MNNG和佛波酯诱导建立结肠癌的恶性转化细胞模型

目的建立结肠癌的恶性转化细胞模型。方法以1-甲基-3-硝基-1-亚硝基胍(MNNG)为启动剂、佛波酯(PMA)为促癌剂,对永生化的正常人结肠上皮细胞(NCM460细胞)进行多代诱导处理。采用MTT实验、细胞克隆形成实验和细胞划痕实验鉴定NCM460细胞恶性转化的倾向性和恶性生物学特征,采用Western blot检测神经钙黏附蛋白(N-cadherin)、转化生长因子β1(TGF-β1)和表皮生长因子受体(EGFR)的蛋白表达水平。结果正常NCM460细胞形态为梭形,排列有序,呈单层生长;诱导后的第30代NCM460细胞形态发生显著变化,大小不一,排列紊乱,呈团块状生长。正常NCM460细胞、第17代NCM460细胞、第30代NCM460细胞的增殖能力依次升高,克隆形成数量依次增多,48 h迁移距离和迁移率依次增加或升高(P<0.05)。第30代NCM460细胞中N-cadherin、EGFR、TGF-β1的蛋白表达水平高于正常NCM460细胞(P<0.05)。结论经过MNNG和PMA连续多代诱导处理后,NCM460细胞的生物学功能(增殖、克隆形成和迁移能力)发生明显改变,具备恶性细胞的生物学特征。该模型可用于结肠癌的发病机制和治疗方法研究。

蛋白质组学技术识别Maspin在支气管上皮永生化细胞和恶性转化细胞中的差异表达

背景与目的:Maspin蛋白是一种抑制肿瘤的丝氨酸蛋白酶抑制剂,它在抑制肿瘤生长和转移中发挥一定作用。本研究是利用蛋白质学技术鉴定Maspin在支气管上皮细胞恶性转化过程中的差异表达。方法:利用固相pH梯度等电聚焦双向电泳、肽质量指纹谱技术以及生物信息学技术,对Maspin在永生化细胞系及恶性转化细胞系的表达进行功能蛋白组学分析。结果:在分子量14.4～94kDa、等电点PI3～10范围内,2-D电泳分离出1500多个蛋白质点。凝胶图像分析显示Maspin蛋白在永生化细胞中的表达比恶性转化细胞表达高。Northernblot证实永生化细胞的MaspinmRNA丰度高于恶性转化细胞。结论:肺癌组织中Maspin在细胞转录和翻译水平的表达异常,这可能是肺癌发生的原因之一。

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的细胞周期相关蛋白表达

目的 了解细胞周期调控系统各正、负调节因子在细胞发生恶性转化过程中的变化情况。方法 采用免疫组化技术分别检测了经环磷酰胺(CP)和塞替派 (TEPA)诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)发生恶性转化的BEAS CP和BEAS TE细胞中P5 3、P16、P15、细胞周期蛋白 (cyclin)D1和RB蛋白的表达。结果 BEAS 2B细胞中表达阳性的P16、P15及RB蛋白 ,在BEAS CP和BEAS TE细胞中表达缺失 ;BEAS 2B细胞中检测呈阴性的P5 3蛋白 ,在BEAS CP和BEAS TE细胞中呈阳性 ;cyclinD1蛋白在 3株细胞中检测均为阳性。结论 转化细胞中P16、P15及RB蛋白的表达异常可能影响了细胞周期中P16 (P15 ) /cyclinD1 CDK4 /pRB调控途径的自稳平衡。两转化细胞P5 3蛋白的阳性表达提示转化细胞P5 3蛋白的功能已发生改变。

EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系和恶性转化细胞系中的表达

目的研究EZH2蛋白在食管上皮永生化细胞系(SHEE)和恶性转化细胞系(SHEEC)中的表达。方法采用免疫细胞化学染色、免疫印迹分析和流式细胞术检测两种细胞系EZH2蛋白的表达。结果两种细胞EZH2蛋白染色均呈阳性,阳性反应定位于细胞核,部分细胞胞浆也有阳性着色。免疫印迹分析表明SHEEC细胞和SHEE细胞的总蛋白、核蛋白在分子质量约90ku的位置均出现特异性印迹条带。SHEE细胞中EZH2蛋白的表达强于SHEEC细胞(P<0.05)。流式细胞术显示EZH2蛋白在两种细胞中均有表达,两者的平均荧光强度无明显差别;阳性细胞率均较高,其中SHEE细胞阳性率高于SHEEC细胞。结论EZH2蛋白在SHEE细胞和SHEEC细胞中高表达可能参与了它们的恶性改变;而EZH2蛋白在两种细胞系中的差异表达可能与细胞的分化程度及来源于胚胎食管上皮细胞相关。

塞替派、环磷酰胺诱发的人支气管上皮恶性转化细胞的致瘤性

目的 观察塞替派 (TE)及环磷酰胺 (CP)能否诱发永生化人支气管上皮恶性转化细胞成瘤。方法以永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)为对照 ,以TE诱发转化细胞 (BEAS TE)的琼脂糖克隆扩增细胞(BEAS STE)及CP诱发转化细胞 (BEAS CP)的琼脂糖克隆扩增细胞 (BEAS SCP)为靶细胞接种于 3～ 4周龄裸鼠 ,每组接种 6只 ,♂♀各半。结果 接种后2 6周 ,对照组无一长出肿瘤 ,BEAS STE组有 5只长出肿瘤 ,BEAS SCP组有 1只长出肿瘤 ,其中BEAS STE组有 3只裸鼠的肿瘤直径在 1cm以上。经病理组织形态和免疫组织化学检查证实肿瘤为低分化癌肉瘤组织。结论 TE、CP诱发恶性转化的人支气管上皮转化细胞均具有裸鼠致瘤性。

二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a及其靶基因HOXA1的表达改变

目的检测二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a表达水平,探讨其与靶基因HOXA1癌基因的关系。方法以正常支气管上皮细胞为对照组,二羟环氧苯并芘恶性转化细胞为实验组,用茎环结构逆转录引物逆转录,定量PCR检测两组细胞miR-10a表达水平。运用半定量逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、定量PCR和流式细胞术间接法检测2组细胞HOXA1 mRNA和蛋白表达水平。结果二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a表达水平是对照组的0.01倍,RT-PCR HOXA1 mRNA是对照组的(3.12±0.23)倍,定量PCR HOXA1 mRNA是对照组的8.75倍,HOXA1蛋白表达是对照组的3.48倍。结论二羟环氧苯并芘恶性转化细胞miR-10a可能反向调控靶基因HOXA1的表达。

硒对体外培养的恶性转化细胞（BHLB4）生物效应的影响

本文采用集落形成实验、细胞生长曲线和细胞分裂指数实验的方法观察了不同浓度硒对肿瘤细胞生物效能的影响；结果表明：１μｍｏｌ／Ｌ硒对ＢＨＬＢ４细胞无影响；５０μｍｏｌ／Ｌ硒对ＢＨＬＢ４细胞有明显的细胞毒作用，细胞全部死亡；２０μｍｏｌ／Ｌ硒对ＢＨＬＢ４细胞的集落形成率、细胞生长率及分裂指数均有明显的抑制作用。与对照组相比有显著性差异（Ｐ＜０．００２）细胞毒作用不明显。

人支气管上皮细胞16HBE和其经硫化镍、反式-BPDE诱导的恶性转化细胞对脂质体转染效率的差异性比较

目的:通过脂质体法转染不同荧光蛋白质粒到多种接种密度细胞的效率差异探讨恶性转化细胞的癌变过程。方法:以16HBE、结晶型NiS诱导的16HBE恶性转化细胞和反式-BPDE诱导的16HBE恶性转化细胞为实验对象,采用不同的细胞接种密度,用脂质体法对它们分别转染两种不同的表达荧光蛋白的质粒,通过荧光显微镜观察细胞的转染情况。结果:无论转染eGFP质粒还是GFP-LC3质粒,在多种细胞密度下,正常细胞16HBE都比恶性转化细胞的转染效率低。结论:恶性转化细胞在癌变过程中可能发生了细胞膜通透性的改变。

