恶性疟原虫融合蛋白PfCP-2.9自由巯基的测定

目的 检测由毕氏酵母表达的恶性疟原虫融合蛋白(Plasmodium falciparum chimeric protein)PfCP-2.9的自由巯基。方法 使用反向高压液相层析和Ellman氏反应进行检测。用反向高压液相,检测了3种样本,PfCP-2.9、PfCP-2.9经二硫苏糖醇还原、PfCP-2.9经吲哚乙酸烷基化。结果 两种检测方法均表明PfCP-2.9不含任何自由流基。结论 由毕氏酵母表达的PfCP-2.9中的半胱氨酸残基所含有的硫基均已氧化形成二硫键。

miR-506-3p、sST2和CEA在恶性胸腔积液患者中表达水平及诊断价值分析

目的分析miR-506-3p、可溶性生长刺激表达基因2蛋白(sST2)和癌胚抗原(CEA)在恶性胸腔积液患者中表达水平及其诊断价值。方法选取108例胸腔积液患者作为研究组,根据超声检查及病理检查结果,将32例结核性胸腔积液患者纳入结核性组,41例癌性胸腔积液患者和35例淋巴瘤性胸腔积液患者纳入恶性组。另随机抽取54例本院健康体检者纳入对照组。比较研究组患者及对照组健康体检者的血清sST2、CEA水平;比较恶性组与结核性组患者胸水miR-506-3p、sST2和CEA水平。采用ROC分析各指标对恶性胸腔积液的诊断价值。结果血清sST2和CEA水平,恶性组>结核性组>对照组(P<0.05)。与结核性组比较,恶性组胸水miR-506-3p水平降低(P<0.05),而sST2和CEA水平升高(P<0.05)。ROC结果显示,血清sST2、CEA及胸水miR-506-3p、sST2、CEA对恶性胸腔积液均具有诊断价值,且联合诊断的灵敏度最高。结论在恶性胸腔积液患者中,胸水miR-506-3p低表达,而血清和胸水sST2、CEA高表达;对恶性胸腔积液具有一定诊断价值,且联合诊断的灵敏度最高。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白-2基因诱导的免疫应答研究

[目的 ]探讨编码恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (HRP Ⅱ )C端基因的真核表达重组质粒诱导小鼠的体液和细胞免疫效果。 [方法 ]将起始码和终止码引入HRP ⅡC端基因片段两端 ,经测序鉴定读框 ,将包含起始码和终止码的HRP Ⅱ基因片段克隆入真核表达质粒pcDNA3 1( )中 ,进行酶切鉴定。用重组真核表达质粒pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 经肌肉免疫小鼠 3次 ,每次间隔 3wk。第 3次免疫后 2wk ,取小鼠血清和脾细胞 ,分别用ELISA测定HRP Ⅱ抗体水平和用脾细胞增殖实验测定细胞免疫反应。 [结果 ]序列测定结果表明 ,HRP ⅡC端基因片段被准确地引入起始码和终止码 ;酶切鉴定表明包含起始码和终止码的HRP ⅡC端基因片段成功地克隆入pcDNA3 1( ) ,形成pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 。在pcDNA3 1( ) /HRP Ⅱ 免疫鼠血清中可检测出高水平的HRP Ⅱ抗体 ,用原核表达的HRP Ⅱ蛋白刺激免疫脾细胞 ,可检测出明显的细胞增殖反应。 [结论 ]编码HRP Ⅱ的真核表达重组质粒可诱导小鼠产生明显的体液和细胞免疫反应。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2融合HBS基因重组质粒的免疫原性研究

