生产禽流感病毒的悬浮MDCK细胞稳定性的研究

旨为研究悬浮MDCK细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性与病毒生产稳定性。以悬浮MDCK细胞为研究对象,通过对该细胞进行了长达200多天的传代培养,考察了传代过程中各代次细胞的生长情况以及对H9N2禽流感病毒的生产能力差异;探究了不同培养基稀释比例和MOI等工艺参数条件对长期传代的悬浮MDCK细胞生产H9N2禽流感病毒过程的影响关系;另外,从ROS水平和细胞周期两方面,研究了高低代次细胞的病毒生产能力差异的内在原因。结果显示,各代次悬浮MDCK细胞形态相似,细胞生长能力无显著性差异,表明该细胞在长期传代过程中细胞生长稳定性良好。但HA滴度随细胞代次的增加而增加,最高代次细胞(P111)的病毒滴度较最低代次细胞(P1)约高0.5 Log2HAU/100μL;P111细胞在不同工艺下病毒产量均高于P1细胞,表明了该细胞长期传代后病毒生产能力略有提高。最后,研究发现,与P1相比,P111胞内ROS水平较低并且G0/G1期细胞的比例较高,此现象可能是高代次细胞产量提高的原因。

悬浮MDCK细胞源与鸡胚源H9亚型禽流感疫苗免疫效力比较研究

为探讨MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感灭活疫苗的免疫效果,使用10日龄SPF鸡胚和MDCK纯悬浮细胞分别接种H9亚型禽流感BX13株病毒,收获抗原液,制备2种单价油佐剂灭活疫苗,按照不同免疫剂量对21日龄SPF鸡进行免疫接种,测定免疫后不同时间的血清HI抗体,免疫后21 d翅静脉攻毒,测定疫苗的保护率。结果表明:2种疫苗分别以0.3、0.2、0.1、0.02m L/只的剂量接种21日龄SPF鸡后,7 d HI抗体均为0log2,免后14 d、21 d时2种疫苗相同免疫剂量组间HI抗体无明显规律性差异。免疫后21 d,2种疫苗0.1mL/只~0.3mL/只的免疫剂量,各组间HI抗体水平无明显差异,可以达到1∶128以上。攻毒试验表明,鸡胚源疫苗0.1 m L/只、MDCK细胞源疫苗0.2mL/只的免疫剂量可以达到10/10保护。本研究为使用MDCK纯悬浮细胞制备的H9亚型禽流感疫苗的深化研究和应用奠定了基础。

基于悬浮型MDCK细胞冻存和快速复苏的一种流感病毒培养方法

本文使用一种基于高分子聚合物的细胞保护剂(CCM046)冻存和复苏悬浮型MDCK细胞,并探索开发一种更加便捷的流感病毒培养方法。结果显示,CCM046细胞冻存液可稳定的于-80℃条件下保存悬浮型MDCK细胞,且细胞活力稳定,可在复苏后快速恢复细胞增殖。在细胞复苏24 h后进行攻毒实验,培养48 h后所产生的流感病毒含量基本与持续培养的新鲜细胞相同,初步证明该方法可用于建立一种快速、便捷的使用MDCK细胞培养和分离流感病毒的技术方法。

无血清悬浮MDCK细胞培养流感病毒纯化工艺的初步建立

目的建立无血清悬浮MDCK细胞培养流感病毒的下游纯化工艺。方法采用40 L反应器,收获无血清悬浮MDCK细胞培养的流感病毒,经澄清浓缩后,添加不同终浓度(1、10、30、50 U/mL)的Benzonase■核酸酶,置37℃酶解不同时间(2、4、6、8 h),优化核酸酶去除细胞残留DNA的条件。采用两步层析法,探讨不同线性流速(60、150、300 cm/h)和上样缓冲液盐离子浓度(150、500、1 000 mmol/L)对复合介质纯化效果的影响;探讨不同线性流速(60、150、300 cm/h)对离子层析介质纯化效果的影响。根据确定的参数进行3批次纯化工艺样品的检测。结果病毒浓缩液经10 U/mL Benzonase?核酸酶37℃酶解6 h后,DNA去除率即可达99%以上。确定复合介质的流速为60 cm/h,上样缓冲液组成为150 mmol/L NaCl+50 mmol/L Tris,pH 7.4,确定离子交换介质流速为150 cm/h。3批纯化工艺样品去除了99.94%的宿主细胞残留蛋白和99.99%的残留DNA,残留DNA达欧盟标准,不高于10 ng/剂。结论初步建立了无血清悬浮MDCK细胞流感疫苗的下游纯化工艺。