环磷酰胺及塞替派诱导的人支气管上皮恶性转化细胞的p16^(INK4a)及p15^(INK4b)基因突变

目的 了解环磷酰胺 (CP)和塞替哌 (TEPA)诱导永生化人支气管上皮细胞 (BEAS 2B)的恶性转化株内BEAS CP和BEAS TE细胞p16和p15基因的突变情况。方法 采用聚合酶链反应 (PCR)、聚合酶链反应 单链构象多态性分析 (PCR SSCP)及DNA序列分析技术。结果 BEAS CP细胞p15基因的外显子 1和外显子 2都出现了异常带型。BEAS TE细胞p16基因的外显子 1及外显子 2a出现了异常带型和迁移率滞后现象 ;p15基因外显子 1的 2条单链带之间出现异常条带。DNA序列分析发现BEAS CP细胞的p15基因外显子 1的 182位有C的插入 ,2 0 6位有G的插入 ;外显子 2的第 30 8位密码子有C→T(TCC→TTC)转换 (Ser→Phe) ,第 32 7位密码子有T→A(AAT→AAA)颠换 (Asn→Lys)。BEAS TE细胞的p16基因外显子 2a的第 12 5位密码子有G→A(CGC→CAC)转换 (Arg→His)。结论 p15基因在CP诱导BEAS 2B发生恶性转化的过程中发挥了重要作用。在TEPA诱导BEAS 2B细胞发生恶性转化的过程中可能涉及了p16基因的失活。

细胞角蛋白在食管永生化上皮细胞和恶性转化细胞系的表达

目的:研究细胞角蛋白(cytokeratin,CK)在食管永生化上皮细胞株SHEE和由SHEE恶性转化而来的细胞株SHEEmt之间的差异表达。方法:采用免疫细胞化学染色和免疫印迹的方法,观察SHEE细胞和SHEEmt细胞中CK的表达。结果:免疫细胞化学染色显示两种细胞均呈CK染色阳性,阳性反应位于胞浆;SHEE细胞染色弱阳性,SHEEmt细胞染色中等强度阳性。免疫印迹分析在两种细胞中抗角蛋白抗体均与分子量52.5ku、46ku和45ku的抗原同时发生反应;但SHEEmt细胞中的3条阳性反应带均强于SHEE细胞。结论:CK阳性表达支持两种细胞来源于非角化型或胎儿型鳞状上皮;随着永生化细胞转化为恶性细胞,某些角蛋白表达上调,可能与细胞恶性转化后的分化程度相关。

塞替派诱发永生化人支气管上皮细胞的恶性转化(一)

目的 研究塞替派对人类支气管上皮细胞的致癌转化效应。方法 利用永生化人支气管上皮细胞(BEAS 2B)为靶细胞模型 ,以塞替派诱导BEAS 2B细胞的恶性转化 ,并伴随研究了塞替派转化细胞 (EBAS TE)的增殖动力学、细胞周期和锚着独立生长能力等转化表型特征。结果 经传代和软琼脂培养基筛选 ,BEAS TE具有较为稳定的转化表型和细胞生物学特性。结论 塞替派对人支气管上皮细胞具有较强的恶性转化效应。

贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化

背景与目的:实验研究和流行病学调查结果表明,铀可广泛地影响人体健康,但其远期效应,特别是致癌性,还缺乏明确的结论。本文模拟人吸入贫铀(depleteduranium,DU)气溶胶的情形,研究难溶性贫铀诱发人支气管上皮细胞恶性转化及肺癌相关基因表达谱。方法:用难溶性贫铀氧化物(dUO2)作用腺病毒-12/SV40病毒永生化的人支气管上皮细胞(BEAS-2B),通过观察不同代龄细胞的倍增时间、血清抗性、半固体琼脂克隆形成率及裸鼠成瘤性,鉴定细胞的恶性转化特性;用213个肺癌相关基因的芯片对贫铀诱发的转化BEAS-2B细胞的基因表达谱进行检测。结果:贫铀作用后的第5代BEAS-2B细胞倍增时间明显缩短,血清抗性显著增强;第10代细胞具有锚着独立性生长特性(半固体琼脂克隆形成);第15代裸鼠体内成瘤。二甲亚砜(DMSO)对贫铀诱发的BEAS-2B细胞恶性转化有明显保护效果。213个肺癌相关基因的芯片检测结果表明,转化细胞中有70多个基因的表达水平发生明显改变,其中10余个基因表达水平明显下降。结论:贫铀在体外具有致癌性。

