核糖体基因ITS作为苎麻疫霉、恶疫霉分类辅助性状的研究

以2个雄器大多围生、少数侧生的苎麻疫霉菌株与1个雄器侧生、偶有围生的恶疫霉菌株为材料，采用真菌核糖体基因转录间隔区（ITS）通用引物，PCR扩增3个供试菌株核糖体基因的ITS1和ITS2，并对PCR产物进行了克隆和序列分析。结果是苎麻疫霉的ITS1和ITS2分别由206和453个碱基组成， 而恶疫霉则分别由218和415个碱基组成。2个供试苎麻疫霉菌株的ITS1和ITS2的碱基序列同源性均分别为100%。苎麻疫霉和恶疫霉ITS1同源性为74.9%，其中中间区域40bp-164bp之间在两种间变异丰富，同源性只有59.4%，而1bp-39bp和165bp-239bp两区域的同源性分别为92.3%和92.1%; ITS2在两种疫霉菌间的同源性为71.0%。结果表明苎麻疫霉和恶疫霉ITS的碱基序列有明显差异。上述结果提示，ITS区域碱基序列可区分苎麻疫霉和恶疫霉。

恶疫霉侵染的草莓SSH文库的构建及分析

为了解草莓与恶疫霉[Phytophthora cactorum(Lebert&Cohn)J.Schrt]互作的分子机制,以感病草莓品种FDP821为材料,以接种恶疫霉的草莓冠部为处理、未接种健康生长的草莓冠部为对照,利用抑制性差减杂交技术构建恶疫霉侵染诱导的草莓差异表达的cDNA差减文库。PCR鉴定随机挑取的阳性克隆,显示插入片段大小为300～1 000bp。随机挑取109个克隆进行测序,获得92个草莓EST,分析表明来自50个草莓基因。BLASTX比对结果表明:这些草莓基因的功能涉及抗病防卫机制、抗氧化作用、物质代谢和蛋白质合成等。这为理解草莓冠腐病抗性分子机制奠定了重要的数据基础。

恶疫霉实时定量RT-PCR分析中内参基因的选择

为选择合适的内参基因用于分析植物病原卵菌恶疫霉(Phytophthora cactorum)的基因表达情况,本研究利用实时定量RT-PCR分析持家基因Ubc、Tub-b、WS21和WS41在恶疫霉生长发育阶段和侵染草莓阶段的表达差异,并利用软件geNorm、NormFinder和BestKeeper比较其表达稳定性。结果表明:基于公共数据库序列和其他疫霉菌同源序列设计的持家基因引物在恶疫霉中具有良好的扩增效率、反应有效性和特异性。通过分析,发现在恶疫霉的不同生长发育阶段(菌丝生长、游动孢子囊、游动孢子和休止孢萌发)和侵染草莓阶段(接种后3、5、7天),表现最为稳定的是Ubc基因。当使用多个内参基因时,Ubc和WS41是最适合校正恶疫霉基因表达数据的内参基因组合。本研究结果为利用实时定量RT-PCR准确分析恶疫霉基因相对表达量提供了重要的内参基因,也为其他疫霉菌的基因表达研究提供了有价值的参考。

恶疫霉有性生殖交配行为的研究

对同宗配合疫霉种——恶疫霉（ＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａｃａｃｔｏｒｕｍＳｃｈｒｏｔｅｒ）抗甲霜灵突变株和抗地茂散突变株的抗药性在游动孢子和卵孢子后代的遗传分析，筛选到抗性分别由细胞核纯合显性单基因控制的抗甲霜灵突变株和由细胞质可稳定遗传的线粒体基因控制的抗地茂散突变株。将携带抗甲霜灵对地茂散敏感（即ＭｔｒＣｎｓ）标记的亲本与携带抗地茂散对甲霜灵敏感（即ＭｔｓＣｎｒ）标记的亲本共同培养，在２００个有性生殖单卵孢后代中检测到携带３种不同抗药性标记的单孢株，其中３２株携带ＭｔｒＣｎｓ标记，１６５株携带ＭｔｓＣｎｒ标记，另有３株同时携带双亲的标记性状即ＭｔｒＣｎｒ。结果表明：恶疫霉种内不同菌株共同培养时，有性生殖以配对亲本的各自自交为主，同时配对亲本间也可发生一定频率的杂交。

