云南和海南两省不同地区恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2基因型的研究

目的 分析云南和海南两省恶性疟原虫的基因型及其分布。方法采用套式PCR法特异扩增MSP2基因中间多态区 ,对恶性疟原虫群体进行基因分型。结果 检测云南省 31例和海南省 2 9例恶性疟原虫患者血清 ,其中分别有 14和 18种不同的MSP2等位基因型 ,其等位基因株存在高度的多态性 ,基因片段大小及分布频率具有地区差异。海南省不同等位基因型虫株混合感染及多重感染现象比云南省严重。

恶性疟原虫海南分离株裂殖子表面蛋白1基因的分型研究

目的 了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(PfMSP1)等位基因型的分型特征。方法 采用套式PCR方法 ,用几对PfMSP1特异引物扩增疟原虫虫株PfMSP1基因第 2区与第 3区部分片段 ,并对等位基因型代表株的基因片段进行序列分析。结果 39份血样中有 36份恶性疟患者共扩增出 44个PfMSP1基因片段 ,以MAD2 0型为主导型 (占 75 % ) ,K1型为次要型 ,未检出RO33型。两种不同等位基因型的混合感染率为 19 4%。序列分析表明 ,海南省恶性疟原虫虫株的MAD2 0型和K1型第 2区序列与MAD2 0和K1原型序列具有高度同源性。结论 海南省恶性疟原虫虫株存在MAD2 0型和K1型两种等位基因型 ,以MAD2 0型为优势虫株。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端基因导入烟草叶绿体的研究

目的将恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1C末端msp1-42基因(3D7株)导入烟草叶绿体基因组中并进行同质化筛选,为利用叶绿体表达系统生产MSP1-42蛋白提供基础材料。方法利用烟草偏爱密码子设计克隆恶性疟原虫(3D7株)msp1-42基因的引物,从含msp1-42基因的pBluntmsp质粒中扩增出msp1-42,构建烟草叶绿体表达载体LRrrmsp。通过基因枪转化法转化烟草叶片,在500mg/L壮观霉素的选择压力下筛选抗性植株,采用PCR鉴定抗性植株的msp1-42基因及aadA基因,对鉴定阳性植株进行同质化筛选(叶片切碎、在含500mg/L壮观霉素分化培养基上分化出新的植株)3轮以上,并采用多重PCR分析其同质化情况。结果构建了恶性疟原虫msp1-42基因的叶绿体表达载体LRrrmsp。基因枪转化后获得6个转化子,转化频率为0.6个/枪。转化3～5d后,小块叶片开始增大增厚,并逐渐由绿色变为黄绿色,7～10d后黄化或白化,再经约30d的筛选培养,叶片上出现绿色小芽。PCR检测抗性植株的msp1-42及aadA基因,分别扩增出约900bp与500bp的条带,与预期相符。多重PCR分析从经过3轮同质化筛选植株的叶绿体基因中扩增出与未转基因烟草对照大小一致的弱条带,表明经过3轮同质化筛选的转基因植株仍含有未插入外源基因的叶绿体基因组。结论获得含恶性疟原虫msp1-42的烟草叶绿体表达载体,并将恶性疟原虫msp1-42基因导入烟草叶绿体基因组中,获得尚未完全同质化的转基因烟草。

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因在耻垢分枝杆菌M.Smegmatis mc^2 155中的表达

目的 探讨恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在耻垢分枝杆菌M Smegmatismc2 15 5中的表达。方法 采用电穿孔转化法将重组大肠杆菌 -分枝杆菌穿梭表达质粒 pBCG/CSP导入耻垢分枝杆菌M Smegmatismc2 15 5 ,重组分枝杆菌培养4 8- 72h后于 4 5℃诱导表达 3 0min ,表达产物进行SDS -PAGE及免疫印迹分析。结果 SDS -PAGE及免疫印迹分析结果均显示在约 4 2kDa的位置上可见明显的蛋白条带。结论 恶性疟原虫环子孢子蛋白可在分枝杆菌中表达。

