基于真核CMV启动子构建猪瘟病毒感染性cDNA克隆与病毒拯救

为建立猪瘟病毒(CSFV)反向遗传操作系统,本研究将CSFV石门株(SM)全基因组克隆至pBAC11载体中,并采用重叠延伸PCR方法在病毒基因组5'端和3'端分别加入CMV真核启动子序列和RzBGH序列,并将其基因组nt2809的碱基C突变为T,将原有的AfeⅠ酶切位点突变消失作为拯救病毒的遗传标记。将构建的质粒转染PK-15细胞培养后,收集细胞上清盲传3代后通过RT-PCR扩增蛋白编码基因,并经间接免疫荧光试验(IFA)鉴定。RT-PCR鉴定结果显示扩增到CSFV特异性基因;IFA结果显示接种病毒的细胞出现绿色荧光。表明病毒拯救成功,将其命名为BAC-rSM。将BAC-rSM株在PK-15细胞中连续传18代,将第18代病毒经RT-PCR扩增E2基因,并对遗传标记的位点经Afe I酶切和鉴定,分析BAC-rSM病毒的遗传稳定性,结果显示第18代BAC-rSM株遗传标记稳定存在,表明拯救的病毒具有遗传稳定性。将BAC-rSM和SM株病毒分别以MOI 1感染PK-15细胞,在感染后不同时间点收获病毒并测定病毒滴度,结果显示BAC-rSM和SM株生长动力学特征基本一致。对第18代BAC-rSM株与SM株进行全基因组序列比对分析,利用在线软件npsa-prabi.ibcp.fr/对Erns和E2蛋白二级结构预测,采用荧光定量PCR(qPCR)对BAC-rSM和SM株感染PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平。全基因测序比对分析结果显示,BAC-rSM株基因组共存在46个碱基突变,经预测其Erns和E2的突变导致各自的二级结构改变;qPCR检测结果显示,相对SM感染的PK-15细胞,BAC-rSM感染后8 h和24 h PK-15细胞中IFN-βmRNA的转录水平显著或极显著降低(P<0.05、P<0.01)。本研究建立了一种简单、操作方便的CSFV反向遗传操作系统的方法,为进一步开展CSFV的分子生物学、毒力决定因素、分子发病机制、疫苗开发和病毒与宿主相互作用的研究提供了新的技术方法。

猪圆环病毒2型感染性克隆的构建及拯救病毒的双抗体夹心ELISA鉴定

旨在构建猪圆环病毒2型(PCV2)感染性克隆,并利用双抗体夹心ELISA对拯救病毒进行鉴定。通过PCR从阳性病料中扩增出PCV2两种基因型2b与2d的全基因组DNA,并分别克隆入pMD-19T载体,获得2个重组质粒,命名为p19T-PCV2b与p19T-PCV2d。利用SacⅡ酶切获得l 767 bp的PCV2全基因组,并在体外分别用T4连接酶连接而环化,将环状基因组转染至PK-15细胞,传至P6代,利用间接免疫荧光试验(IFA)对拯救病毒进行鉴定,结果表明PCV2b与PCV2d感染性克隆可拯救出病毒。利用PCV2单克隆抗体(单抗)作为捕获抗体,用辣根过氧化酶(HRP)标记的PCV2多抗作为检测抗体,建立检测PCV2病毒粒子的双抗体夹心ELISA方法,用于PCV2拯救病毒的鉴定。将该检测方法与IFA和半数组织细胞感染量(TCID_(50))结果进行对比分析,结果显示,ELISA检测值与Image-J所计算的IFA荧光强度及TCID_(50)的相关系数分别达到0.7和0.8以上,说明该方法与IFA及TCID_(50)检测结果均具有较强的一致性,可以用于PCV2拯救病毒的快速鉴定。

