恶性疟原虫感染的红细胞膜表面蛋白1模拟肽的筛选及鉴定

目的筛选恶性疟原虫感染的红细胞膜表面蛋白1(PfEMP-1)的噬菌体表位模拟肽。方法细胞间粘附分子ICAM-1模拟12肽(KLYLIAEGSVAA)能模拟ICAM-1分子与疟原虫感染红细胞结合的功能,以展示该短肽的噬菌体为靶,采用差减筛选法(subtraction method)对噬菌体环7肽库进行3轮筛选,通过ELISA、竞争抑制试验鉴定获得的噬菌体短肽与ICAM-1之间的结合特性。对阳性克隆进行DNA及氨基酸序列分析并与PfEMP-1氨基酸序列进行同源性比较。结果ELISA筛选22个克隆有3个为阳性克隆,氨基酸序列分析显示2个克隆的展示的短肽序列为C-ITAVPVR-C,另1为C-DIMGGYN-C。同源性分析未发现2短肽序列与野生型MC株恶性疟原虫PfEMP-1的氨基酸序列有同源性。但竞争抑制试验显示3个阳性克隆均可与15.2单抗间互相竞争抑制与ICAM-1分子的结合。结论获得2种PfEMP-1噬菌体构象表位模拟肽,两短肽能与ICAM-1分子特异性结合。

恶性疟原虫红细胞表面膜蛋白1DBLα区不同区段与血型抗原的结合特性分析

根据大肠杆菌密码子组成特点，重新优化并合成FCR3S1．2株恶性疟原虫红细胞表膜蛋白1（PfEMPI）DBLα区基因序列，利用PCR的方法，将优化后的基因序列分为3段。分别将全长基因和3个基因片段在大肠杆菌中表达、纯化。通过重组蛋白与血型抗原的亲和试验，分析功能区与血型抗原是否具有亲和力。结果表明，重组的PfEMPl一DBLα全长蛋白质及分段表达的重组蛋白对血型抗原A、B均有特异性的亲和力。本实验结果为揭示恶性疟原虫的主要致病分子与人体细胞相互作用机制提供了实验依据。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1-17区基因的原核表达、纯化及表达产物鉴定

目的 为进一步研究和应用恶性疟原虫裂殖子表面蛋白１ 的１７区基因（ＭＳＰ１－ １７），本文原核表达了ＦＵＰ株ＭＳＰ１ 的１７ 区基因，并纯化及鉴定了表达蛋白。方法 将ＭＳＰ１－ １７ 基因片段克隆入原核表达载体ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １，形成ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７。ＩＰＴＧ诱导ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７ 转化的ＢＬ２１菌，纯化并用ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体鉴定表达产物。结果 成功地构建了ｐＧＥＸ－ ４Ｔ－ １／ＭＳＰ１－ １７，转化菌经诱导表达出与ＧＳＴ融合的蛋白（约４０ＫＤ），纯化后纯度达７２％ ，ＭＳＰ１－ １７ 特异性单克隆抗体可识别表达蛋白。结论 成功表达并纯化了ＭＳＰ１－ １７ 蛋白，为深入研究和应用ＭＳＰ１－ １７

恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白对裂殖子入侵人红细胞的抑制作用

恶性疟原虫裂殖子表面主要蛋白－１（ＭＳＡ１），又称Ｐ１９５，与人红细胞具有结合作用，这种结合是裂殖子识别红细胞的基础。为了确定Ｐ１９５蛋白与识别有关的位点，本研究在大肠杆菌中分８段表达了ＭＡＤ２０株恶性疟原虫的Ｐ１９５蛋白。各段蛋白用镍亲和层析柱分离，然后复性。在体外培养疟原虫至成熟裂殖体期，将各段蛋白分别加入到培养基上清中，继续培养２４小时，检查红细胞感染率，通过感染率了解各段蛋白对裂殖子入侵红细胞的影响。结果发现Ｐ１９５蛋白中氨基酸序列为３８４－５９５的一段蛋白（Ｍ６），呈剂量依赖性抑制恶性疟原虫裂殖子入侵人红细胞，且Ｍ６对疟原虫生长无细胞毒性作用。这表明Ｍ６可能含红细胞结合位点，该位点与裂殖子竞争性结合红细胞。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 为了探讨恶性疟原虫FCC - 1/HN株裂殖子表面蛋白 - 2 (MSP - 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组真核表达质粒pBK/MSP - 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8w后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN -γ和IL - 2的产生。结果 与对照组相比 ,疫苗组CD+ 4CD8+ T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN -γ有一个高浓度的分泌。结论 恶性疟原虫FCC - 1/HNMSP -