PCR扩增环子孢子蛋白基因3' 端片段用于检测恶性疟原虫的初步研究

目的 :建立 PCR检测恶性疟原虫的新方法。方法 :作者采用自行设计并合成的一对恶性疟原虫特异引物 ,经 PCR扩增环子孢子蛋白 ( CSP)基因 3 端保守区序列 2 4 5bp片段 ,观察了它的特异性、敏感性和稳定性。结果 :1从 4株培养的恶性疟原虫和 2例恶性疟患者血样中均扩增出约 2 4 5bp的 DNA目的片段 ,用业已鉴定的 CSP基因序列作模板再行扩增证实其为恶性疟原虫CSP基因片段 ;2对间日疟原虫、利什曼原虫、弓形虫和健康人血样进行 PCR反应 ,均未见扩增条带 ;3本检测系统可检出恶性疟原虫感染血样中 0 .18个原虫所含的 DNA模板 ;4采用不同方法制备模板及不同反应方式均能获得满意结果 ;结论 :PCR扩增恶性疟原虫 CSP基因 3 端片段用于恶性疟原虫检测具有灵敏、高度特异且稳定性好等优点。

恶性疟原虫FCC-1/HN株环子孢子蛋白基因分枝杆菌——大肠杆菌穿梭表达重组质粒的构建及序列测定

本文对恶性疟原虫环子孢子蛋白 ( circum sporozoite protein,CSP)基因片段进行克隆和序列测定。根据恶性疟原虫 837株基因编码序列设计合成一对引物 ,采用 PCR技术从恶性疟原虫 FCC- 1/HN株基因组DNA中特异扩增 CSP基因片段的 区、中央重复区、重复区后可变区和 区 ;经纯化的扩增产物用 Bam H 和 Kpn 双酶切后 ,定向克隆入大肠杆菌——分枝杆菌穿梭表达质粒 ,转化感受态大肠杆菌 DH 5α,重组克隆经抗性筛选和快速凝胶电泳鉴定 ,再经 PCR和酶切鉴定 ,并对重组子进行序列测定。结果表明从恶性疟原虫 FCC- 1/HN株基因组 DNA中可特异扩增出约 1171bp的基因片段 ,阳性重组质粒经双酶切和 PCR鉴定与预期的结果一致 ,序列测定表明所克隆的基因和编码环子孢子抗原的基因片段相符。

恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白II部分基因的克隆和序列分析

目的：测定恶性疟原虫云南株富含组氨酸蛋白 Ｉ Ｉ部分序列，了解该虫株与其它虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因序列的差异。方法：采用 Ｐ Ｃ Ｒ 方法特异性扩增 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因片段，并将该基因片段克隆于 Ｍ １３ 载体，用双脱氧链末端终止法进行测序，应用 Ｐ Ｃ Ｇ Ｅ Ｎ Ｅ软件对不同虫株恶性疟原虫 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ进行基因序列分析。结果：我国云南株恶性疟原虫与 ７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因有不同程度的差异，３ 虫株间 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ氨基酸序列同源性为７０．３％ ，核苷酸序列同源性为 ６８．６％ 。结论：云南株与７ Ｇ８ 及 Ｄ１０ 虫株 Ｈ Ｒ Ｐ Ｉ Ｉ基因存在差异。

不同疟区恶性疟原虫地理株谷氨酸富有蛋白基因R2区序列分析及分型

[目的 ]测定云南与海南两省不同疟区恶性疟原虫分离株谷氨酸富有蛋白 (GLURP)基因的部分序列及了解其分型。[方法 ]采用套式PCR方法特异性扩增GLURP基因R2区片段 ,并将该基因片段克隆于T载体 ,用双脱氧末端终止法测定不同长度的阳性克隆核苷酸序列 ,并应用DNAStar软件对云南与海南两省分离株GLURP基因及蛋白序列进行比较和分析。[结果 ]首次发现云南与海南两省恶性疟原虫至少存有 7个大小不同的GLURP等位基因型虫株 ,其基因片段变化范围为 6 0 0～ 15 0 0bp。不同分离株的GLURP基因R2区具高度保守性 ,其由编码 19～ 2 0个氨基酸的碱基的基本重复单位构成 ,该基因具有长度的多态性 ,表现在碱基基本重复单位的数目不同。序列分析结果表明 ,我国不同分离株之间或同一地区不同株之间GLURP基因及氨基酸序列具有高度的同源性 ,无明显的地理差异。 [结论 ]不同分离株GLURP基因结构的高度保守性及碱基重复片段数目的多态性 ,对研究疫苗候选抗原和建立疟原虫基因分型方法具有一定理论价值。