目的 构建恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)裂殖子表面蛋白 2 (MSP2 )融合HBsAg基因片断真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ,观察该DNA疫苗的免疫特性。方法 (1)以恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)基因组为模板 ,扩增出pfMSP2 DNA片断 ,将该片段克隆入质粒pVXORF1-HBS中HBS的上游并与之紧密相连 ,构建质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ;构建真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 以作为对照。 (2 )用上述构建的质粒及空质粒 pVXORF1免疫KM小鼠 ,以ELISA检测血清IgG抗体。 结果 (1)筛选出的重组子为编码FCC1/HNMSP2 基因片断的重组质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS及 pVXORF1-PfMSP2 。 (2 )裸DNA尾根多点注射KM小鼠 ,显示 pVXORF1-PfMSP2 -HBS组小鼠较pVXORF1-PfMSP2 组小鼠产生抗PfMSP2 蛋白的抗体效价明显增高 ,二者比较 ,差异有非常显著意义 (P <0 0 1)。结论 PfMSP2 融合HBsAg基因片段激发机体产生抗PfMSP2 抗体的能力显著增强 ,提示PfMSP2

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 为了探讨恶性疟原虫FCC - 1/HN株裂殖子表面蛋白 - 2 (MSP - 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导的免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。方法 将重组真核表达质粒pBK/MSP - 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8w后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN -γ和IL - 2的产生。结果 与对照组相比 ,疫苗组CD+ 4CD8+ T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN -γ有一个高浓度的分泌。结论 恶性疟原虫FCC - 1/HNMSP -

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白-2 DNA疫苗诱导小鼠T淋巴细胞的增殖

目的 探讨疟原虫FCC 1/HN株裂殖子表面蛋白 2 (MSP 2 )DNA疫苗在小鼠体内诱导免疫应答的特性及抗感染的保护性免疫机制。 方法 将重组真核表达质粒PBK/MSP 2经骨骼肌注射BALB/c小鼠 ,小鼠经DNA疫苗免疫 8周后 ,用流式细胞仪分析脾脏T淋巴细胞的分化 ,并体外培养脾脏细胞 ,用夹心ELISA法测定IFN γ和IL 2的产生。 结果 与对照组相比 ,疫苗组CD4+CD8+T淋巴细胞有显著性的增高 ,体外培养的脾脏细胞IFN γ有高浓度的分泌。 结论 恶性疟原虫FCC 1/HNMSP

高良姜素调节MCP-1/CCR2信号轴对肺癌细胞恶性生物学行为的影响

目的研究高良姜素通过调节单核细胞趋化蛋白-1(MCP-1)/趋化因子受体-2(CCR2)信号通路对肺癌细胞的恶性生物学行为产生的影响。方法将人肺癌细胞系A549分为ctrl组、低浓度高良姜素组(5μmol/L)、高浓度高良姜素组(100μmol/L)、吉非替尼组(10μmol/L)、高浓度高良姜素+MCP-1组(100μmol/L高良姜素+75 ng/mL MCP-1)。CCK-8试剂盒检测细胞活性;流式细胞术检测细胞凋亡;细胞划痕实验检测细胞迁移;transwell检测细胞侵袭能力;western blot检测MCP-1、CCR2、凋亡蛋白半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3)、细胞增殖核抗原(Ki67)、基质金属蛋白酶2(MMP-2)蛋白表达。结果与ctrl组比较,低浓度高良姜素组、高浓度高良姜素组、吉非替尼组肺癌细胞A549的细胞存活率、细胞迁移愈合率、细胞侵袭数、MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表达降低,而细胞凋亡率、Caspase-3含量升高(P<0.05);与高浓度高良姜素组比较,高浓度高良姜素+MCP-1组A549细胞存活率、细胞迁移愈合率、细胞侵袭数、MCP-1、CCR2、Ki67、MMP-2蛋白表达升高,而细胞凋亡率、Caspase-3含量降低(P<0.05)。结论高良姜素可能通过抑制MCP-1/CCR2信号通路进而抑制肺癌A549细胞恶性生物学行为,促进其凋亡。