恶疫霉生物学性状的遗传研究

研究恶疫霉菌株ＳＢ－５和ＰＫ－９的生长速率、菌落形态和同宗配合等重要生物学性状在单游动孢子和单卵孢子后代的遗传。结果表明，上述性状在无性和有性单孢后代均可稳定遗传，认为供试恶疫霉菌株控制上述性状的遗传因子是纯合的。

恶疫霉致病力和对甲霜灵敏感性的遗传与变异

以分离自黑龙江腐烂苹果的恶疫霉Phytophthora cactorum Schroeter野生型菌株Ap14为亲本，采用菌丝块创伤接种法测定了恶疫霉对苹果的致病力在无性繁殖和有性生殖后代的遗传。结果是连续2代单游动孢子后代在苹果上所致病斑半径分别为22.4~24.1mm和21.8~23.4mm，与亲本所致病斑半径22.5mm无显著差异；而其20个自交后代个体所致病斑半径为21.4~25.8mm，与亲本有显著差异，其中2株致病力显著强于亲本，其余与亲本相似。表明恶疫霉对苹果的致病力在无性后代可稳定遗传，而在自交有性后代发生分离。同时在含甲霜灵0.05μg/ml的LBA平板上测定了恶疫霉菌丝生长对甲霜灵的敏感性在无性和有性后代的遗传。结果是恶疫霉对甲霜灵的敏感性在无性单孢后代无显著变异，而在50个自交有性后代中，上述浓度对其菌丝生长的抑制率分布范围为67.3~97.1%，与亲本78.3%有极显著差异，其中3株高于亲本，3株低于亲本，44株与亲本相似。表明恶疫霉对甲霜灵的敏感性同样在无性后代稳定遗传而在有性后代发生变异。上述结果提示，供试恶疫霉菌株中上述性状可能由细胞核杂合基因控制。

利用mRNA差异显示技术克隆恶疫霉侵染诱导表达的草莓基因

为了解草莓与恶疫霉互作的分子机制,以接种后3、5和7 d的感病草莓品种‘FDP821’的冠部为材料,利用mRNA差异显示技术研究‘FDP821’与恶疫霉亲和互作前后基因表达的差异,获得78条差异表达的cDNA片段,通过分析从中分离出恶疫霉侵染诱导表达的10个草莓基因cDNA片段。BLASTX在线分析表明,这些草莓基因的功能涉及呼吸作用、衰老和核苷运输与代谢等。为阐明草莓与恶疫霉互作的分子机制提供了重要的线索。

恶疫霉有性杂交后代在土壤中的生长和游动孢子萌发研究

将恶疫霉突变株及其有性杂交后代的菌丝块 ( 2mm× 2mm)和游动孢子接种于灭菌土或自然土中 ,对它们的生长状况和游动孢子萌发率进行研究。结果显示 ,接种于灭菌土中的 7株杂交个体中 ,有 2株杂交个体的生长速率较快 ,其菌落半径分别为 8.0mm和 7.2mm( 3d) ,显著大于两亲本的菌落半径 (亲本AP1 4M-1 -52菌落半径为 3 .0mm ,另一亲本PK9Cn -2 -2 4生长较弱 ,不形成明显的菌落 ) ,其它杂交个体生长较弱 ,不形成明显的菌落 ;选择 3株杂交个体的游动孢子接种于灭菌土中 ,其中有两株杂交个体的游动孢子萌发率 (分别为 77.3 %和 71 .3 % )介于两亲本 (分别为 85.0 %和 67.7% )之间 ,但无显著性差异 (P =0 .0 5) ;另一杂交个体游动孢子萌发率 ( 59.7% )显著低于亲本AP1 4M -1 -52游动孢子萌发率 (P <0 .0 5)。而接种于自然土中的 7株杂交个体中 ,有 5株杂交个体长出少量菌丝和孢子囊 ,另 2株不生长 ;亲本菌株AP1 4M -1 -52有少量菌丝扩展和产生孢子囊 ,另一亲本菌株PK9Cn -2 -2 4无菌丝扩展 ;恶疫霉有性杂交个体及其亲本的游动孢子在自然中均不能萌发。结果表明恶疫霉有性杂交后代营养体和游动孢子在土壤中的生活能力与亲本相似。