插入四环素操纵子对恶性疟原虫血型糖蛋白结合蛋白130基因启动子活性的影响(英文)

目的 构建四环素操纵子 (TetO)修饰的恶性疟原虫血型糖蛋白结合蛋白 13 0基因 (GBP13 0 )启动子 ,并探讨TetO插入后对启动子活性影响的位置效应。 方法 将 7个拷贝的TetO ( 7cot)序列分别克隆入GBP13 0启动子转录起始点附近的 4个位点 ,上、下游各两个 ,产生 4个衍生质粒pG/ 7T( -5 ) ,pG/ 7T( -2 ) ,pG/ 7T( +2 )和pG/ 7T( +5 )。瞬时转染后通过CATELISA检测和分析pGBPCATΔ2和 4个衍生质粒中CAT报告基因的表达水平。 结果 限制性酶切、PCR扩增和DNA测序证明质粒构建成功。转染和CAT检测表明 ,7cot插入到GBP13 0启动子的 4个位点中均可提高启动子的活性 ,并且定位于启动子下游比定位于上游具有更高的活性 ,其中于 +5位点启动子活性最高。 结论 在疟原虫四环素诱导性转基因表达系统中质粒pG/ 7T( +5 )

海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 2基因的分型研究及序列分析(英文)

目的 对恶性疟原虫海南株的 MSP2基因进行分型和多态性分析。 方法 采用套式 PCR法特异扩增 MSP2基因的中间可变区 (第 3区 ) ,对 4 1株恶性疟原虫分离株进行基因分型 ,并对部分目的基因片段进行直接测序。 结果 4 1份血样中有 39份共扩增得到 5 5个目的基因片段 ,以 3D7型为主 (2 8份血样 ,36个基因片段 ) ,两种等位基因家族混合感染的情况极少见。序列分析结果表明 ,海南省恶性疟原虫虫株的 MSP2中间重复序列区变异程度大。 结论 海南省恶性疟原虫的 MSP2以 3D7等位基因家族为主 。

恶性疟原虫环子孢子蛋白基因在大肠杆菌中的表达

用ＰＣＲ方法特异性扩增恶性疟原虫云南株（ＰＦＤ－３／ＹＮ）环子孢子蛋白基因片段，经基因序列测定后克隆于ｐＷＲ４５０－１融合蛋白表达载体，并转化大肠杆菌ＴＧ１、ＪＭ１０３及ＪＭ１０９。在不同菌体浓度及不同剂量ＩＰＴＧ诱导下检测ＣＳＰ融合蛋白的表达，结果显示仅ｐＷＲ－ＣＳＰ／ＴＧ１工程菌在菌体浓度ＯＤ５９０值达０．７～０．８时，加入终浓度１ｍｍｏｌ／ＬＩＰＴＧ进行诱导，可表达一８８ｋＤａ的融合蛋白。

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2融合HBS基因重组质粒的免疫原性研究

目的 构建恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)裂殖子表面蛋白 2 (MSP2 )融合HBsAg基因片断真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ,观察该DNA疫苗的免疫特性。方法 (1)以恶性疟原虫海南分离株 (FCC1/HN)基因组为模板 ,扩增出pfMSP2 DNA片断 ,将该片段克隆入质粒pVXORF1-HBS中HBS的上游并与之紧密相连 ,构建质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS ;构建真核重组表达质粒 pVXORF1-PfMSP2 以作为对照。 (2 )用上述构建的质粒及空质粒 pVXORF1免疫KM小鼠 ,以ELISA检测血清IgG抗体。 结果 (1)筛选出的重组子为编码FCC1/HNMSP2 基因片断的重组质粒 pVXORF1-PfMSP2 -HBS及 pVXORF1-PfMSP2 。 (2 )裸DNA尾根多点注射KM小鼠 ,显示 pVXORF1-PfMSP2 -HBS组小鼠较pVXORF1-PfMSP2 组小鼠产生抗PfMSP2 蛋白的抗体效价明显增高 ,二者比较 ,差异有非常显著意义 (P <0 0 1)。结论 PfMSP2 融合HBsAg基因片段激发机体产生抗PfMSP2 抗体的能力显著增强 ,提示PfMSP2