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2 DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 探讨疟原虫FCC 1/HN株裂殖子表面蛋白 2 (MSP 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。 方法 将重组真核表达质粒PBK/MSP 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8周后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN γ和IL 2的产生。 结果 与对照组相比 ,疫苗组CD4+CD8+T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN γ有高浓度的分泌。 结论 恶性疟原虫FCC 1/HNMSP

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端基因导入烟草叶绿体的研究

目的将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端msp1-42基因(3D7株)导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。方法利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫(3D7株)msp1-42基因的引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出msp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp。通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500mg/L壮观霉素的选择压力下筛选抗性植株,采用PCR鉴定抗性植株的msp1-42基因及aadA基因,对鉴定阳性植株进行同质化筛选(叶片切碎、在含500mg/L壮观霉素分化培养基上分化出新的植株)3轮以上,并采用多重PCR分析其同质化情况。结果构建了恶性疟原虫msp1-42基因的叶绿体表达载体LRrrmsp。基因枪转化后获得6个转化子,转化频率为0.6个/枪。转化3～5d后,小块叶片开始增大增厚,并逐渐由绿色变为黄绿色,7～10d后黄化或白化,再经约30d的筛选培养,叶片上出现绿色小芽。PCR检测抗性植株的msp1-42及aadA基因,分别扩增出约900bp与500bp的条带,与预期相符。多重PCR分析从经过3轮同质化筛选植株的叶绿体基因中扩增出与未转基因烟草对照大小一致的弱条带,表明经过3轮同质化筛选的转基因植株仍含有未插入外源基因的叶绿体基因组。结论获得含恶性疟原虫msp1-42的烟草叶绿体表达载体,并将恶性疟原虫msp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得尚未完全同质化的转基因烟草。

套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究

目的 了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(pfMSP1)和表面蛋白 2 (pfMSP2 )等位基因型的分型特征。方法 采用套式PCR法分别扩增pfMSP1基因第 2区与第 3区部分片段和pfMSP2基因的中间可变区 (第 3区 ) ,对海南省恶性疟原虫分离株进行基因分型。结果 5 5份血样中有 5 2份恶性疟疾患者扩增出pfMSP1基因片段 ,以MAD2 0型为主导型 (84 6 % ) ,K1型为次要型 ,未检出RO33型 ,两种不同等位基因混合感染率为 15 4 %。同时 ,5 5份血样中有 5 3份恶性疟疾患者扩增出pfMSP2基因片段 ,以 3D7型为主导型 (83% ) ,FC2 7型为次要型 ,混合感染率为 17%。结论 海南省恶性疟原虫的MSP1存在MAD2 0型和K1型两种等位基因型 ,以MAD2 0型为优势虫株 ;其MSP2存在 3D7型和FC2 7型两种等位基因型 ,以 3D7等位基因家族为主。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1 DNA与改良痘苗病毒组合疫苗诱导小鼠抗体应答

目的探索DNA与改良痘苗病毒(MVA)组合免疫对增强恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)抗体应答的作用。方法以人工合成MSP1全基因为基础分别构建DNA免疫质粒VR1020/190和重组MVA,单用VR1020/190或与表达质粒GM-CSF共同对小鼠进行初始免疫后,用重组病毒追加强化,采用DNA/MVA组合方案免疫BALB/c小鼠,ELISA测定血清IgG及其亚类水平,经腹腔接种转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19进行攻击。结果DNA免疫能有效诱导小鼠产生抗MSP1-190抗体,其终点稀释度为1∶2500,GM-CSF质粒共免疫组抗体的终点稀释度为1∶11150,抗体亚类的测定表明GM-CSF质粒显著促进了IgG1类抗体应答,MVA追加可使单独免疫组和共免疫组抗体分别增加53和10倍;两实验组产生了水平相近的抗19000抗体(1∶32000),其含量占血清中MSP1总IgG的1/4-1/3。经转基因伯氏疟原虫Pb-PfM19攻击后小鼠的存活时间并没有明显延长(P>0.05)。结论采用合成MSP1全基因进行DNA/MVA组合免疫可诱导小鼠产生显著的抗体应答,抗体的详细特性和保护作用正在进一步研究中。

恶性疟原虫PfEMP-1的研究进展

目的恶性疟原虫红细胞表面蛋白-1(PfEMP-1)是由var基因家族编码的一种蛋白质,它是疟原虫在宿主体内存活的重要蛋白。不但参与疟原虫的抗原变异,调节人的免疫应答,而且还是重要的粘附分子。本文对PfEMP-1的基础结构特征及其与临床的病理联系,及以其为基础的抗疟疫苗研发方面的研究进展作一综述。