Smad7基因在细胞恶性转化过程中的促增殖作用

用基因转染的方法,建立稳定表达Smad7基因的永生化及恶性化人支气管上皮细胞系,用MTT法检测Smad7基因过表达对细胞生长、增殖的影响及对TGF β1介导的生长抑制效应的影响.结果表明在永生化和恶性化人支气管上皮细胞系BEP2D和BERP35T2中各筛选到2个稳定表达SMAD7蛋白的克隆,命名为BS7 1、BS7 2(来源于BEP2D),RS7 1、RS7 2(来源于BERP35T2).这些细胞系细胞的生长、增殖能力均强于转染空载体的对照细胞系,同时TGF β1对这些细胞系的生长抑制能力明显减弱.提示Smad7基因通过降低细胞对TGF β的应答来促进细胞的生长、增殖能力.

Oltipraz对细胞恶性转化抑制作用的研究

选用人胚肺为实验材料，研究了十字花科蔬菜提取物ｏｌｔｉｐｒａｚ对人肺癌病变早期细胞恶性转化的阻断作用。将阻断按时间分为ｏｌｔｉｐｒａｚ在ＣＳＣ作用前、后和同时三组，并设ＣＳＣ、ｏｌｔｉｐｒａｚ、ＤＭＳＯ三组对照，将上述６组体外培养处理的人胚肺组织，提取ＤＮＡ转染Ｒａｔ－１细胞，用低血清筛选、作软琼脂培养、裸鼠接种鉴定，结果在ＣＳＣ、ＣＳＣ→ｏｌｔｉｐｒａｚ两组获得恶性转化细胞，ＣＳＣ组恶性度更大。提示ｏｌｔｉｐｒａｚ对ＣＳＣ所致的细胞恶性转化具有一定阻断作用，ｏｌｔｉｐｒａｚ在ＣＳＣ运用前或同时运用效果较好；进一步推断ｏｌｔｉｐｒａｚ对人肺癌变早期具有一定防治作用。

环磷酰胺及塞替派诱导人支气管上皮细胞恶性转化的超微结构

为了解抗癌化疗药环磷酰胺 (CP)及塞替派(TE)诱导的永生化人支气管上皮细胞恶性转化过程中的细胞超微结构的动态变化 ,采用透射电镜方法观察的细胞模型由对照永生化人支气管上皮细胞(BEAS- 2 B) ,受环磷酰胺 (BEAS- CP)和塞替派(BEAS- TE)诱导的恶性转化细胞组成 .发现经 CP和 TE暴露的细胞可出现细胞死亡 ,凋亡和转化 ,它们具有各自的超微结构特征 .说明逃逸细胞死亡 ,凋亡的支气管上皮基细胞呈增生性改变 。

八氯二丙醚对BALB/c3T_3细胞恶性转化的研究

目的 检测八氯二丙醚 (S2 )的细胞恶性转化作用。方法 采用传代细胞系BALB/c3T3 细胞进行细胞毒性实验确定转化实验的剂量范围 ,再进行细胞转化实验并对转化细胞进行恶性行为鉴定。结果 S2 各剂量组均能诱发该细胞出现典型的细胞转化灶 ,并呈剂量 -反应关系 ;软琼脂培养证明转化细胞为恶性转化细胞。结论 S2 具有致BALB/c3T3 细胞恶性转化作用 ,有必要进行深入研究。