恶性疟原虫裂殖子表面蛋白2基因克隆及其在大肠杆菌中的表达

目的：克隆恶性疟原虫裂殖子表面蛋白２全基因，并在大肠杆菌中进行表达。方法：采用ＰＣＲ扩增恶性疟原虫ＦＣＣ－１／ＨＮ株ＭＳＰ２基因，克隆插入ｐＵＣ１９，并重组人表达质粒载体中，转化大肠杆菌，诱导重组质粒ｐＢＫ－ＣＭＶ／ｍｓｐ２表达ＭＳＰ２蛋白抗原，对表达产物进行ＳＤＳ－ＰＡＧＥ，ｄｏｔ－ＥＬＩＳＡ和Ｗｅｗｔｅｒｎ ｂｌｏｔ鉴定。结果：ＰＣＲ扩增出８２４ｂｐＤＮＡ片段。

恶性疟原虫热休克蛋白86(HSP86)基因置换型和插入型打靶载体的构建

目的 对恶性疟原虫热休克蛋白基因进行体外扩增 ,构建 HSP86基因打靶载体 ,利用基因敲除技术进行恶性疟原虫热休克蛋白基因功能的研究。方法 恶性疟原虫体外培养 ,基因组 DNA提取 ,目的基因扩增 ,载体与目的片段连接、阳性克隆筛选及酶切鉴定。结果 经酶切鉴定 PCR产物及插入片段大小与预期值相符 ,进一步测序鉴定证实 PCR产物及插入片段为所需目的基因片段。插入片段经酶切鉴定证实插入方向正确。结论 成功构建了用于恶性疟原虫基因打靶的插入型及置换型载体 (p HCl- HSP86 int和 p HCl- HSP86 rep) 。

用四环素调控启动子调控表达恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1全合成基因

[目的 ]用含四环素调控启动子 (PLtetO 1 启动子 )的pZE11质粒表达恶性疟原虫MSP1全合成基因及其C末端 42kDa片段。 [方法 ]将MSP1全合成基因和MSP1C末端 42kDa片段基因分别克隆入受四环素诱导调控的质粒pZE11上 ,转化大肠杆菌DH5αZ1,质粒经酶切、SDS PAGE电泳和Westernblotting反应鉴定重组质粒的构建和重组质粒在DH5αZ1中的表达。 [结果 ]成功地构建了重组pZE11 MSP1质粒和pZE11 MSP1 42质粒 ,SDS PAGE电泳和免疫印迹 (Westernblotting)反应证明两个重组质粒在DH5αZ1中表达了 190和 42kDa蛋白。 [结论 ]含PLtetO 1 启动子的新型表达载体成功地表达了恶性疟原虫MSP1蛋白 ,降低表达产物对宿主细胞的毒性 ,并可为构建受四环素诱导的疟疾———伤寒口服疫苗株提供依据。

恶性疟原虫ApiAP2蛋白与var基因内含子序列相互作用的体内鉴定

目的鉴定恶性疟原虫ApiAP2蛋白家族成员PF3D7_1107800与var基因内含子保守序列(iNPE)存在体内相互结合作用。方法提取恶性疟原虫标准株3D7基因组DNA,PCR扩增PF3D7_1107800基因5′端片段。扩增产物经双酶切后连接入原核表达载体pGex-4T-1,重组质粒转化至大肠埃希菌(E.coli)BL21(DE3),异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达。十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)和蛋白质印迹(Western blotting)分析重组蛋白表达情况,谷胱甘肽亲和层析纯化重组蛋白。20只BALB/c小鼠分为重组蛋白免疫组和PBS对照组,每组10只,免疫组小鼠每鼠背部皮下注射纯化的重组蛋白100μl(约含蛋白20μg),对照组小鼠注射等量PBS,共免疫3次,每次间隔2周,末次免疫后2周处死小鼠,收集血清。重组纯化蛋白G(Protein G)纯化2组小鼠血清,Western blotting鉴定免疫血清抗体情况。染色质免疫沉淀(ChIP)获得恶性疟原虫DNA,qPCR检测PF3D7_1107800蛋白抗体组在C类var基因的内含子区域的富集情况。结果 PCR扩增PF3D7_1107800基因5′端片段结果显示,在约345 bp处有一特异性条带,与理论值相符。重组表达载体pGEX-4T-1-PF3D7_1107800N经测序表明构建成功。重组蛋白经诱导表达和纯化后,SDS-PAGE和Western blotting结果显示,所获的重组蛋白为目的蛋白,其相对分子质量(Mr)约为37 000,与预测值一致。重组蛋白免疫小鼠后,获得抗体血清,Western blotting分析结果显示,血清中抗体可与重组蛋白特异结合,在约Mr200 000处有一目的条带,与预测值一致。ChIP实验产物经qPCR分析显示,在var基因内含子区域的相对富集程度为内参seryl-tRNA合成酶基因区域的2倍以上。结论恶性疟原虫ApiAP2家族成员PF3D7_1107800可在体内与C类var基因内含子区域结合。

