠 ,小鼠经多价疫苗免疫 8周后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN γ和IL 2的产生 ;用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化 ,在体外测定抗体介导的抑制实验。结果 与对照组相比 ,疫苗组CD4 + 和CD8+ T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN γ有高浓度的分泌。同时 ,免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了较高水平的IgG类抗体反应 ,抗体对原虫的增殖产生明显抑制。结论 恶性疟原虫FCC 1/HNpBCG/MSP

两种佐剂系统对重组疟疾蛋白疫苗免疫效果的影响

目的比较两种佐剂系统对重组疟疾蛋白疫苗免疫效果的影响。方法将BALB/c小鼠随机分为02、03佐剂组、Pr组和NS组,每组24只。02、03佐剂组、Pr组分别经大腿内侧肌肉注射15μg恶性疟原虫融合蛋白-2.9(combine protein 2.9 of Plasmodium falciparum,PfCP-2.9)+15μg恶性疟原虫环孢子蛋白-2(circumsporozoite protein of Plasmodium falciparum 2,PfCSP-2)+02佐剂系统[75μg BCG-CpG-DNA+0.2 mg A(lOH)3)]、15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2+03佐剂系统[(50μg PolyI:C+0.2 mg A(lOH)3]和15μg PfCP-2.9+15μg PfCSP-2,NS组注射生理盐水。隔周免疫1次,共5次,于初次免疫2周后每周内眦采血,分离血清,采用ELISA法检测血清IgG值及抗体效价;于2、3、4、5次免疫后2周,无菌取小鼠脾脏,制备脾细胞悬液,采用ELISPOT法,对分泌IFNγ、IL-2、IL-4的特异性淋巴细胞数量进行检测。结果 02佐剂组小鼠血清IgG抗体效价在2次免疫后2周即可达到1∶105,03佐剂组在3次免疫后1周达到1∶105,而Pr组在5次免疫后2周达到1∶105,4次免疫后02、03佐剂组达到最高值。分泌IL-4的特异性淋巴细胞数,03佐剂组均明显高于02佐剂组、Pr组及NS组,02佐剂组3、4、5次免疫后才明显高于NS组,5次免疫后才明显高于Pr组(P均<0.05);分泌IL-2的特异性淋巴细胞数,02佐剂组与03佐剂组比较差异无统计学意义(P>0.05),3次免疫后02、03佐剂组均明显高于NS组,且03佐剂组也明显高于Pr组,4次免疫后02、03佐剂组、Pr组均明显高于NS组(P均<0.05),但三者之间差异无统计学意义(P>0.05);分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数,02、03佐剂组、Pr组间差异无统计学意义(P>0.05),且03佐剂组在3次免疫后明显高于NS组,而02佐剂组、Pr组在5次免疫后才明显高于NS组(P均<0.05);02、03佐剂组分别在3、5次免疫后分泌IL-4的特异性淋巴细胞数量达到最高,且分别在5、3次免疫后,分泌IL-2的特异性淋巴细胞数量达到最高,二者均需5次免疫后分泌IFNγ的特异性淋巴细胞数量才可达到最高。结论 03佐剂系统可更加有效地增强重组疟疾蛋白疫苗的免疫原性,诱导机体产生较强的细胞免疫和体液免疫反应,5次免疫后可达到最佳免疫效果。