山苍子精油对柑橘意大利青霉的抑菌活性及作用机制

山苍子精油(Litsea cubeba essential oil,LCEO)具有安全性高、不产生抗药性和广谱抑菌活性等优点,作为一种天然抗菌材料引起了广泛关注。本研究目的是探讨LCEO对意大利青霉(Penicillium italicum)的抗菌活性及其机制。方法:测定LCEO对柑橘意大利青霉的最小抑菌质量浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)及其对菌丝生长抑制率、孢子萌发率、细胞成分释放、胞外pH值和电导率的影响,通过扫描电子显微镜(scanning electron microscope,SEM)观察LCEO处理后柑橘意大利青霉菌菌丝表面形态变化,采用碘化丙啶(propidium iodide,PI)染色法检测孢子细胞膜的完整性,并通过感染柑橘果实测定柑橘果实青霉病的发病率和病斑直径。结果表明:LCEO对意大利青霉的MIC为1.17 mg/mL,LCEO能显著抑制意大利青霉菌丝的生长和孢子的萌发,质量浓度1000 mg/L LCEO处理后菌丝生长抑制率和孢子萌发抑制率分别为(88.17±0.30)%与(97.78±0.30)%,随着LCEO质量浓度的增加,意大利青霉胞外电导率和胞外pH值逐渐增加,核酸泄漏严重。SEM观察发现,经LCEO处理后意大利青霉菌菌丝线性丧失,菌丝表面出现扭曲、皱缩和干瘪等不可逆形态变化,LCEO质量浓度越高,菌丝体的完整性和通透性受损越严重。PI染色实验结果显示,经LCEO处理后意大利青霉菌孢子的细胞膜完整性受到破坏。LCEO处理后柑橘果实发病率及其病斑直径较未处理显著降低(P<0.05),其中LCEO溶液质量浓度为4800 mg/L效果最佳。结论:LCEO能有效抑制意大利青霉菌在柑橘果实中的扩散,对柑橘青霉病菌具有较好的抑制效果。

蜂胶乙酸乙酯提取物对意大利青霉菌的抑制作用及稳定性研究

本实验以青霉属的意大利青霉菌(Penicillium italicum)为研究材料,研究蜂胶不同溶剂提取物对意大利青霉菌的抑制作用及其对温度和pH值的稳定性的影响。结果表明,乙酸乙酯提取物和乙醇提取物活性最高,氯仿提取物次之,石油醚提取物和水提取物活性最弱。提取物的抑菌活性与提取物中的黄酮含量和总酚呈显著正相关。乙酸乙酯提取物对意大利青霉的孢子萌发具有同样的抑制作用。蜂胶乙酸乙酯提取物溶液分别经过25、35、50、70、100℃的温度处理后其抑菌活性没有明显差异;在pH3.6～7.6的范围内,随着pH值的升高,提取物的抑菌活性先升高后降低,于pH5.2时抑制率最高,pH4.4时次之。这表明该蜂胶提取物能够有效的抑制意大利青霉的生长,在采后柑橘的防腐保鲜中具有良好的应用前景。

不同发育期椪柑精油对意大利青霉和指状青霉的抑制作用

对不同发育期(7、8、9和10月)的椪柑(CitrusreticulataBlanco)果皮精油进行GC-MS分析,共鉴定出柠檬烯(47.28%～58.40%)、γ-松油烯(8.27%～13.23%)、β-芳樟醇(3.48%～7.86%)、β-月桂烯(6.24%～7.50%)、α-蒎烯(5.07%～6.05%)、β-蒎烯(2.30%～3.45%)和辛醛(2.04%～2.48%)等50种萜烯类化合物。椪柑果皮精油及其所含的6种潜在抑菌组分(柠檬醛、辛醛、壬醛、癸醛、β-芳樟醇和α-松油醇)的体外抑菌实验结果表明:不同发育期椪柑果皮精油对意大利青霉(Penicillium italicum)的抑制作用要强于指状青霉(P.digitatum);潜在抑菌组分中柠檬醛和辛醛对意大利青霉的抑菌效果最好,壬醛和辛醛对指状青霉的抑菌效果最好。柠檬醛和辛醛对意大利青霉的最小抑菌浓度(MIC)、壬醛和辛醛对指状青霉的MIC均为0.50μL/mL;β-芳樟醇和α-松油醇对意大利青霉和指状青霉的MIC均为2.00μL/mL。

