应用荧光实时定量PCR方法检测重组慢病毒滴度及其感染效率

慢病毒载体已经广泛应用于动物模型中基因治疗的研究和转基因动物的制备,而准确地测定重组慢病毒的滴度和感染效率是其关键步骤.通过荧光实时定量PCR的方法定量分析重组慢病毒的颗粒数以及病毒的活性滴度,并以GFP报告基因的方法作为对照来验证定量PCR方法的准确性.研究结果显示,应用荧光实时定量PCR法与GFP报告基因法测定得到的病毒活性滴度成正相关,而且前者可以更加准确地测定病毒滴度和病毒感染效率.

人脐带间充质干细胞在3种不同培养体系中的生长状况及腺病毒感染效率

背景：目前所报道的脐带间充质干细胞体外培养条件及培养效率不尽相同,尚缺乏统一标准。而且由于不同来源的间充质干细胞生物学特征尚有一定差异,因此建立脐带间充质干细胞简便、高效的培养体系十分必要。目的：观察人脐带来源的间充质干细胞在体外不同培养体系中的生长状态,以及不同腺病毒感染的效率。方法：采用胶原酶消化法从正常足月新生儿脐带中分离出间充质干细胞,贴壁法纯化培养,细胞贴壁后利用低糖DMEM,MesenPRO RSTM Medium和STEMPRO MSC SFM这3种培养体系进行体外扩增。取对数生长期的第3~5脐带间充质干细胞,应用腺病毒Ad5-EGFP,Ad5/11-EGFP,Ad5/35-EGFP分别以感染复数=1,10,100进行感染,分别于感染后24,56,72h倒置荧光显微镜观察病毒感染及绿色荧光表达情况。结果与结论：使用低糖DMEM培养的细胞初期融合时间长,STEMPRO MSC SFM培养的细胞虽然连接紧密,但消化传代后不易贴壁,而MesenPRO RSTM Medium培养的细胞在相同时间内能达到较高的细胞密度,更适于脐带间充质干细胞的体外扩增。Ad5/35-EGFP感染脐带间充质干细胞的效率明显高于其他两种腺病毒,但可导致细胞凋亡;腺病毒Ad5/11-EGFP对脐带间充质干细胞的感染效率较佳,随着感染复数的升高,所表达的荧光强度也逐渐增大。

CAR的表达调节对肝癌基因治疗中腺病毒载体感染效率的影响

目的:通过抑制Raf-MEK-ERK信号转导途径调节肝癌细胞表面柯萨奇病毒和腺病毒受体(coxsackie-adenovirus receptor,CAR)的表达,探索肝癌基因治疗中CAR表达与腺病毒(adenovirus,Ad)感染效率之间的关系。方法:选择两株人肝癌细胞株SMMC-7721及HepG2,以Raf-MEK-ERK信号转导抑制剂U0126作用后,应用Western blotting检测细胞表面CAR蛋白的表达水平。选用能表达GFP的非复制型E_1A缺陷的Ad感染人肝癌细胞SMMC-7721及HepG_2,应用FACS分析U0126处理前后Ad感染效率的变化。结果:细胞经MEK抑制剂U0126处理后,细胞膜表面CAR的表达呈明显上调趋势。FACS检测显示,经U0126处理后,在相同感染复数(10 MOI)Ad-GFP的感染下,GFP^+细胞率明显升高,SMMC-7721细胞由(71.65±6.21)%上升至(86.54±5.70)%;HepG_2细胞由(77.53±4.62)%上升至(87.06±2.83)%(均P<0.05)。结论:抑制剂U0126抑制Raf-MEK-ERK信号转导途径后,可上调肝癌细胞膜表面CAR的表达,从而导致Ad在肝癌细胞感染效率的提高。

重组腺病毒Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系感染效率的比较研究

目的以Ad5-GFP及Ad5/F35-GFP为对照,评价Ad5/F11p-GFP对不同肿瘤细胞系的感染效率。方法制备并纯化Ad5-GFP、Ad5/F11p-GFP及Ad5/F35-GFP三种重组腺病毒,以不同的感染复数(MOI)感染乳腺癌细胞系SKBR-3、MCF-7及肾癌细胞系786O。48 h后,荧光显微镜观察GFP的表达,流式细胞仪检测感染效率及不同细胞表面柯萨奇腺病毒受体(CAR)、CD46和桥粒芯糖蛋白质2的表达。结果 Ad5/F35-GFP对SKBR-3、MCF-7及786O均具有很高的感染效率,且其在较低的MOI时就具有较高的感染效率;Ad5/F11p-GFP对CD46高表达的MCF-7及786O具有较高的感染效率,5 MOI感染即可达到60%以上的感染效率;而Ad5-GFP仅对CAR高表达的细胞系786O具有较高的感染效率,且感染效率随着MOI的增加而升高。Ad5/F11p-GFP和Ad5/F35-GFP对三种肿瘤细胞系的感染效率明显高于Ad5-GFP。结论对5型腺病毒进行纤维顶球的改造,可增强对肿瘤细胞的感染效率。