恶性疟原虫顶端膜抗原-1(P.f AMA1)基因在大肠杆菌中的表达及表达产物的纯化

本文采用PCR方法自P .f基因组中扩增了编码AMA 1完整胞外域及其相应结构域的基因片段 ,定向克隆入原核表达载体pET 16b和pET 30a (+) ,经测序确证后将重组子转入BL2 1(DE3)进行诱导表达 ,用SDS PAGE鉴定 ,对可溶性和包涵体形式的重组蛋白分别采用天然状态和变性状态下的Ni离子亲和层析进行纯化 ,变性蛋白再在GSH GSSG氧化还原条件下经透析重新折叠复性。所得纯化产物为进行有关AMA

在减毒伤寒杆菌CVD908疫苗株中四环素诱导表达恶性疟原虫MSP1-31片段基因

目的 :用含 PL tet O启动子的 p ZE11质粒在减毒伤寒杆菌 CVD90 8疫苗株中表达恶性疟原虫 MSP1- 31片段基因。 方法 :构建受四环素诱导调控的重组质粒 p ZE11/ MSP1- 31,将该重组质粒用电穿孔转化法转化入减毒伤寒杆菌 CVD90 8/ tet R疫苗株中 ,用免疫印迹反应检测 MSP1- 31在 CVD90 8/ tet R株中的四环素诱导表达。结果 :构建了重组的 p ZE11/ MSP1- 31质粒 ,免疫印迹反应显示该 MSP1- 31基因在 CVD90 8/ tet R株中得到有效表达 ,且依赖于四环素的存在。结论 :成功地构建了由四环素诱导的、表达恶性疟原虫 MSP1- 31的减毒伤寒杆菌疫苗株。

赤道几内亚比奥科岛恶性疟原虫MSP-1和MSP-2基因多态性研究

目的研究赤道几内亚比奥科岛(Bioko Island)恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白1(PfMSP-1)基因和裂殖子表面蛋白2(PfMSP-2)基因分型。方法从比奥科岛采集疟疾患者血样181份,用显微镜法和荧光定量PCR鉴定虫种。采用巢式PCR分别扩增PfMSP-1和PfMSP-2中具有型特异性的片段,进行等位基因分型。结果 PfMSP-1基因分型:181份恶性疟患者血样中有178份扩增出PfMSP-1基因片段(98.34%),其中K1、MAD20和RO33基因型片段分别为171份(94.48%)、175份(96.69%)和126份(69.61%)。混合感染率为97.24%;PfMSP-2基因分型:181份血样中有173份PfMSP-2基因片段(95.58%),其中48份(26.52%)单独扩增到3D7型基因片段,4份(2.21%)单独扩增到FC27型基因片段,混合感染率为66.85%。结论赤道几内亚比奥科岛PfMSP-1和PfMSP-2等位基因型分布范围极广。混合感染是比奥科岛疟疾的主要类型。

非洲输入性恶性疟病例裂殖子表面蛋白1等位基因型检测

目的了解输入性恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1(MSP1)等位基因型特征。方法采集非洲疟疾流行区回国人员中恶性疟现症患者血样,采用巢式PCR方法,用恶性疟原虫MSP1基因特异引物扩增疟原虫虫株MSP1基因第2区与第3区部分片段,并对MSP1等位基因型进行分析。结果 135例输入性恶性疟患者中检出MSP1等位基因117例,检出率为86.7%。117例扩增阳性的患者中,MAD20、K1、RO33、MAD20+K1、MAD20+RO33、K1+RO33和MAD20+K1+RO33型的检出率分别为6.0%(7/117)、36.8%(43/117)、20.5%(24/117)、6.8%(8/117)、3.4%(4/117)、17.1%(20/117)和9.4%(11/117),其中混合型感染占36.8%(43/135),MSP1等位基因多重感染平均数(MOI)为1.46。MAD20型、K1型和RO33型恶性疟患者中重症患者比例差异无统计学意义(P>0.05);74例单一型和43例混合型感染者中重症患者比例分别为25.7%(19/74)和32.6%(14/43),2种感染者回国前在国外停留的平均天数分别为(241±176)d和(285±216)d,两者间差异均无统计学意义(P>0.05)。结论非洲输入性恶性疟患者感染的疟原虫MSP1基因的3种基因型和4种混合型均存在,以K1型和RO33型为优势基因型。