11种中草药提取物对柑橘意大利青霉抑菌活性及机理研究

对11种中草药醇提物抑制柑橘意大利青霉的抑菌效果进行筛选,选用抑菌效果最佳的桂枝提取物从其对病原菌的孢子萌发率、细胞膜渗透性、菌丝形态及菌体内含物含量的影响来进行抑菌机理的研究。结果表明:桂枝、桂皮和黄柏提取液的抑制圈直径均大于30 mm,具有较好的抑菌效果。其中桂枝的抑菌活性最佳,对意大利青霉的抑制圈直径为(34.57±0.78)mm,最小抑菌浓度(MIC)和最小杀菌浓度(MFC)分别为3.125和6.25 mg/mL,且抑菌效果显著优于化学杀菌剂百可得。在抑菌机理方面,桂枝提取物可以抑制意大利青霉菌孢子萌发,影响菌丝的生长发育,其抑菌作用主要是通过破坏细胞膜结构,增加菌体细胞膜通透性,使菌体内容物外渗从而影响菌丝正常生长代谢来实现的。桂枝提取物对柑橘青霉菌有较好的抑菌活性,可作为天然杀菌剂的来源。

费菜黄酮对柑橘意大利青霉菌抑制作用的研究

为研究费菜黄酮对意大利青霉的抑菌效果并揭示其抑菌机制,本试验采用损伤接种法接种意大利青霉至柑橘,观察0、0.3、0.6、1.2 mg·mL^-1费菜黄酮对柑橘青霉病的控制效果,探究其对意大利青霉细胞膜通透性、细胞成分释放、菌丝表面结构、菌丝丙二醛(MDA)和过氧化氢(H2O2)含量等指标的影响。结果表明,费菜黄酮能够显著抑制菌丝生长,1.75 mg·mL^-1浓度下的抑制率为75.82%,7.00 mg·mL^-1浓度下的抑制率达到100%。经费菜黄酮处理后,意大利青霉细胞膜通透性显著增加,糖类等胞内物质释放至细胞外;扫描电镜显示菌丝体结构遭到破坏,菌丝体表面出现褶皱、塌陷;同时引起H2O2和MDA含量增加;柑橘果实的发病率和病斑直径减小。本研究结果为天然杀菌剂的研制以及抑菌机制的后续研究提供了一定的理论依据。

柑橘采后病原菌意大利青霉creA基因的克隆及表达分析

为初步分析柑橘采后病原菌意大利青霉(Penicillium italicum)碳代谢调控因子CreA的功能,克隆到意大利青霉的creA基因。PicreA基因全长1236bp,无内含子,PiCreA蛋白由411个氨基酸组成,含有2个转录因子典型的锌指结构域。系统进化分析表明,PiCreA蛋白与扩展青霉(Penicillium expansum)亲缘性最高。采用荧光定量PCR方法,观察到PicreA基因面对不同碳源诱导具有不同的表达响应。对于单糖一般在短时间内诱导得到较高表达,随着时间延长,抑制碳源葡萄糖诱导PicreA呈现先下降再上升的趋势,推测发生了PicreA的自我抑制;而在去抑制碳源木糖环境中,PicreA的表达量略有下降并逐渐保持相当高的水平。对于非糖类的去抑制碳源乙醇,PicreA基本维持稳定的较高表达状态。PicreA基因在整个意大利青霉侵染柑橘过程中稳定表达。