梨树恶疫霉的生物学特性研究

宝珠梨疫腐病是云南省的一种新记录病害 ,其病原菌为恶疫霉〔Phytophthora cactorum(L ebert et Cohn) Schrot〕。适宜恶疫霉的培养基是番茄汁、V8汁和 PDA培养基。适宜恶疫霉生长的p H值 3～ 10 ,最适 p H值为 5～ 6 ,适宜生长的温度范围 10～ 30℃ ,最适生长温度为 2 0～ 2 5℃。恶疫霉对果糖、麦芽糖、蔗糖等碳源的利用好于其它碳源 ,对酵母膏、天门冬酰胺、牛肉膏等氮源的利用好于其它氮源。

恶疫霉生长速率与同宗配合性状的遗传与变异

在实验室条件下 ,对不同地区和不同寄主来源的恶疫霉菌株的线性生长速率和同宗配合性状的遗传进行了研究。结果指出 :恶疫霉菌株同宗配合性状在无性和有性后代均可稳定遗传 ,表明在供试恶疫霉菌株中上述性状的控制因子是纯合的。供试菌株生长速率的遗传情况十分复杂 ,至少存在 3种类型 :1 在单孢无性后代和自交后代均可稳定遗传 ;2 在单游动孢子后代稳定遗传而在自交后代发生变异 ;3 在无性后代和有性后代均发生变异。表明该性状可能由细胞核纯合基因、也可能由细胞核杂合基因。

恶疫霉有性杂交个体在土壤中的越冬存活与腐生定殖能力

被测的 6个杂交后代菌株的卵孢子经 12 8d越冬后 ,均有部分仍然存活 ,从土壤中回收的越冬卵孢子在实验室条件下的萌发率为 1 0 %～ 6 4 0 %。杂交后代菌株在土壤中的苹果病组织块 (大小约 10mm× 10mm× 10mm)经 4～ 5个月的越冬后进行分离 ,从灭菌土壤中 5个月后的检出率为 2 9 0 %～ 10 0 % ,在未灭菌的自然土壤中 4个月后的检出率为5 0 %～ 33 3%。供试的杂交后代菌株游动孢子在土壤中寄主组织材料上的腐生定殖能力与亲本菌株相似。上述结果表明恶疫霉有性杂交后代在土壤中有较强的存活能力和腐生定殖能力。

恶疫霉有性杂交后代的竞争能力研究

５株杂交个体（携带对甲霜灵和地茂散的抗性标记）的游动孢子分别与其野生型亲本ＡＰ １４和ＰＫ９（对甲霜灵和地茂散均敏感）按１：１、１：９和１：４９比例混合涂布在１０％Ｖ６培养基平板上或接种在苹果片上生长４～５ｄ，并诱导产生孢子囊和释放游动孢子，经单孢分离建立单孢无性系，在含甲霜灵或地茂散的培养基上检测杂交个体的单孢后代所占的百分率。结果是，在Ｖ６培养基平板上混合生长的３０个组合中，仅３个组合杂交个体的单孢后代在其单孢无性系群体中所占的比例显著低于野生型亲本，其余组合均符合其各自的期望值；在苹果片上混合接种的３０个组合，杂交个体与野生型亲本的单孢后代所占比例均符合其各自的期望值。进一步测定２个杂交个体（ＡＰＫ－９和ＡＰＫ－２４）分别与其野生型亲本以１：１的比例混合后在Ｖ６培养基平板上和苹果片上连续３个产孢循环过程中两者比例的变化，结果是，在杂交个体与野生型亲本ＡＰ１４的组合中，杂交个体的后代所占的百分率由第一个产孢循环的４９．１％～５４．２％至第三个产孢循环下降为１．８％～６．２％：而在与另一野生型亲本ＰＫ９的组合中，杂交个体的后代所占的百分率从第一个产孢循环的４４．４％～５４．２％至第３个产孢循环上升为７２．