恶性疟裂殖子表面蛋白1合成基因在毕赤酵母中的表达

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1是当今疟疾疫苗主要的候选抗原。由于天然MSP1基因AT含量异常高(为 74% ) ,使得克隆全长天然基因无法实现。本文已全合成了msp1基因 (4940bp) ,解决了该天然基因在异源系统中不稳定的问题。为制备大量msp1重组蛋白进行疫苗有效性试验 ,本研究建立了msp1基因在毕赤酵母中的表达 ,将合成的msp1基因克隆到毕赤酵母胞内表达载体 pPIC3 5 ,构建了重组质粒 pPIC3 5 /msp1,用电击转化毕赤酵母得到重组转化子 ,经PCR证实msp1基因已整合于毕赤酵母染色体中。含有重组表达质粒的毕赤酵母菌经甲醇诱导后表达出全长msp1重组蛋白。表达产物能与识别MSP1分子二硫键依赖构象表位的特异性单抗发生很强的反应 ,表明msp1重组蛋白至少在该表位构象上与天然蛋白一致。从毕赤酵母中分离得到大量msp1为开展该蛋白的结构与功能 ,特别是测定其疟疾保护性免疫提供可能。

BCG载体携带恶性疟MSP-1和MSP-2基因免疫小鼠实验研究

目的研究恶性疟原虫FCC-1/HN株裂殖子表面蛋白-1(MSP-1)和表面蛋白-2(MSP-2)与BCG多价疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法将重组pBCG/MSP-1和pBCG/MSP-1-2多价疫苗经皮下注射BALB/c小鼠,经多价疫苗免疫8周后,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化,并体外培养脾细胞,用夹心ELISA法测定IFN-γ和IL-2的产生;用血清学方法测定免疫鼠IgG抗体的动态变化,体外测定了抗体介导的抑制实验。结果与对照组相比,疫苗组CD4+和CD8+T淋巴细胞有显著性增高,体外培养的脾细胞IFN-γ有一个高浓度的分泌。同时,免疫鼠血清对疟原虫抗原都表现了一个较高水平的IgG类抗体反应,抗体对原虫的增殖产生明显抑制。结论恶性疟原虫FCC-1/HNpBCG/MSP-1和pBCG/MSP-2价疫苗诱导了一个以细胞免疫为主的免疫应答类型。

3种恶性疟原虫红内期抗原基因的测序和序列分析

目的 测定我国恶性疟原虫海南株 (FCC1/ HN)谷氨酸富集蛋白 (GARP)、丝氨酸重复抗原 (SERA)和裂殖子表面蛋白 1(MSA1)基因序列 ,并进行序列分析。 方法 采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC1/ HN株基因组 DNA中扩增 GARP、SERA和 MSA1基因片段 ,分别插入到测序载体上进行测序。应用 DNAstar软件辅助分析 3种抗原基因的结构及 3种抗原在不同恶性疟原虫株间的分化情况。 结果 恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP基因全长 2 2 6 3bp,编码6 82个氨基酸残基 ,谷氨酸占 2 3.6 1% ,包含 5个典型的氨基酸重复序列 ;SERA基因全长 344 8bp,编码 995个氨基酸残基 ,丝氨酸含量为 10 .6 5 % ,包含 1个连续 32个丝氨酸 (S)残基的序列 ;MSA1基因全长 5 0 85 bp,编码 16 94个氨基酸残基 ,MSA1的氨基酸序列符合 MAD2 0型特征。恶性疟原虫 FCC1/ HN株与 3D7、FC2 7株 GARP的序列差异主要集中于 C-末端 ;FCC1/ HN株与 FCR3、3D7、FCBR、Hondulas- 1株 SERA的序列差异主要集中于 N-端。FCC1/ HN株与MAD2 0、3D7、HN1、HN2、FC2 7、RO- 71、RO- 33、CAMP和 Palo- alto株 MSA1的同源性高 ,K1和 WEL L COME株 MSA1的同源性高 ,各分离株 MSA1的序列差异主要处于第 2至 16分区。 结论 了解了恶性疟原虫 FCC1/ HN株 GARP、SERA和 MSA1的?