提高树突状细胞腺病毒感染效率的融合蛋白的表达及活性鉴定

目的构建表达靶向树突状细胞融合蛋白CT40L的原核表达载体,在大肠杆菌中表达,并对CT40L融合蛋白进行纯化鉴定及功能验证。方法从GenBank上查找柯萨奇病毒和腺病毒受体(CAR)、T4噬菌体fibritin和小鼠CD40L的基因序列,并将其主要功能区域连接形成拼接序列;序列进行原核表达密码子优化后将其克隆至原核表达载体pET42a(+),构建重组表达载体pET42a-CT40L,并将该载体转化大肠杆菌BL21(DE3),经IPTG诱导表达CT40L/GST融合蛋白,并采用GST琼脂糖凝胶纯化重组蛋白。纯化后的重组蛋白经Western blot法、间接ELISA鉴定其免疫活性。结果重组表达载体经NcoⅠ和EcoRⅠ酶切鉴定正确;IPTG诱导后经SDS-PAGE分析表明获得了相对分子质量(Mr)78 000大小的重组蛋白;纯化后的蛋白纯度达到90%。Western blot法和ELISA检测证实纯化的CT40L分子能够与特异性抗体及相应受体发生反应,表明该融合蛋白具有良好的免疫学活性。结论成功构建了原核表达载体pET42a-CT40L,利用大肠杆菌表达系统实现了融合分子的可溶性表达,纯化后CT40L融合蛋白经检测具备较高的免疫学活性。

人SPK1基因的重组腺病毒载体感染效率及表达特性研究

目的研究重组腺病毒载体感染小鼠神经瘤细胞(N2a)的感染效率及重组腺病毒介导的人鞘氨醇激酶-1(sphingosine kinase-1,SPK1)基因在N2a细胞表达特性。方法用流式细胞仪检测感染效率,用激光共聚焦显微镜观察绿色荧光蛋白的表达;用Western blot方法检测SPK1蛋白的表达。结果 N2a细胞的感染效率和绿色荧光蛋白表达量在一定范围内随着病毒感染复数(Multiplicity of infection,MOI)的增加而增高,MOI为100时感染效率达峰值为(99.57±0.133)%。以MOI为25的重组腺病毒感染N2a细胞,感染效率随时间变化(0-72h)而增高,72h峰值为(98.03±0.721)%,到96h有所降低(P<0.05)。SPK1蛋白的表达量较感染空病毒组和未感染病毒组明显升高。结论重组腺病毒在适宜的MOI下,在N2a细胞中96小时内均有较高的感染效率,且重组腺病毒介导的人SPK1基因在体外能够得到有效的表达。

2009甲型H1N1疫苗株与普通季节性H1N1疫苗株在呼吸道细胞中感染效率的比较

目的探讨2009甲型H1N1疫苗株与季节性H1N1疫苗株在人呼吸道细胞中感染效率的差异。方法用间接免疫荧光法检测H1N1病毒感染A549、CNE-2Z、H1650、Hep-2和MRC-5细胞的效率;用间接免疫荧光法检测抑制因子对H1N1病毒侵入细胞的影响。结果 1)2009甲型H1N1疫苗株感染人呼吸道细胞的效率:H1650>A549>CNE-2Z>MRC-5>Hep-2;季节性H1N1疫苗株感染人呼吸道细胞的效率A549>CNE-2Z>H1650>MRC-5>Hep-2;2)2009甲型H1N1疫苗株和季节性H1N1疫苗株均依赖于内吞作用进入细胞。结论在A549细胞中,季节性H1N1疫苗株的感染效率明显高于甲型H1N1疫苗株;在H1650细胞中,甲型H1N1疫苗株的感染效率明显高于季节性H1N1疫苗株。

慢病毒载体pITA-HBP1的制备及感染效率的测定

慢病毒载体是目前基因治疗中研究较多的载体,与通常使用的逆转录病毒载体和腺病毒载体比较,它有感染非分裂期细胞及容纳大片段外源性目的基因等优点.本文应用基因重组的方法,构建了1种新型的慢病毒载体,并将转录因子HBP1基因插入到这一载体上,成为pITA-HBP1.检测其在人的肿瘤细胞和正常细胞中的转染效率,发现转染效率明显增加,Western印迹证实外源基因得到高效表达.这一结果,对今后实验室提高基因的转染效率、表达水平,以及研究基因的表达调控,都提供了重要的技术方案.