β-蒎烯抑制柑橘意大利青霉作用机制初步研究

采用孢子萌发法和菌饼法评价β-蒎烯对意大利青霉菌的作用效果,分析β-蒎烯对病菌菌丝几丁质分布、菌丝活性氧代谢、排酸能力和麦角固醇含量的影响,并采用山梨醇、胆固醇或半胱氨酸作为保护剂探讨其对β-蒎烯抑制病菌孢子萌发的保护作用。结果显示,β-蒎烯对青霉菌表现出很强的抑菌活性,0.087～0.696mg/mL的β-蒎烯能有效抑制孢子萌发与菌丝生长;β-蒎烯处理改变菌丝细胞壁几丁质分配,促进活性氧积累,降低菌丝排酸活性,显著降低菌丝中麦角固醇含量;添加麦角固醇替代物胆固醇、渗透调节剂山梨醇以及活性氧清除剂半胱氨酸均能有效促进受0.348mg/mL β-蒎烯抑制的青霉菌孢子萌发和芽管伸长。这些结果说明,β-蒎烯发挥对意大利青霉的抑菌作用与损伤真菌细胞壁结构、促进活性氧积累和抑制膜脂组分麦角固醇增加有密切关系。

α-松油醇对意大利青霉的抑制作用

测定α-松油醇对意大利青霉菌丝体形态及菌丝体生长的影响,并对其抑菌机制进行初步探讨。结果表明:α-松油醇能明显抑制意大利青霉菌丝体生长,最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration,MIC)和最小杀菌浓度(minimal fungicidal concentration,MFC)分别为2.00μL/mL和8.00μL/mL;经MIC和MFCα-松油醇处理后,意大利青霉菌丝体胞外pH值、胞外电导率及260 nm条件下吸光度显著增加,总脂质含量有显著下降。提示α-松油醇能改变细胞膜的通透性、破坏细胞膜结构的完整性,导致胞内成分泄露,从而抑制意大利青霉菌丝体生长。

碳酸铵对意大利青霉的作用机制及对不同柑橘果实品质的影响

为了寻求一种安全有效的方法防治由意大利青霉(Penicillium italicum)引起的柑橘青霉病,该研究分析了碳酸铵抑制意大利青霉生长的可能作用机制及对脐橙、皇帝柑、沃柑3种不同类型柑橘贮藏品质的影响。结果表明,碳酸铵能抑制意大利青霉孢子萌发和菌丝生长,且呈现剂量依赖效应,在质量浓度分别为0.4和0.8 g/L时可完全抑制孢子萌发和菌丝生长。结构观察表明,碳酸铵引起菌丝生长节点稀疏和分支减少;超微结构观察发现菌丝严重皱缩,菌丝线粒体结构异常。生理生化分析表明,碳酸铵处理引起线粒体的钠/钾离子ATP酶(Na^(+)/K^(+)-ATPase)、钙离子ATP酶(Ca^(2+)-ATPase)和镁离子ATP酶(Mg^(2+)-ATPase)活性下降,导致还原型谷胱甘肽(Reduced Glutathione,GSH)含量及谷胱甘肽还原酶(Glutathione Reductase,GR)活性降低,活性氧清除体系超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase,SOD)、过氧化氢酶(Catalase,CAT)、过氧化物酶(Peroxidase,POD)活性紊乱,促进H_(2)O_(2)积累。添加活性氧清除剂半胱氨酸(Cysteine,Cys)能部分恢复碳酸铵处理的病菌孢子萌发。活体接种表明,16 g/L碳酸铵处理显著减小了柑橘果实接种意大利青霉的病斑直径(P<0.05),减轻果实发病。碳酸铵处理能降低3种类型柑橘果实自然发病率,且对果实失重率、色泽、可溶性固形物、可滴定酸、维生素C、还原糖含量无不良影响。结果表明,碳酸铵通过损伤意大利青霉菌丝线粒体结构和功能,促进活性氧积累来发挥抗真菌活性,可以作为杀菌剂的绿色有效替代品,研究结果可为碳酸铵防治柑橘果实采后腐烂提供参考。