融合蛋白接头linker在细粒棘球蚴重组疫苗EgG1Y162-2(4)中的选择设计

目的:分析蛋白EgG1Y162-2通过不同长度接头序列连接后形成的肽段四聚体蛋白EgG1Y162-2(4)的氨基酸序列特征,明确其理化性质及三级结构,预测并对比经不同长度柔性接头连接后其优势抗原表位变化,为增强重组疫苗免疫原性选取最理想的linker序列。方法:利用生物信息学方法选择GSGGSG、GGGGSGGG和GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列进行连接设计EgG1Y162-2(4)重组蛋白疫苗。在线软件ProtParam分析其理化性质;SOPMA在线数据库对设计有不同linker序列的重组蛋白二级结构进行预测分析;I-TASSER在线软件预测所设计重组疫苗的三级结构,并使用SYFPEITHI、IEDB等软件对其T/B细胞抗原表位进行预测。结果:经预测通过GSGGSG、GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG 3种linker序列连接的EgG1Y162-2(4)均是稳定蛋白且具有亲水性并得到其二级结构特点。设计的重组疫苗EgG1Y162-2(4)通过生物信息学方法预测得知通过GSGGSG连接的EgG1Y162-2(4)中α螺旋占8.50%,β-转角占16.67%,无规则卷曲约占40.48%,延伸链约占34.35%,该蛋白有8个T/B联合表位,前后串联的EgG1Y162-2蛋白不仅能够正常折叠,且与EgG1Y162-2蛋白相比T/B抗原表位未发生偏移。三级结构显示通过linker序列GSGGSG串联的4个蛋白EgG1Y162-2均能正常表达,而通过GGGGSGGG、GSGGSGGGSGGSGGG串联的蛋白EgG1Y162-2(4)表位发生了一定程度右移。结论:利用GSGGSG 6个氨基酸连接EgG1Y162-2蛋白构成的EgG1Y162-2(4)的T/B联合表位高度重合,表位未发生迁移说明蛋白EgG1Y162-2(4)通过这种方式连接后几乎未对EgG1Y162-2蛋白优势表位造成影响,并通过重复蛋白表位数增强疫苗免疫应答效果,制备有效的棘球蚴病表位疫苗。

云南和海南两省不同地区恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2基因型的研究

目的 分析云南和海南两省恶性疟原虫的基因型及其分布。方法采用套式PCR法特异扩增MSP2基因中间多态区 ,对恶性疟原虫群体进行基因分型。结果 检测云南省 31例和海南省 2 9例恶性疟原虫患者血清 ,其中分别有 14和 18种不同的MSP2等位基因型 ,其等位基因株存在高度的多态性 ,基因片段大小及分布频率具有地区差异。海南省不同等位基因型虫株混合感染及多重感染现象比云南省严重。

套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究

目的 了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(pfMSP1)和表面蛋白 2 (pfMSP2 )等位基因型的分型特征。方法 采用套式PCR法分别扩增pfMSP1基因第 2区与第 3区部分片段和pfMSP2基因的中间可变区 (第 3区 ) ,对海南省恶性疟原虫分离株进行基因分型。结果 5 5份血样中有 5 2份恶性疟疾患者扩增出pfMSP1基因片段 ,以MAD2 0型为主导型 (84 6 % ) ,K1型为次要型 ,未检出RO33型 ,两种不同等位基因混合感染率为 15 4 %。同时 ,5 5份血样中有 5 3份恶性疟疾患者扩增出pfMSP2基因片段 ,以 3D7型为主导型 (83% ) ,FC2 7型为次要型 ,混合感染率为 17%。结论 海南省恶性疟原虫的MSP1存在MAD2 0型和K1型两种等位基因型 ,以MAD2 0型为优势虫株 ;其MSP2存在 3D7型和FC2 7型两种等位基因型 ,以 3D7等位基因家族为主。

恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶融合蛋白复性及纯化的研究

目的建立恶性疟原虫谷氨酸脱氢酶(GDH)融合蛋白质的复性和纯化方法。方法将含有恶性疟原虫GDH全长基因的融合蛋白表达质粒GDH/ pGEX-4T-1转化到宿主菌BL21,该GDH/GST融合蛋白在IPTG的诱导下获得高水平的表达,经SDS-PAGE分析表达产物主要为不溶性的包涵体。经超声酶解法、离心、变性剂/去污剂洗涤后获得包涵体。包涵体经8 mol/L尿素变性后分别采用分子筛柱层析、透析和稀释3种方法复性,并通过浊度分析、非还原SDS-PAGE等方法比较、优化复性方法和条件。复性后的GDH/GST融合蛋白经过不同柱层析方法进行纯化。结果经SDS-PAGE分析表明,GDH/GST融合蛋白表达量可占到菌体总蛋白的25%左右;浊度分析表明:稀释复性法优于其它两种方法,同时20 mmol/L Tris-HCl、1 mmol/L EDTA、pH8.5及GSSG/GSH=1∶10为该融合蛋白稀释复性的最佳条件,其复性回收率可达90%以上。复性产物采用二步阴离子交换层析可获得较好的纯化效果。结论通过稀释复性,二步阴离子交换层析可获得高纯度、具有天然空间构象的重组GDH/GST融合蛋白。

恶性疟原虫富组氨酸蛋白2重组蛋白与真核表达质粒免疫特性的比较

目的 探讨以恶性疟原虫富组氨酸蛋白 2 (PfHRP2 )为基础的不同形式的侯选疫苗诱导小鼠免疫应答的特性 ,为包含HRP2的恶性疟红内期疫苗的研制提供实验依据。方法 用重组蛋白TP HRP2及真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2免疫BALB c小鼠 ,对抗体应答的动力学及特异性进行分析 ,取脾细胞进行体外增殖实验 ,用免疫血清进行P f.体外生长抑制实验。结果 重组蛋白TP HRP2加福氏佐剂诱导BALB c小鼠产生了高水平的抗体 ,其抗体产生快、持续时间久 ,并具较高的特异性 ,细胞应答被同期激活 ,免疫血清可明显抑制红细胞内发育期疟原虫。重组真核表达质粒pcDNA3 1(- ) HRP2诱导BALB c小鼠产生了较高水平和具有一定特异性的抗体 ,其抗体的产生需要多次免疫和较长时间 ,初始化的脾细胞对抗原再刺激的回忆应答显著 ,但免疫血清对疟原虫的体外生长没有抑制作用。结论 HRP2重组蛋白与真核表达质粒在小鼠具有较为不同的免疫特性 。

不同疟区恶性疟原虫地理株谷氨酸富有蛋白基因R2区序列分析及分型

[目的 ]测定云南与海南两省不同疟区恶性疟原虫分离株谷氨酸富有蛋白 (GLURP)基因的部分序列及了解其分型。[方法 ]采用套式PCR方法特异性扩增GLURP基因R2区片段 ,并将该基因片段克隆于T载体 ,用双脱氧末端终止法测定不同长度的阳性克隆核苷酸序列 ,并应用DNAStar软件对云南与海南两省分离株GLURP基因及蛋白序列进行比较和分析。[结果 ]首次发现云南与海南两省恶性疟原虫至少存有 7个大小不同的GLURP等位基因型虫株 ,其基因片段变化范围为 6 0 0～ 15 0 0bp。不同分离株的GLURP基因R2区具高度保守性 ,其由编码 19～ 2 0个氨基酸的碱基的基本重复单位构成 ,该基因具有长度的多态性 ,表现在碱基基本重复单位的数目不同。序列分析结果表明 ,我国不同分离株之间或同一地区不同株之间GLURP基因及氨基酸序列具有高度的同源性 ,无明显的地理差异。 [结论 ]不同分离株GLURP基因结构的高度保守性及碱基重复片段数目的多态性 ,对研究疫苗候选抗原和建立疟原虫基因分型方法具有一定理论价值。