猪圆环病毒2型感染性克隆构建

基于PCV2滚环复制原理,在分析PCV2不同基因亚型代表毒株基因组结构和序列的基础上,设计2对引物用于PCR扩增PCV2基因组序列。以从收集到的疑似PCV2感染的10份猪血清样品中提取的DNA为模板,用设计的引物扩增目的片段,并进行测序分析,1株为PCV2a型,4株为PCV2b型,5株为PCV2d型。每种基因型毒株中各选取一个样本,利用上述2对引物进行PCR扩增,并将扩增产物克隆至pEASY-Blunt simple载体中,通过双酶切连接2个PCR片段,构建含有约1500 bp重叠序列的PCV2基因组的质粒。通过脂质体转染法将含PCV2全基因组的质粒转染至PK-15细胞进行病毒拯救,经PCR和IFA两种方法验证,证明成功拯救出3个基因型的PCV2毒株。通过对PCV2全基因组结构及序列分析,该方法同样适用于PCV2g、PCV2h基因型病毒的感染性克隆构建。本研究建立了一种基于反向遗传学技术的PCV2感染性克隆的构建方法,为开展PCV2的病原学研究提供了技术支持。

流行性乙型脑炎病毒(JEV)全长感染性克隆的制备及恢复病毒的获得

根据JEV病毒减毒株SA14-14-2基因组序列,设计覆盖全长的4对重叠引物,以提取的活疫苗病毒RNA为模板,RT-PCR扩增出4个片段,并克隆到质粒载体中,进一步构建两个半端分子克隆,然后将全长cDNA序列克隆到一个新改造的低拷贝质粒载体pBR-kpn中,构建我国流行性乙型脑炎病毒(JEV)基因组全长cDNA克隆。经过体外转录后得到的转录子转染BHK-21细胞,重新获得JEV的恢复病毒,通过生物学特性、分子生物学水平、蛋白水平等几个方面对恢复病毒进行鉴定。结果获得了稳定的全长cDNA克隆,转录子转染BHK-21细胞后,第4天开始出现细胞病变(CPE),第6～7天时CPE为 ,经过Vero细胞进一步放大培养后,间接免疫荧光实验和RT-PCR实验均为阳性。证实了构建的JEV的全长cDNA克隆有感染性,为进一步的研究奠定了基础。

猪瘟病毒C株全长cDNA感染性克隆的构建及病毒拯救

【目的】建立猪瘟病毒研究技术平台,为进一步研究猪瘟病毒C株在细胞中的增殖机制及猪瘟病毒标记疫苗奠定基础。【方法】本试验以猪瘟病毒C株为研究材料,经RT-PCR扩增获得涵盖全长的6个片段,用合适的酶切位点连接,成功构建了C株全长感染性克隆pAC-CS。体外转录得到RNA,然后将其分别转染BHK-21和SK6细胞。拯救的病毒通过上清传代(常规病毒传代)和带毒细胞传毒繁殖。【结果】通过RT-PCR、免疫过氧化酶单层细胞试验和兔体发热试验检测,表明病毒拯救成功。经比较以电转的方式转染SK6的效果较好。通过带毒细胞传代,至12代时病毒滴度稳定达104TCID50.mL-1,而上清传代至第3代时用免疫过氧化酶单层细胞试验(IPMA)不能检测出病毒。【结论】成功构建了猪瘟病毒C株感染性克隆;拯救C株时以SK6细胞电转较好;带毒细胞传代培养C株有利于获得较高滴度的病毒。

J亚群白血病病毒NX0101株感染性克隆化病毒的构建及其致病性

采用PCR方法分3段扩增出J亚群白血病病毒NX0 10 1株的前病毒cDNA ,PCR产物经克隆后顺次连接,获得一个含有完整ALV J前病毒cDNA的重组质粒,命名为pALV J NX。将此质粒DNA纯化后转染鸡胚成纤维细胞,以针对ALV J的单克隆抗体JE9对转染后的细胞作间接免疫荧光反应,证明获得了具有感染性的病毒。测定原始野毒和分子克隆化病毒的半数组织感染量(TCID50 ) ,分别人工接种1日龄商品代肉鸡并隔离饲养17周。接种野毒组死亡率为2 6 % ,髓细胞瘤发病率为2 4 %。接种分子克隆化病毒组死亡率为2 2 % ,髓细胞瘤发病率为2 2 %。结果表明。