海南恶性疟原虫分离株Pfcrt和Pfmdr1基因点突变的研究

目的分析海南省恶性疟原虫分离株氯喹抗性转运蛋白编码基因(Pfcrt)及其P-糖蛋白同系物1(Pgh1)编码基因(Pfmdr1)的点突变特征,为探讨抗性分子标记用于氯喹抗性监测提供参考。方法采用巢式PCR(nested-PCR)和限制性酶切片段长度多态性(RFLP)方法,检测Pfcrt基因编码第76位氨基酸的密码子和Pfmdr1基因编码第86、1246位氨基酸的密码子发生点突变情况。按世界卫生组织(WHO)推荐的体外微量法测定恶性疟原虫对氯喹的敏感性。结果检测的36份血样中,28份成功扩增Pfcrt基因,导致第76位氨基酸由赖氨酸(K)变为苏氨酸(T)的突变型占64.3%,混合型占14.3%,野生型占21.4%;29份成功扩增Pfmdr1基因,导致第86位氨基酸由天冬酰胺(N)变为酪氨酸(Y)的突变型占3.4%,混合型占6.9%,野生型占89.7%。未发现编码第1246位氨基酸的密码子发生点突变。体外氯喹敏感试验结果显示,72.2%(26/36)分离株存在抗性。治疗前恶性疟原虫Pfcrt76T突变发生率在体外微量测定法显示的氯喹抗性与敏感株中的差异有统计学意义(P<0.05),而Pfmdr1点突变发生率在氯喹抗性与敏感株中的差异无统计学意义(P>0.05)。结论恶性疟原虫Pfcrt基因76T可以作为监测氯喹抗性的一个分子标记。

云南省不同地理株恶性疟原虫的MSP-2基因多态性研究

目的 研究云南省不同地理株恶性疟原虫的裂殖子表面抗原蛋白基因 2 (MSP -2 )的多态性 ,探索其多态性的地域特征 ,为鉴定不同地理株恶性疟原虫提供重要的科学依据。 方法 使用随机扩增多态DNA -多聚酶链反应(RAPD -PCR)为主的分子生物学方法。 结果 分析云南不同疟疾流行区的 169份样本 ,PCR扩增获得 6个不同大小的MSP -2基因片段 ,60 0bp片段占多 ,其频度为 3 4 8% ,5 40bp片段其次 ,占 2 8 3 % ;同时显示具有一定的地理分布差异。 结论 研究证实云南不同地区恶性疟原虫的MSP -2具有较为明显的地理多态性特征。

套式PCR用于海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白1和2的分型研究

目的 了解海南省恶性疟原虫裂殖子表面蛋白 1(pfMSP1)和表面蛋白 2 (pfMSP2 )等位基因型的分型特征。方法 采用套式PCR法分别扩增pfMSP1基因第 2区与第 3区部分片段和pfMSP2基因的中间可变区 (第 3区 ) ,对海南省恶性疟原虫分离株进行基因分型。结果 5 5份血样中有 5 2份恶性疟疾患者扩增出pfMSP1基因片段 ,以MAD2 0型为主导型 (84 6 % ) ,K1型为次要型 ,未检出RO33型 ,两种不同等位基因混合感染率为 15 4 %。同时 ,5 5份血样中有 5 3份恶性疟疾患者扩增出pfMSP2基因片段 ,以 3D7型为主导型 (83% ) ,FC2 7型为次要型 ,混合感染率为 17%。结论 海南省恶性疟原虫的MSP1存在MAD2 0型和K1型两种等位基因型 ,以MAD2 0型为优势虫株 ;其MSP2存在 3D7型和FC2 7型两种等位基因型 ,以 3D7等位基因家族为主。