海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 2基因的分型研究及序列分析(英文)

目的 对恶性疟原虫海南株的 MSP2基因进行分型和多态性分析。 方法 采用套式 PCR法特异扩增 MSP2基因的中间可变区 (第 3区 ) ,对 4 1株恶性疟原虫分离株进行基因分型 ,并对部分目的基因片段进行直接测序。 结果 4 1份血样中有 39份共扩增得到 5 5个目的基因片段 ,以 3D7型为主 (2 8份血样 ,36个基因片段 ) ,两种等位基因家族混合感染的情况极少见。序列分析结果表明 ,海南省恶性疟原虫虫株的 MSP2中间重复序列区变异程度大。 结论 海南省恶性疟原虫的 MSP2以 3D7等位基因家族为主 。

恶性疟原虫疫苗研究VIPfCMR基因与人白细胞介素-2基因的连接与克隆

用限制性内切酶ＥｃｏＲＩ和ＳａｌＩ将恶性疟原虫复合抗原基因ＰｆＣＭＲ从质粒ｐＷＲ４５０－１／ＰｆＣＭＲ中切下，插入质粒ｐＢＶ２２０／ＩＬ－２中人白细胞介素－２（ＩＬ－２）基因的ＥｃｏＲＩ位点。重组质粒转化大肠杆菌ＤＨ５ａ，通过ＰＣＲ扩增和酶切鉴定，筛选出正向插入的重组载体ｐＢＶ２２０／ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２。为表达ＰｆＣＭＲ－ＩＬ－２融合蛋白打下基础。

赤道几内亚比奥科岛恶性疟原虫MSP-1和MSP-2基因多态性研究

目的研究赤道几内亚比奥科岛(Bioko Island)恶性疟原虫分离株裂殖子表面蛋白1(PfMSP-1)基因和裂殖子表面蛋白2(PfMSP-2)基因分型。方法从比奥科岛采集疟疾患者血样181份,用显微镜法和荧光定量PCR鉴定虫种。采用巢式PCR分别扩增PfMSP-1和PfMSP-2中具有型特异性的片段,进行等位基因分型。结果 PfMSP-1基因分型:181份恶性疟患者血样中有178份扩增出PfMSP-1基因片段(98.34%),其中K1、MAD20和RO33基因型片段分别为171份(94.48%)、175份(96.69%)和126份(69.61%)。混合感染率为97.24%;PfMSP-2基因分型:181份血样中有173份PfMSP-2基因片段(95.58%),其中48份(26.52%)单独扩增到3D7型基因片段,4份(2.21%)单独扩增到FC27型基因片段,混合感染率为66.85%。结论赤道几内亚比奥科岛PfMSP-1和PfMSP-2等位基因型分布范围极广。混合感染是比奥科岛疟疾的主要类型。

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白2真核表达重组质粒的构建(英文)

目的 构建恶性疟原虫海南分离株 ( FCC1/ HN)裂殖子表面蛋白 2 ( MSP2 )融合 HBs Ag基因片断真核表达质粒 p VX-ORF1- Pf MSP2 - HBS及重组真核表达质粒 p VXORF1- Pf MSP2 ,为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定基础。 方法 ( 1)采用 PCR技术对恶性疟原虫 FCC1/ HN株 MSP2 原核表达质粒 PET2 8α- MSP2 的 MSP2 基因进行扩增 ,扩增产物经纯化后用 Bam H 酶切 ;质粒 p VXORF1- Pv MSP1 .1 9- HBS用相同的酶酶切 ,经纯化后用 T4DNA连接酶将其与酶切后纯化的 MSP2 基因连接 ;( 2 )分别用Bam H +Xho 双酶切 PET2 8α- MSP2 质粒 DNA和 p VXORF1质粒 DNA,纯化后将目的基因片断用 T4DNA连接酶连接 ;将 ( 1)、( 2 )连接产物分别转化大肠杆菌 DH5α。于氨苄青霉素阳性 L B培养平板上筛选阳性克隆 ,酶切电泳鉴定。 结果 筛选出的重组子为编码 FCC1/ HN MSP2 基因片断的重组质粒 p VXORF1- Pf MSP2 - HBS及 p VXORF1- Pf MSP2 。 结论 编码 FCC1/ HN MSP2 基因片断真核表达质粒 p VXORF1- Pf MSP2 - HBS和 p VXORF1- Pf MSP2 的构建为疟疾核酸疫苗及蛋白疫苗的研制奠定了基础。