柑橘采后病原菌意大利青霉PacC基因的克隆及表达分析

为初步分析柑橘采后病原菌意大利青霉(Penicillium italicum)pH信号传导途径中转录因子PacC的功能特性,克隆了PacC基因并对其进行生物信息学和表达模式分析。结果表明:PacC基因全长1921 bp,有1个内含子,编码蛋白质的氨基酸数量为636个,共包含3个转录因子典型的锌指蛋白结构域。进化树分析显示,PacC与指状青霉(Penicillium digitatum)和产黄青霉(Penicillium chrysogenum)亲缘关系较近。离体培养条件下PacC在意大利青霉生长中稳定表达;培养基pH影响意大利青霉生长与PacC表达,酸性条件下表达量显著下调(P<0.05),碱性条件下表达量显著上调(P<0.05);碳源条件影响该基因表达,葡萄糖饥饿和回补均显著提高PacC表达(P<0.05);低浓度蔗糖引起培养液pH碱化,显著刺激PacC表达(P<0.05),高浓度蔗糖引起培养液pH酸化,PacC表达逐渐下调(P<0.05)。活体结果表明,不同品种柑橘果实接种意大利青霉会导致果皮pH下降;接种初始pH影响意大利青霉的致病力,PacC在侵染柑橘果实期间表达较为稳定。这些结果表明,环境pH和碳源供应均能影响意大利青霉PacC表达,影响意大利青霉的致病性。

热水与赣南脐橙皮对意大利青霉孢子的致死作用

为验证热水处理赣南脐橙预防赣南脐橙青霉病害的有效性,对热水与脐橙皮共同处理对意大利青霉孢子致死作用进行了研究,以不加赣南脐橙皮的同样热水处理的意大利青霉孢子为对照,采用平板菌落计数法检测霉菌孢子死亡率;用蜗牛酶去除霉菌孢子壁制备原生质体,经Hoechst 33342/PI双荧光染色法染色,检测霉菌孢子细胞膜损伤程度。结果显示,55℃8 min处理组的霉菌孢子死亡率为(88±2.12)%,对照组霉菌孢子死亡率为(60±2.78)%;荧光染色结果显示热处理组有更多的原生质体细胞膜受到了破坏。试验结果说明,热水与赣南脐橙皮成分对意大利青霉孢子有协同抑杀作用。

柑橘采后青霉病原中寄生病毒的筛选与鉴定

【目的】从采后霉烂柑橘上分离青霉病原菌,并筛选和鉴定病原中寄生的青霉病毒。【方法】以柑橘园腐烂的柑橘为材料,挑取分生孢子在PDA培养基上进行划线分离,根据总基因组电泳图谱筛选具有基因组额外核酸片段的病毒菌株,并使用RT-PCR扩增额外片段测序鉴定相应病毒。【结果】根据菌落形态初步分组,分离到两类菌落特征差异明显的青霉菌(共25株),其中具灰绿色菌落的青霉16株,具暗黄绿色菌落的青霉9株。扩增两类青霉的代表菌株(DY10和DY18)的ITS并测序,鉴定结果显示,DY10和DY18分别为意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(P.digitatum)。青霉菌株总基因组电泳筛选发现,DY9、DY11、DY12、DY17菌株中存在约6000 bp的基因组额外片段,推测可能为指状青霉病毒1 (PdV1)同种不同病毒株的基因组。根据PdV1基因组设计特异性引物,RT-PCR扩增出约500 bp的条带,测序序列与PdV1基因组同源序列的一致性高达99.7%,将所分离的病毒鉴定为PdV1同种的不同病毒株。【结论】本研究从腐烂柑橘上分离鉴定意大利青霉16株和指状青霉9株,并从指状青霉菌株中筛选和鉴定出4株与维多利亚病毒属(Victorivirus) PdV1同种的不同病毒株,为柑橘绿霉病的绿色防控提供潜在的生防病毒资源。