草莓果腐病病原疫霉种的鉴定

草莓果腐病是烟台地区草莓烂果的重要原因之一。通过对草莓果腐病病原菌的形态、培养性状、致病性及生理生化特性等方面的研究 ,查明烟台地区草莓果腐病病原菌为恶疫霉 (Phytophthoracacto rum)。

三七疫霉病拮抗根际土壤细菌的筛选及初步鉴定

为了筛选对环境友好的生防细菌防治三七疫霉病,通过高温处理、稀释涂布法分别从三七健康及患病植株根际土壤分离了21和16株可培养细菌,并以对峙培养法分别筛选到6和7株拮抗菌株,上述13株拮抗菌株经生理生化特征鉴定为芽孢杆菌属。结果表明,健康植株根际土壤有较丰富的可培养细菌,而患病植株根际土壤可培养细菌中的拮抗菌株较丰富,表明健康植株与患病植株根际土壤的拮抗细菌丰度发生了变化。解淀粉芽孢杆菌B1的抑菌带宽达8.5mm,具有一定的潜在生防价值。

草果疫病病原菌鉴定及其生物学特性分析

草果是云南省贡山县推动脱贫攻坚与乡村振兴有效衔接主导产业,种植历史悠久,具有独特区位优势,为摸清林下草果疫病的发病规律,在独龙江、茨开、普拉底、捧当四地进行初步调查,平均病株率为7%。通过病原菌的分离、纯化及形态学鉴定,明确草果疫病是由恶疫霉引起的一种卵菌性病害,并对草果恶疫霉菌株进行生物学特性测定。结果表明,该菌最适宜菌丝生长的培养基为番茄汁培养基、V8汁培养基和PDA培养基,其次是大豆培养基和玉米面培养基,菌落生长最差的是燕麦培养基及草果茎叶组织汁培养基;该菌在pH值3~10都能生长,适宜生长pH值为4~7,最适宜生长的pH值为6;该菌丝可以生长的温度在10~30℃,最适温度为25℃;该病菌对果糖,麦芽糖和蔗糖的利用效果最好,其次是葡萄糖、淀粉和甘油,对木糖的利用效果最差;在氮素培养中菌丝生长对酵母膏、天门冬酰胺和牛肉膏的利用最好,其次是KNO_(3)、NH_(4)Cl和甘氨酸的利用,对蛋白胨的利用最差。

三七疫病病菌Phytophthora cactorum生物学特性初步研究

通过对来自不同海拔地区的6个恶疫霉菌株的生物学特性测定，结果表明：该菌在CA（胡萝卜琼脂）培养基、燕麦培养基、CMA（玉米）培养基和三七汁培养基中生长速度较快；最适宜的碳源为甘露醇、可溶性淀粉、蔗糖和D-甘露糖；最适宜的氮源为KNO3、脲和NH4NO3。其营养生长的温度范围是5—32℃，最适生长温度为24—26℃。不同地区菌株生长的最适温度有一定差异；该菌在pH值为3—12均能生长，最适pH值为5—8。土壤漫出液是诱导孢子囊产生的最好介质。

云南省宝珠梨疫腐病的发生与防治

宝珠梨疫腐病是在云南省会泽县近年来发生的一种新病害,其病原菌为恶疫霉犤Phytophthoracactorum(LebertetCohn)Schrot犦。对该病的发病情况、病害症状、发病规律、病原菌生物学特性、病原菌的来源及防治等进行了初步研究。

宝珠梨疫腐病病原菌研究

宝珠梨疫腐病是云南省的一种新记录病害 ,其病原菌为恶疫霉Phytophthoracactorum (LebertetCohn)Schrot.适宜恶疫霉分离培养的培养基是番茄汁培养基、V8汁培养基和PDA培养基。适宜恶疫霉生长的pH值范围在 3～ 10之间 ,最适pH值为 5～ 6 ,适宜生长的温度范围为在 10～ 30℃之间 ,最适生长的温度为 2 0～ 2 5℃ .恶疫霉对果糖、麦芽糖、蔗糖等碳源的利用好于其它碳源 ,对酵母膏、天门冬酰胺、牛肉膏等氮源的利用好于其它氮源。