恶性疟原虫子孢子表面蛋白2基因的克隆与序列分析

目的克隆恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)子孢子表面蛋白2(PfSSP2)基因,并进行序列分析。方法根据PfSSP2基因已知序列设计合成一对引物,用PCR技术从FCC1/HN株基因组DNA中扩增出PfSSP2基因,并克隆入pMD-18T测序载体。用双脱氧链末端终止法测序,用DNAstar软件辅助分析基因结构及进行同源性比较。结果PCR扩增得到特异的FCC1/HN株PfSSP2基因序列,酶切及PCR鉴定获得了正确的pT-PfSSP2重组质粒。测序表明,所克隆的PfSSP2基因大小为1680bp,编码559个氨基酸残基。序列分析表明,我国恶性疟原虫FCC1/HN株与国外的3D7、DD2、FCR3、HB3A、K1、Thai814、Thai838、Thai842、Thai947及7G8株PfSSP2的氨基酸序列在33个位点存在氨基酸替代,1处氨基酸序列增加;各株间PfSSP2的氨基酸序列同源性都在95.7%以上。结论克隆了恶性疟原虫FCC1/HN株PfSSP2基因。序列测定及同源性分析表明,恶性疟原虫不同分离株间有高度的同源性。

恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ辅基铁-硫蛋白基因克隆及序列分析

目的 构建恶性疟原虫海南株线粒体复合体Ⅱ琥珀酸 泛醌还原酶辅基铁 硫蛋白 (iron sulfurprotein ,Ip)基因原核表达质粒pET2 8α Ip ,测定Ip基因序列 ,为研究铁 硫蛋白基因功能奠定基础。方法 采用PCR技术从恶性疟原虫海南株基因组DNA中扩增出Ip基因 ,扩增产物经纯化后 ,用BamHI +XhoI双酶切 ,定向克隆入pET2 8α质粒 ,转化大肠杆菌DH5α ,再用BamHI+XhoI酶切及PCR扩增对重组子进行鉴定。用Sanger双脱氧链终止法进行DNA序列测定 ,并进行同源性比较。结果 筛选出编码海南株Ip基因的原核表达质粒pET2 8α Ip ,海南株Ip基因序列与K1、3D7株高度同源。结论 pET2 8α Ip重组质粒的构建 ,为进一步研究铁

TAT融合蛋白转导红内期恶性疟原虫

目的:探讨TAT-p53融合蛋白转导进入红内期恶性疟原虫的特性.方法:将纯化的TAT-p53融合蛋白和p53蛋白分别与培养疟原虫共孵育30min后,制备血涂片,利用间接免疫荧光方法检测融合蛋白的转导.同时计算融合蛋白与疟原虫共孵育12h前后的感染率变化,观察蛋白转导对疟原虫生长的影响.结果:TAT-p53融合蛋白可以突破红内期疟原虫各层细胞膜,进入虫体细胞内,并可根据荧光观察到融合蛋白主要分布在疟原虫滋养体和晚期裂殖体,而p53蛋白不能进入疟原虫内.融合蛋白与疟原虫共孵育12h后其感染率与对照组之间无显著差异(P>0.05),说明蛋白转导对疟原虫的生长没有影响.结论:TAT融合蛋白可以转导进入疟原虫内,这将为疟原虫相关基因功能的研究提供一种新方法.