大肠埃希菌表达的恶性疟原虫裂殖子表面蛋白MSP1-42的免疫原性

目的纯化大肠埃希菌Rosetta gami(DE3)表达的可溶性裂殖子表面蛋白1C末端蛋白(MSP1-42,3D7株),检测其体外抑制恶性疟原虫生长的效果。方法利用大肠埃希菌Rosetta gami(DE3)为宿主菌诱导表达MSP1-42,用带组氨酸标签的镍柱纯化可溶性的MSP1-42。6只新西兰白兔随机分为免疫组和对照组,每组3只。用MSP1-42与弗氏佐剂乳化后,皮下注射,抗原免疫剂量每次为200μg/只,共免疫4次,每次间隔2周。佐剂对照组以PBS代替抗原同法免疫。免疫前及末次免疫2周后取血,用酶联免疫吸附试验和间接荧光抗体试验检测血清中特异性抗体及其与天然抗原的反应,用含10%和20%免疫血清的培养基体外培养恶性疟原虫(海南分离株,Fcc1/HN),检测免疫血清体外抑制恶性疟原虫生长的效果。结果经镍柱纯化后获得纯度为95%以上的MSP1-42蛋白;免疫组个体在第4次免疫后血清特异性抗体的滴度依次为1:640000、1:640000、1:160000,间接荧光抗体试验检测表明MSP1-42免疫兔血清与恶性疟原虫表面蛋白有阳性反应;免疫血清能抑制恶性疟原虫在体外生长,在10%浓度时,3只免疫兔血清的抑制率依次为(51.9±24.2)%、(29.4±8.6)%和(86.7±7.4)%,在20%浓度时,抑制率分别为(93.3±7.5)%、(65.3±10.6)%和(96.4±1.0)%。结论大肠埃希菌Rosettagami(DE3)表达的MSP1-42蛋白免疫血清能识别恶性疟原虫天然抗原,体外培养能抑制恶性疟原虫的生长。

表达恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-1片段的减毒鼠伤寒杆菌的构建

目的 检测恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1基因在减毒鼠伤寒直菌X40 6 4株中的表达。方法 将 7个克隆有恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1基因片段的表达质粒 pQEM用氯化钙法转化到修饰系统正常、限制系统缺陷的鼠伤寒杆菌LB5 0 0 0中 ,再通过专一性噬菌体P2 2 转导入腺苷酸环化酶基因、环腺苷酸受体基因双重突变的减毒鼠伤寒杆菌X40 6 4株中 ,用质粒酶切、Westernblot鉴定构建的重组菌株、测定重组菌株的表达。结果 成功地构建了 7个重组减毒鼠伤寒杆菌X40 6 4(pQEM )株 ,重组pQEM质粒在减毒鼠伤寒杆菌X40 6 4株中获得了表达。结论 X40 6 4(pQEM )

中缅边境恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1,2基因多态性研究

目的 对云南省及边境地区恶性疟原虫的裂殖子表面蛋白（merozoite surface protein，MSP）1，2基因进行分型研究，确定其等位基因的类型和分布特征，结合当地的恶性疟原虫株流行病学信息，为该地区疟疾的防治提供科学依据。 方法 从缅甸拉咱、那威和我国云南省西双版纳勐腊、德宏瑞丽、保山腾冲采集恶性疟患者血样。用巢式PCR（nest-PCR）扩增18S rRNA基因，确定感染疟原虫的种类。对检测为恶性疟原虫以及恶性疟原虫/间日疟原虫混合感染的样本，进行恶性疟原虫MSP-1、MSP-2基因的扩增并作测序、验证与序列分析。 结果 共采集89份恶性疟样本，经18S rRNA基因检测，确定间日疟9例，恶性疟78例和混合感染2例。在检测为恶性疟和混合感染的80份样本中，69例扩增出MSP-1基因片段，77例扩增出MSP-2基因片段。在MSP-1等位基因中，以MAD20型68.75%为主，RO33型23.75%和K1型20.00%次之。来源于勐腊的样本均未检出RO33型和K1型；MSP-2等位基因FC27型和3D7型的感染率均为91.25%，无明显的优势虫株；MSP-1和MSP-2基因多克隆样本所占百分比与多重性感染（multiplicity of infection，MOI）分别为22.50%、1.81和86.25%、3.51。MSP-1 和MSP-2等位基因目的片段多样性与其原虫密度之间存在相关性（Spearman’s r=0.496，P＜0.05；Spearman’s r=0.240，P＜0.05）。MSP-1和MSP-2等位基因测序结果表明，在FC27型基因序列3＇端发现1个新的APK序列，在3D7基因型序列中检测到1个新的PAT重复序列和其它19个新的序列。 结论 云南省及边境地区恶性疟原虫分离株MSP-1等位基因存在MAD20型、K1型和RO33型3种类型，以MAD20型为优势虫株，勐腊样本未发现K1型和RO33型；MSP-2等位基因存在FC27型和3D7型2种类型，其优势均不明显。