MDCK细胞悬浮驯化及对H9亚型禽流感病毒敏感性的研究

为获得对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮MDCK细胞株,通过逐渐降低血清的方法对贴壁依赖的MDCK细胞进行了无血清纯悬浮驯化,最终获得了一株对H9亚型禽流感病毒敏感的纯悬浮细胞株MDCK-sus。通过测定表明,该细胞株能够迅速增殖,倍增时间为24h,使用H9亚型禽流感病毒BX13株感染该细胞,培养72h,培养液的病毒HA价可达到1∶512,每0.1mL病毒含量达到108.5EID50,为利用生物反应器大规模悬浮培养制备H9亚型禽流感病毒抗原奠定了基础。

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞中培养条件的优化

目的:探索重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株的最佳培养条件,为规模化生产提供参数。方法:通过分析病毒培养液的血清浓度、温度、pH、胰酶终浓度和病毒接种量、收获时间来优化病毒在MDCK上的最佳培养条件。结果:重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株在MDCK悬浮细胞上增殖的最佳培养条件为按接种量MOI 10^(-3),于胰酶终浓度为5μg/L、温度35.0℃、pH7.3±0.1的无血清病毒培养液中培养,收获时间为48~60 h,以48 h最佳。

悬浮与贴壁MDCK细胞在流感病毒分离培养中的应用评价

目的比较悬浮细胞MDCK和贴壁细胞MDCK两种培养体系对流感病毒分离培养的差异,探讨悬浮细胞的应用前景。方法通过细胞计数记录两种细胞的活细胞密度和细胞特定生长速率,使用WHO推荐疫苗株进行病毒感染实验,连续传代5次后观察血凝效价并对HA和NA基因进行测序,观察基因突变情况。结果悬浮细胞的24 h、48 h活细胞密度较贴壁细胞更稳定;病毒连续传代培养至第三代时悬浮细胞培养的病毒HA滴度可达1∶256以上,而贴壁细胞则无滴度;悬浮细胞培养的H3N2和BV亚型流感病毒第四代和第五代HA基因各发生1个氨基酸位点突变,贴壁细胞两个代次内未发现基因突变,NA基因均未发现基因突变。结论悬浮MDCK细胞较贴壁细胞生长更为稳定,且病毒分离培养效率高,连续传代病毒突变率低,在基于细胞培养技术的流感疫苗生产工艺中具备一定的可行性。

无血清悬浮培养MDCK细胞系的建立及生物反应器高密度培养

目的建立无血清悬浮培养MDCK细胞系,分析该悬浮细胞的生长特性、病毒敏感性、代谢动力学特征及生物反应器线性放大的可行性。方法通过逐步降血清和无血清悬浮驯化的方式获得1株MDCK悬浮细胞,检测其病毒敏感性,在1.2 L四联平行生物反应器中分析该悬浮细胞以不同初始接种密度(50×10^(4)、100×10^(4)、150×10^(4)、200×10^(4)个/mL)培养的细胞生长特性、代谢动力学特征和最佳传代时间,并进行5 L到75 L生物反应器的线性放大培养。结果贴壁培养型MDCK细胞以3%低血清稳定培养5代后,将该细胞直接适应无血清培养基获得1株MDCK悬浮细胞(命名为MDCK-XF03)并建库,复苏活力为96.8%;细胞接种不同型别的流感病毒均能较好增殖;以不同初始接种密度培养MDCK-XF03细胞,其最大增殖浓度均达1000×10^(4)个/mL以上,且差异无统计学意义(P>0.05),在培养前48 h均具有较大比生长速率,且差异有统计学意义(P<0.05),此时倍增时间也较短,且差异有统计学意义(P<0.05),MDCK-XF03细胞在84 h之前可充分利用葡萄糖。结论成功获得1株MDCK悬浮细胞MDCK-XF03,选择以200×10^(4)个/mL的初始接种密度进行生物反应器大规模培养,实现了从5 L到75 L的高密度线性放大培养,为流感疫苗的工业化生产提供了细胞基质。