腺相关病毒载体在各种细胞株中的感染效率及表达特性研究

目的:研究腺相关病毒载体(AAV)感染各类正常细胞和肿瘤细胞的效率,为相关研究提供参考。方法:利用脂质体将重组腺相关病毒的包装质粒AAV-DJ、Helper以及表达绿色荧光蛋白(GFP)的穿梭质粒AAV-GFPP转染293FT细胞进行病毒包装,收集病毒液后感染2种正常细胞和14种肿瘤细胞,24 h后倒置荧光显微镜下观察GFP的表达,并随机选取3个视野统计感染GFP的细胞数目。结果:GFP重组腺相关病毒对各种细胞的感染效率存在差别,感染效率最高的为293FT细胞(占96.2%)和Hela细胞(占81.86%),对SCG7901、SEM-M和SP20细胞的感染效率近乎为零。结论:GFP重组腺相关病毒对正常细胞293FT感染效率最高,对肿瘤细胞Hela、SMC7721、BGC823、PANC-1、A549、A875、C6和MCF-7的感染效率较高,这类细胞适合使用AAV作为载体进行外源基因的导入及功能研究。

病毒感染复数影响腺病毒感染T淋巴细胞效率的初步研究

以往研究发现,增加感染复数(multiplicity of infection,MOI)可以有效提高5型腺病毒(Ad5)感染T细胞的效率,但其具体机制并未十分清楚。选取T淋巴瘤细胞为靶细胞,通过荧光定量PCR及透射电镜观察等方法探讨不同MOI对重组腺病毒Ad5-GFP复制周期中病毒结合及病毒进入两个环节的影响,发现高MOI条件下不会影响T细胞结合的腺病毒数量,却可显著增加经胞吞进入T细胞的腺病毒数量。这些结果表明,增加MOI有利于腺病毒经胞吞进入T细胞,从而可提高腺病毒感染效率。这为进一步研究腺病毒感染T淋巴细胞的机制提供了理论基础。

表达靶向禽流感病毒多靶点miRNA重组慢病毒的制备及病毒感染效率检测

慢病毒介导的RNAi具有转移基因效率高,作用持久稳定等特点,成为基因治疗和基因功能研究的重要工具。本试验中将在细胞水平验证可以抑制禽流感病毒(AIV)PA、NP和PB2基因表达的miRNA克隆到pcDNATM6.2-GW/EmGFP-miR载体,构建多靶点miRNA表达载体(pcDNA6.2/PA+NP+PB2);鉴定正确后通过BP/LR重组反应将GFP和靶向AIV串联miRNA转座到慢病毒表达载体pLenti6/DEST,命名为pLenti6/PA+NP+PB2;鉴定正确后与辅助包装质粒共转染293FT,72h收集细胞上清进行病毒浓缩;采用梯度稀释法和real-timePCR法测定病毒滴度;通过感染MDCK细胞、CEF细胞及猪胎儿成纤维细胞,评价重组慢病毒的感染效率。结果,酶切和测序表明pcDNA6.2/PA+NP+PB2和pLenti6/PA+NP+PB2构建成功;浓缩后梯度稀释法检测病毒滴度为4×107TU/mL,real-timePCR法检测病毒滴度为1×108TU/mL;病毒感染MDCK细胞和猪胎儿成纤维细胞的感染效率显著高于CEF细胞的感染效率。结果表明,我们成功制备了表达靶向AIV多靶点miRNA重组慢病毒,并发现以VSVG替代了env囊膜后慢病毒对CEF细胞敏感性较低,为进一步研究AIV的防控和慢病毒介导的抗AIV转基因动物模型奠定了基础。