猪瘟病毒低温诱变疫苗Thiverval株感染性克隆的构建及病毒拯救

采用高保真DNA聚合酶,分7个片段扩增猪瘟病毒(CSFV)Thiverval株全基因组序列,克隆至pMD18-T载体并测序。经适当的连接策略将各片段连接克隆至低拷贝载体质粒pAC/F101,同时对病毒基因组5′和3′末端进行修饰,构建出含有T7启动子、榔头状(HH)核酶基因、CSFV Thiverval全基因组、丁型肝炎病毒(HDV)核酶基因和T7终止子的重组质粒pAC/F101/T1-7。利用T7 RNA聚合酶将线性化重组质粒pAC/F101/T1-7体外转录成基因组RNA,再使用脂质体转染将体外转录RNA转染PK-15细胞。通过传代、RT-PCR、免疫过氧化物酶细胞单层试验鉴定,表明成功的从感染性克隆拯救出活病毒粒子。猪瘟病毒低温诱变疫苗"Thiverval"株感染性克隆的构建及病毒的成功拯救,为进一步研究CSFV疫苗株的致弱机制提供了重要工具。

嵌合猪圆环病毒PCV2-1感染性克隆的构建

根据GenBank中发表的猪圆环病毒(porcine circovirus,PCV)的核苷酸序列,设计3对特异性引物。通过PCR方法,以引物P1和P2从接毒细胞中扩增到猪型圆环病毒(PCV2)全基因组,克隆入pBluescriptⅡ SK(+)载体构建质粒SK-PCV2,以之为模板,用引物P5和P6扩增不包含PCV2-ORF2的部分基因(SK-PCV2△ORF2);另一对引物P3、P4用于特异性扩增猪型圆环病毒(PCV1)的ORF2基因,与前面得到的SK-PCV2△ORF2基因连接,构建嵌合型质粒SK-PCV2-1,以此为基础构建双联体质粒SK-PCV2-1(DB)。体外转染PK-15细胞,盲传4代后,用RT-PCR和间接免疫荧光方法检测,结果表明本试验构建的嵌合病毒PCV2-1克隆具有感染性。

肠道病毒71型(EV71)感染性克隆的构建

目的构建肠道病毒71(enterovrius 71,EV71)的感染性克隆,为研究EV71毒力基因及新型疫苗设计等建立一个技术平台。方法用RT-PCR方法扩增出EV71FJ08149株全基因组,通过TA克隆组装进TOPO-XL-PCR载体中,获得全长cDNA克隆pFJ08149T5和pFJ08149T25。应用T7聚合酶系统在体外将线性化后全长cDNA克隆转录出RNA并转染RD细胞。通过间接免疫荧光试验、RT-PCR、序列测定及免疫电镜等对拯救病毒进行鉴定。结果 RNA转染后72h观察到典型的肠道病毒致细胞病变,拯救病毒经RT-PCR、间接免疫荧光和免疫电镜检测鉴定为EV71型,表明已成功构建了EV71感染性克隆。结论本研究成功构建出具有感染性的EV71全长cDNA克隆,为深入研究EV71的致病机制等提供了有利的工具。

猪圆环病毒1型感染性克隆的构建与病毒拯救

用PCR法扩增猪圆环病毒1型(PCV1)全长基因组,将2个基因组顺式连接插入到pUC19质粒载体中构建感染性分子克隆。通过引物设计替换碱基,在病毒基因组内插入SalⅠ酶切位点作为分子靶标,拯救出带有分子标记的克隆病毒,命名为recPCV1/G株。通过免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)在病毒感染细胞中检出病毒抗原,其抗原性仅与PCV1/Cap蛋白单价特异性抗体发生反应,而与抗PCV2/Cap蛋白抗体无交叉。克隆毒株基因组内插入一个SalⅠ酶切位点,可用PCR结合限制性片段长度多态性分析法(PCR-RFLP)与亲本病毒相鉴别。该毒株经细胞连续传10代,体外培养增殖性能稳定,病毒滴度达104.8 TCID50/mL。构建的PCV1感染性克隆,为今后开展该病毒的起源与演化、遗传变异规律、分子鉴别诊断等研究奠定了基础。