重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株培养条件的优化

【背景】高致病性禽流感疫情的暴发造成了巨大的经济损失和环境卫生的破坏,现阶段疫苗接种仍是我国控制禽流感的主要措施之一,需要大量安全、高效和低成本的禽流感病毒疫苗。鸡胚法制备禽流感病毒疫苗的工艺存在原料来源受限、过程复杂、个体差异、培养周期长和不易放大培养等缺陷。而利用生物反应器大规模培养动物细胞生产病毒疫苗,不仅可以大幅度提高单位产量,实现高密度细胞和高病毒产率,同时可保证产品质量。目前我国用于禽流感防控的疫苗为重组禽流感病毒(H5+H7)二价灭活疫苗(H5N1 Re-8株+H7N9 H7-Re1株)。国内细胞全悬浮工艺生产禽流感灭活疫苗单罐产能最大为6 000 L,高病毒含量抗原的提供是生产高效疫苗的主要影响因素之一。【目的】为了能够提供稳定的、高效的生产抗原,开展种毒驯化试验。【方法】将重组禽流感病毒H7N9 H7-Re1株分别在MDCK细胞及悬浮MDCK细胞上增殖。在MDCK细胞上通过不同的病毒接种剂量、不同收获时间、不同TPCK-胰酶浓度的试验,确定了H7N9 H7-Re1株在MDCK细胞上最佳收获时间为64 h,最佳接毒剂量为0.008%或MOI为10^(-4),最佳TPCK-胰酶浓度为2μg·mL^(-1),根据确定的最佳培养条件连续传代,并对各代次病毒含量进行检测。【结果】在MDCK细胞上传至第5代时,HA可达1﹕256,每1 mL病毒含量达到10^(8.5)TCID50,每0.1 mL病毒含量达到10^(8.5)EID50,均高于其他代次。【结论】将第5代确定为MDCK细胞传代最佳代次,可考虑确定为生产用基础种毒代次。在悬浮MDCK细胞上对重组禽流感病毒传代进行了优化试验,确定了H7N9 H7-Re1株在悬浮MDCK细胞上最佳收获时间为48 h,最佳接毒剂量MOI为10^(-2),最佳TPCK-胰酶浓度为4—8μg·mL^(-1)。在实际疫苗生产过程中,可选择MDCK细胞或悬浮MDCK细胞来扩繁种毒。

基于Box-Behnken实验设计与响应面法优化禽流感疫苗生产工艺?

为优化基于MDCK细胞无血清悬浮培养生产禽流感病毒的工艺以提高禽流感病毒血凝素(HA)滴度,采用部分析因实验设计考察了病毒生产工艺中接毒时细胞密度、TPCK-胰酶浓度、培养温度、感染复数和病毒收获时间对病毒HA滴度的影响,确定了接毒时细胞密度、TPCK-胰酶浓度、和病毒收获时间作为影响病毒HA滴度的显著因子,并进一步采用3因素3水平的Box-Behnken实验设计和响应面法,对3个显著因子作用条件进行了优化,获得了最优的工艺条件。结果显示:当接毒时细胞密度为7.0×10~6 cells×m L^(-1)、TPCK-胰酶浓度为17 mg×L^(-1)、病毒收获时间为60 h时,病毒HA滴度最高可达10.85 log_2 HAU/25μL。以上研究结果为禽流感疫苗高效大规模工业化生产提供了有力的数据支持。