同一HCV1b型感染者来源的准种编码的包膜蛋白制备假病毒的感染效率研究

目的筛选丙型肝炎病毒（HCV） 1b亚型包膜蛋白编码基因，用于HCV 1b亚型假病毒制备与应用。方法从中国同一1b型HCV感染者（366）体内不同HCV准种中筛选不同的包膜蛋白编码基因，构建表达质粒并制备HCV假病毒（HCVpp），体外感染靶细胞，与前期制备的HCV 1b参考株HCVpp平行比较感染效率，并将HCVpp应用于中和抗体检测。结果从中国同一1b型HCV感染者（366）体内筛选获得的包膜蛋白编码基因可制备感染效率明显不同（分高/中/低3种类型）的HCVpp，确定了其中一个HCV包膜蛋白基因（366-C）可制备出高感染效率的HCV 1b型假病毒，并应用于HCV特异性中和抗体检测。进一步研究表明366患者不同准种来源包膜蛋白表达水平相近，但序列分析发现感染效率不同的包膜蛋白存在个别氨基酸差异。结论本研究获得了高感染效率的HCV 1b型假病毒，为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具。

提升乙型肝炎病毒体外感染细胞模型感染效率的研究进展

乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)导致的慢性感染是重大公共卫生问题,目前临床抗病毒治疗尚难实现彻底治愈或功能性治愈。体外感染模型作为HBV基础研究及新药研发的重要工具,其感染效率对模型的实用性和可靠性非常重要。本文从易感细胞的培养、病毒与细胞孵育时的感染条件以及病毒接种物制备3个方面,介绍提升HBV体外感染模型感染效率的研究进展。

AD5/F35腺病毒载体对不同来源造血系统恶性细胞转染效率的研究

本研究比较AD5/F35腺病毒载体对不同来源的血液系统恶性细胞系感染效率的差异和细胞毒性反应。用AD5/F35-EGFP以不同MOI(感染复数)感染不同来源的血液恶性细胞系并用AD5-EGFP作为对照;用流式细胞术检测荧光阳性细胞比例,进行荧光显微镜照相并用MTT法检测病毒对感染靶细胞的杀伤作用。结果表明:对于髓系来源的细胞在MOI为30时,AD5/F35载体的感染效率大于99%,AD5载体在MOI为1000时感染效率为26.4%;对于B系来源的细胞在MOI为1000时,AD5/F35载体感染效率为11.7%,AD5载体为5.7%;AD5/F35和AD5载体都不能有效地感染T系来源细胞,在MOI达到1000也未检测到荧光阳性细胞。在MOI为1000的情况下AD5/F35载体对感染靶细胞也无明显杀伤作用。结论:AD5/F35载体对不同来源的血液恶性细胞的感染具有一定的选择性,对髓系来源细胞感染能力强,对B系来源细胞有一定感染能力,而且对感染靶细胞毒性小。AD5/F35载体优于常用的5型腺病毒载体,在以髓系细胞为靶细胞的基因治疗中有着较好的应用前景。

重组腺病毒载体Ad5-EGFP感染人树突状细胞的研究

目的探讨重组腺病毒载体AdS—EGFP感染人树突状细胞（dendritic cell，DC）的最佳条件。方法采用密度梯度离心法分离健康成人外周血中的单个核细胞（PBMC），再以黏附法分离出单核细胞，加入重组人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（rhGM—CSF）、重组人白细胞介素-4（rhIL-4）、重组人肿瘤坏死因子-α（rhTNF-α）等细胞因子诱导培养出DC，动态观察细胞形态，流式细胞仪检测其表面标志。AdS—EGFP以梯度感染复数值（MOI）10、100、200、400、600、800、1000pfu／cell感染人DC，于感染后24、48h，荧光倒置显微镜观察增强的绿色荧光蛋白（EGFP）表达，KS400型图像分析仪测定感染后48h的感染效率。结果MOI从10-800pfu／cell时，EGFP阳性细胞数量逐渐增多，感染效率和病毒滴度呈量效关系，当MOI为800pfu／cell时可获得较佳的感染效率，EGFP阳性细胞数量达到峰值，感染率达到95．25％。结论Ad5-EGFP是感染人DC的较理想载体，通过选择恰当的MOI值能提高细胞对重组腺病毒的摄人，从而提高感染效率。