碳酸铵和碳酸氢铵对柑橘青霉病的抑制作用

以引起柑橘采后青霉病的意大利青霉（Penicilium italicum）为研究对象，采用体外试验和体内试验测定碳酸铵和碳酸氢铵对病菌的抑菌活性。结果表明： 碳酸铵和碳酸氢铵对意大利青霉孢子萌发和菌丝体生长均有显著抑制作用； 当碳酸铵和碳酸氢铵的质量分数分别为0.32%和0.36%时， 2种铵盐均可以完全抑制意大利青霉的孢子萌发； 当2种铵盐溶液分别经过4～100℃范围内的不同温度处理一定时间后,仍能表现出良好的抑菌活性； 碳酸铵和碳酸氢铵在中性及偏碱性的环境中有利于抑菌活性的发挥。接种和自然贮藏试验结果表明， 质量分数为0.80%的碳酸铵和碳酸氢铵溶液可以显著降低接种意大利青霉的柑橘果实和自然贮藏条件下柑橘果实青霉病的发病率。

拮抗柑桔致病菌的放线菌筛选及其活性物质分析

为筛选出防治柑桔病害的菌株,以柑桔果实采后危害最大的病原意大利青霉为指示病原菌,利用平板梯度稀释法从土壤中分离出具有拮抗作用的放线菌,通过形态学观察和16S rDNA测序鉴定该菌株,进一步对该菌株所产抑菌活性物质的稳定性分析。结果表明,从土壤中筛选获得对意大利青霉菌的抑菌圈直径达到(16.69±1.74)mm的浑圆链霉菌菌株tz13,菌株tz13所产抑菌活性物质对温度、紫外线、酸和弱碱都有较强的耐受性,同时对引起柑桔果实采后另一种重要病原微生物——指状青霉及其他植物病原真菌(辣椒疫病菌、西瓜枯萎病菌、水稻纹枯病菌和烟草黑胫病菌)具有抑制作用。菌株tz13在防治柑桔病害方面具有商用开发价值。

柑橘青霉病防治的研究进展

柑橘青霉病是柑橘采后在储藏和运输工程中的重要病害,可造成巨大的经济损失,主要由意大利青霉(Penicillium italicum)和指状青霉(P. digitatum)引起。为了更有效地预防和控制柑橘青霉病的发生和发展,为柑橘的运输和保存工作提供科学依据,本文归纳了柑橘青霉病的物理、化学和生物防治方法所采用的主要技术手段和制剂,分析并总结了不同防治措施的优缺点,提出了柑橘青霉病防治后续研究的方向及策略。指出深入探究柑橘青霉病菌的致病机制和生物源制剂对柑橘青霉病的防控机理,推进生物防治方法与化学或物理防治方法联用,能为新型药剂的开发和建立良好的综合防治管理策略奠定基础。

白薇生物碱类成分抑制柑橘采后青霉病菌活性

【目的】探究白薇抑制柑橘采后青霉病菌——意大利青霉活性部位的化学成分。【方法】采用抑菌活性靶向分离、溶剂萃取、各种柱层析及制备液相色谱分离单体化合物,核磁共振(NMR)和高分辨离子肼质谱(HR-IT-TOF-MS)鉴定分离的化合物。【结果】白薇乙酸乙酯(CAE)和正丁醇(CAB)萃取物有抑菌活性,正丁醇萃取物抑菌活性最强,大孔树脂进一步分离富集抑菌活性,CAB-C2为白薇抑菌活性部位,质量浓度为0.625 mg·mL-1时其抑菌圈直径达到16.25 mm。采用各种柱层析及制备液相色谱技术从活性部位中分离出5个单体化合物,经NMR和MS鉴定为10β-N-氧化-7-脱甲氧基娃儿滕碱(1)、9-脱氢安托芬(2)、9,14-脱氢安托芬(3)、14羟基-N-氧化-7-脱甲氧基娃儿滕碱(4)、10α-N-氧化-7-脱甲氧基娃儿滕碱(5)。【结论】5种生物碱类活性成分均为首次从白薇中分离鉴定,生物碱类成分为白薇抑制柑橘采后青霉病菌的主要活性成分。