二羟环氧苯并芘恶性转化细胞的microRNA表达谱

目的检测二羟环氧苯并芘（BPDE）恶性转化细胞的microRNA（miRNA）表达谱，寻找恶性转化细胞与对照细胞差异表达的miRNA。方法以溶剂二甲亚砜助溶的终浓度为2．0μmol／L的BPDE培养液培养人支气管上皮细胞株16HBE，获得BPDE恶性转化的细胞模型为实验组，同时，以含二甲亚砜的培养液培养正常16HBE作为对照组。通过微阵列技术检测实验组与对照组327个人类miRNA，并选择差异表达明显的miR-10a和miR-320用反转录荧光定量PCR方法对微阵列结果加以验证。结果获得2组细胞327个miRNA表达谱，发现差异表达miRNA55个，其中46个表达上调，9个表达下调，并得到反转录荧光定量PCR的验证。结论获得BPDE恶性转化细胞与正常16HBE细胞差异表达的miRNA，为进一步寻找BPDE恶性转化细胞特征性miRNA提供了研究基础。

EB病毒编码的BARF_1基因在人上皮细胞恶性转化中的作用

背景与目的:EB病毒(Epstein-Barrvirus,EBV)的BamHⅠA区域的早期基因BARF1能使猴肾上皮细胞永生化,使人淋巴细胞和呲类动物的成纤维细胞发生恶性转化,但有关该基因在人上皮细胞肿瘤发生发展中的作用未见报道。本研究的目的是观察EBV-BARF1基因对人上皮细胞生长特性的影响及能否使之发生恶性转化。方法:构建真核重组表达载体pcDNA3-BARF1,转染人支气管上皮细胞(HBE),建立稳定表达BARF1基因的HBE细胞株;观察细胞生长状况、生长速度、在软琼脂中集落形成能力及对裸鼠的致瘤能力。结果:EBV-BARF1基因转染细胞生长旺盛,失去接触抑制能力,生长速度增快,并在裸鼠体内成瘤。结论:EBV的早期基因BARF1作为病毒的癌基因,在支气管上皮细胞的恶性转化中可能起着重要作用。

环磷酰胺或塞替派诱导人支气管上皮细胞恶性转化的形态计量学

以永生化人支气管上皮细胞 (BEAS- 2 B)分别受环磷酰胺 (BEAS- CP) ,塞替派 (BEAS- TE)暴露并发生转化的细胞为模型 ,对转化细胞进行形态计量学研究 ,期望寻找人类上皮细胞恶性转化的形态计量指标 .结果表明 :BEAS- 2 B经两种药物处理后可生成转化型和非转化型细胞集落 .转化细胞的形态计量参数中 ,细胞和细胞核面积 ,最大直径 ,最小直径 ,等效直径 ,形状因子的数值按 BEAS- 2 B,BEAS- CP,BEAS- TE的组序递升 .表达细胞形态为异形的指标 :细胞和细胞核异形指数 ,核浆比则沿BEAS- 2 B,BEAS- CP,BEAS- TE的顺序递减 .结果提示 。

甲基丙烯酸环氧丙酯诱导人胚肺细胞恶性转化机制的研究

[目的 ]研究甲基丙烯酸环氧丙酯 (GMA)诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化的机制。 [方法 ]本研究在建立GMA体外诱导的人胚肺成纤维细胞 (HELF)恶性转化模型的基础上 ,采用mR NA差异显示 (DD PCR)技术 ,对恶性转化细胞同正常细胞之间基因的差异表达状况进行比较分析。 [结果 ]实验结果显示 ,两种细胞在基因表达方面存在明显差异。在转化细胞中克隆到的 5个差异表达基因片段 ,其中 3个高表达基因片段 (cDNA)分别与人核糖体蛋白 (RP)L41、RPL15、RPS16基因高度同源 ;2个差异表达基因片段分别与人促分裂原活化的蛋白激酶激酶激酶 11(MAPKKK 11)和转化生长因子 β诱导的蛋白 (TGFBI)基因高度同源 ,它们在转化细胞中分别呈明显的上调和下调表达。[结论 ]包括上述RP、MAPKKK11和TGFBI多个基因的激活与失活可能与GMA诱导的细胞恶性转化过程有关。GMA在诱导人胚肺成纤维细胞恶性转化过程中。使MAPK及TGF β信号传导通路功能异常 。