猪圆环病毒2型不同基因型毒株感染性克隆的构建及拯救毒株的体外生物学特性

【目的】中国猪群中猪圆环病毒2型(PCV2)感染存在不同基因型毒株(PCV2a、PCV2b和PCV2d),有必要阐明不同基因型PCV2毒株的致病性差异。【方法】采用感染性克隆技术构建了不同基因型代表性毒株,对拯救的毒株进行体外生物学特性试验。【结果】构建了4个不同基因型的PCV2感染性分子克隆,经转化细胞后拯救4个克隆毒株,经核酸序列分析、病毒形态学观察、免疫过氧化物酶单层细胞试验(IPMA)等证实属于不同基因型的PCV2毒株;拯救的毒株均通过细胞连续传10代,病毒增殖能力稳定,毒价均可达到105.0TCID50.mL-1;用具有中和病毒活性的单克隆抗体(1D2株)进行抗原捕获ELISA检测,拯救的PCV2a/rCL毒株与该单抗产生特异性反应,另3个克隆毒株(PCV2b/rYJ、rJF和PCV2d/rBDH)与该单抗均无反应,表明不同基因型代表毒株抗原性不同。【结论】中国猪群中PCV2流行毒株基因组及ORF2长度存在差异,其病毒抗原特性不同,构建和拯救了4个代表不同基因型PCV2克隆毒株,为进一步研究其致病性差异奠定了基础。

3种亚群PCV-2感染性克隆的构建及体内外感染性

通过PCR扩增出猪圆环病毒2(PCV-2)3个亚群(1A、1B、1C)毒株的全基因组DNA序列,并分别克隆入pMD-18T载体,获得含有PCV-2全基因组的3个重组质粒,分别命名为RP8(1A)、P0(1B)和P4-1(1C)。将3个重组质粒分别用SacⅡ切出l 767 bp的PCV-2全基因组,并在体外分别用T4连接酶连接而环化。用脂质体将3种自身环化的基因组转染无PCV-1污染的PK-15细胞,并按常规病毒培养方法分别传代,第5代细胞培养物分别用间接免疫荧光试验(IFA)及PCR方法检测转染的细胞,检测结果均为阳性,说明已获得PCV-2共3个亚群1A、1B、1C的感染性克隆。用1A、1B、1C感染性克隆的第5代细胞培养物分别接种小鼠,可在接种小鼠的血液中分别检测到相应PCV-2亚型的基因组DNA,表明本试验构建的自身环化的1A、1B、1C亚型的PCV-2的全基因组DNA在体内、体外均具有感染性。

鸡传染性支气管炎病毒H120疫苗株全长cDNA感染性克隆的构建

根据鸡传染性支气管炎病毒(IBV)H120疫苗株的全基因组序列设计引物,采用RT-PCR方法对其基因组分10个片段进行扩增,并克隆至pMD19-T载体中进行测序。经BsaⅠ限制性内切酶酶切后,采用优化的连接策略将各DNA片段进行连接,获取H120株的基因组全长cDNA,其5′端具有完整的T7RNA聚合酶启动子的核心序列,3′端具有polyA尾巴结构。通过T7RNA聚合酶体外转录系统合成病毒基因组RNA,转染BHK-21细胞并进行病毒拯救。采用RT-PCR、测序及鸡胚传代对拯救出的病毒株进行鉴定。结果表明成功地从H120株的基因组全长cDNA拯救出病毒H120-R株,为进一步开展该病毒的分子致病机理研究、新型疫苗的研制等奠定了基础。

RNA病毒感染性克隆的构建原理及应用

构建RNA病毒感染性克隆是对RNA病毒实施反向遗传操作技术的前提和基础,本文综述了RNA病毒感染性克隆的构建原理、方法及应用。

感染性马传染性贫血病毒嵌合克隆的构建

在已有的全长感染性克隆pFD3的基础上,构建了新的低拷贝的全长克隆pLGFD3-8。按照疫苗制备过程中env基因的变化情况,采用基因替换和定点突变的方法,构建了一系列具有马传染性贫血病毒(EIAV)强毒株env基因及其主要突变特征的嵌合克隆。利用这些克隆转染FDD细胞,并用逆转录酶活性检测和PCR方法确定其感染性。结果发现,在FDD细胞中传代3次后,可在细胞培养物中检测到逆转录酶活性和原病毒DNA的存在,在电镜下可以观察到典型的EIAV病毒颗粒。这一结果为进一步研究马传染性贫血病毒致病的分子机制和免疫保护机理奠定了良好的基础。