贮运期苹果青霉病识别与安全防治

苹果青霉病病菌主要是扩展青霉(Penicillium expansum (Link)Thom)和意大利青霉Penicillium italicum Wehmer.,属半知菌类真菌。青霉病病源菌通过气流和接触进行传播,主要从伤口侵入,少量通过果柄和萼凹处侵入,极少经果实皮孔侵入。病斑表面初为白色,空气潮湿时,后变青绿色。病斑表面覆盖粉状物是病菌的分生孢子梗及孢子,易随气流吹散,腐烂后果肉发出特殊的霉味。

桂枝抑制柑橘采后两种病原菌活性物质研究

从中草药提取物中筛选对引起柑橘采后主要病害的两株真菌---意大利青霉（ Penicillium italicum）和指状青霉（ Penicillium digitatum）有抑菌活性的中草药；采用溶剂萃取和硅胶柱色谱对具有较好抑菌活性的中草药提取物进一步分离纯化，确定其抑菌活性物质。结果表明：桂枝、桂皮、细辛、香薷、牡丹皮和青蒿6种提取物对这两株真菌均有较好的抑菌效果，抑菌圈直径均达20 mm以上。其中桂枝、桂皮和细辛的抗菌活性物质主要存在于乙酸乙酯部位，且桂枝的抑菌活性最强，对意大利青霉和指状青霉的抑菌圈直径分别为34．57 mm和31．56 mm，最低抑菌浓度（minimal inhibitory concentration，MIC）分别为3．125 mg/mL和6．25 mg/mL；最小杀菌浓度（ minimal fungicidal concentration ，MFC）分别为6．25 mg/mL和12．5 mg/mL。桂枝乙酸乙酯萃取物对意大利青霉和指状青霉的抑菌圈直径分别为45．33 mm和40．53 mm；采用硅胶柱色谱对桂枝乙酸乙酯萃取物进行分离，得到4个流分（ Fr．1～Fr．4）。抑菌活性测试表明Fr．1活性最强，通过HPLC对Fr．1的化学成分进行分析，发现其主要抑菌成分为桂皮醛。

凤仙透骨草中抑菌活性物质提取工艺研究

以意大利青霉做指示菌,以抑菌圈直径为活性追踪指标,在单因素实验的基础上通过二次回归正交旋转组合设计进行凤仙透骨草中抑菌活性物质的提取工艺参数优化。结果表明:最佳提取工艺条件为φ(乙醇)=96.8%,溶剂倍数10倍,提取温度50℃,提取时间3 h,在此优化条件下抑菌圈直径为36.95 mm。各因素对凤仙透骨草提取物抑菌效果的影响由大到小依次为:乙醇浓度,溶剂倍数,提取时间,提取温度。

两株柑橘采后致病真菌的分离及生物学特性研究

从自然发病的宫川果实表面分离得到两株致病真菌(PD和PI).致病力检测结果显示,接种PD菌的柑橘果实发病到全部腐烂需7d,而接种PI菌的柑橘果实发病到全部腐烂则需13d.形态学特征比较得知,PD和PI分别为指状青霉(Penicillium digitatum)和意大利青霉(P.italicum).基础生物学特性结果表明,PD的致死温度为70℃,菌丝体生长最适温度为25℃,最适pH 7.0;PI的致死温度为80℃,菌丝体生长的最适温度为20℃,最适pH 10.0.