1株髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒感染性克隆的构建与病毒拯救

为构建髓细胞瘤型J亚群禽白血病病毒(avian leukosis virus,ALV-J)SCGS-1株前病毒cDNA分子标记感染性克隆,根据SCGS-1全基因测序结果,分3段进行全序列PCR扩增,顺次连接至pUC19,构建SCGS-1株前病毒cDNA感染性克隆pUC-SCGS;通过重叠PCR方法对SCGS-1基因组进行沉默突变,在4 684位点引入SalⅠ位点,构建SCGS-1株分子标记感染性克隆pUC-△SCGS;以pUC-SCGS和pUC-△SCGS重组质粒转染CEF进行病毒拯救,并通过PCR、间接免疫荧光与双抗体夹心ELISA进行拯救病毒检测。结果显示,成功构建pUC-SCGS与pUC-△SCGS重组质粒,转染后盲传第3代、第4代细胞与上清中均检测到拯救病毒;间接免疫荧光与抗原ELISA方法分别在CEF细胞和上清中检测到ALV-J抗原。成功拯救获得分子标记ALV-J。

以BAC为基础的疱疹病毒感染性克隆技术

疱疹病毒(HPVs)庞大而复杂的基因组以及使用常规的在真核细胞中的重组操作技术一直使得HPVs的遗传分析颇具挑战性。近几年发展起来的以细菌人工染色体(BAC)为基础的HPVs全长感染性克隆是全新的技术,它允许HPVs基因组以BAC质粒的形式在大肠杆菌中保存、增殖和遗传修饰。与在真核细胞中相比,在大肠杆菌中操作的重组技术具有更快速、安全而有效的优点。BAC质粒转染真核细胞可重建子代病毒,从而促进了在整个基因组中对HPVs基因功能的研究。以EB病毒为例,介绍了基于BAC的HPVs基因组感染性克隆技术的原理、建立和突变方法,并讨论了该技术的应用前景。

PRRSV XH-GD株Nsp2部分缺失感染性克隆的构建

为研究Nsp2编码区不同区域缺失对病毒体外复制的影响,本研究在猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)XH-GD株反向遗传操作平台的基础上构建了pOK-AaBCD、pOK-AbBCD、pOK-AcBCD等3种Nsp2编码区部分缺失的感染性重组质粒。将这3种感染性质粒分别转染Marc-145细胞进行不同Nsp2缺失株的病毒拯救,结果显示,只有在Nsp2编码区缺失105个氨基酸的缺失株XH-GD-Δ105能够在Marc-145细胞中增殖,表明这一缺失区域为病毒复制的非必需,而其他两种感染性质粒则未拯救出相应的缺失重组病毒。本研究为进一步研究Nsp2的基因序列的缺失与PRRSV毒力之间的关系奠定了基础。

PRRSV强弱病毒株嵌合感染性克隆的构建及鉴定

为构建高致病性猪繁殖与呼吸综合征病毒(HP-PRRSV)与致弱PRRSV的重组病毒,本研究在PRRSV致弱株APRRS的全长感染性克隆pAPRRS与HP-PRRSV感染性克隆pJX143的基础上,利用SOE-PCR技术将强弱毒的nsp2区域进行互换,构建了nsp2基因替换的强弱毒PRRSV嵌合感染性克隆。将构建的嵌合克隆转染MA104细胞,4 d后观察到典型的细胞病变。通过RT-PCR和间接免疫荧光证明获得了强弱病毒株之间nsp2基因互换的嵌合病毒。这些嵌合病毒的构建和相应反向遗传操作平台的建立,为进一步研究HP-PRRSV的致病机制及相关疫苗的研发奠定了基础。

正链RNA病毒基因组感染性克隆研究进展

综合叙述了构建正链RNA病毒基因组全长感染性cDNA克隆的基本思路和关键技术 ,并总结了影响基因组全长克隆感染性的因素 还简要介绍了利用正链RNA病毒基因组感染性克隆所取得的一些研究进展 。