在INS-1细胞中构建胰腺组织硫氧还蛋白相互作用蛋白过表达模型:两种腺病毒感染方法的差异

背景:目前,通过腺病毒感染方法在细胞中构建蛋白质过表达模型的方法主要有2种,一是在腺病毒感染细胞4 h后补充1640完全培养基,24 h后换为完全培养基,再继续培养到48 h(方法Ⅰ);另一种是在腺病毒感染细胞4 h后用PBS洗去含有腺病毒的1640培养基,更换4 mL完全培养基培养到48 h,中间不做任何处理(方法Ⅱ)。前者病毒的作用时间较长,感染效果较好,但病毒本身对细胞的损害程度较大,对实验模型的稳定性产生干扰。而后者病毒的作用时间短,对细胞的毒性低,但有时病毒感染效率较低,目的蛋白的表达效果欠佳。目的:在大鼠INS-1胰岛β细胞中,通过比较相同腺病毒载体介导的不同感染细胞的方法而寻找一种更加稳定而高效的硫氧还蛋白相互作用蛋白(Thioredoxin-interacting protein,TXNIP)过表达模型。方法:构建含有绿色荧光蛋白的腺病毒载体(Ad-GFP)和TXNIP过表达腺病毒载体(Ad-TXNIP-GFP)。分别设立正常组、空病毒组和TXNIP过表达组,按照上述2种不同的方法进行病毒转染。结果与结论:(1)方法Ⅱ中的绿色荧光蛋白荧光强度和阳性效率高于方法Ⅰ;(2)方法Ⅱ中的细胞形态更好且细胞存活率更高;(3)方法Ⅱ中,目的基因TXNIP在mR NA水平和蛋白质水平的表达情况明显高于方法Ⅰ。由以上结果得出结论,腺病毒感染INS-1细胞4 h后,使用PBS将旧培养基洗去并更换新培养基,继续培养到48 h的方法更有利于在INS-1细胞中构建TXNIP过表达模型。

疾病数学模型和传播动力学研究的流行病学意义

本文就我国多年来对疾病传播数学模型和疾病传播动力学研究和应用的经验,结合我国疾病防治的实践,简要地论述疾病传播数学模型和疾病传播动力学的功能,疾病传播动力学研究的主要内容和重要的理论指标,如疾病传播速率、疾病的基本繁殖率和疾病的传播阈值、疾病传播的平衡状态及其流行病学意义,以及数学模型和传播动力学对于设计和制定防治策略和措施的指导作用,目的在于促进我国理论流行病学的研究和应用,以利于我国流行病学和防治工作水平的提高。

中国HCV3b型包膜蛋白编码基因的克隆分析与假病毒制备

从中国丙型肝炎病毒(HCV)3b亚型感染者克隆分析包膜蛋白编码基因,并用于HCV 3b亚型假病毒制备。本研究从中国HCV感染血清中筛选克隆到2个3b亚型包膜蛋白编码基因,序列分析后构建表达质粒,以1b(Con1)作为对照,体外转染293T细胞后分析不同包膜蛋白表达水平,并制备了HCV 3b亚型假病毒(HCVpp),比较不同HCVpp感染效率。结果表明:2个3b亚型包膜蛋白编码基因(C27与C30)与国际3b参考株TrKj的进化关系较近。C27与C30核苷酸与氨基酸同源性较高(分别为98.5%与98.2%),包膜蛋白编码区存在10个氨基酸位点差异,且C27包膜蛋白体外表达水平明显高于C30,其中C27可制备出高感染效率的HCV 3b型假病毒,其感染效率明显高于C30与HCV 1型(Con1)制备的HCVpp。本研究分析了2个HCV 3b亚型感染者包膜蛋白编码基因序列及表达特性,并首次获得了高感染效率的HCV 3b亚型假病毒,为HCV研究及疫苗与药物研发提供了有效工具。

稳定表达Venus基因的重组猪瘟病毒的构建

为了利用CRISPR/Cas9技术高通量筛选介导猪瘟病毒入侵的功能性受体,试验首先用融合PCR技术,将Venus基因融合至Npro蛋白的第13位与14位氨基酸之间,获得全长感染性克隆pCSFVVenus;之后将pCSFV-Venus转染至SK6细胞拯救重组猪瘟病毒(rCSFV-Venus),并将拯救的病毒感染猪肾细胞(PK-15细胞)进行连续传代观察其稳定性;最后将rCSFV-Venus和表达EGFP的重组病毒rCSFV-EGFP以相同剂量感染PK-15细胞,通过流式细胞仪分析荧光强度及感染效率。结果表明:rCSFV-Venus全长感染性克隆构建成功;转染后传至第4代可观察到绿色荧光,表明重组病毒拯救成功;将拯救的病毒连续传代10代,每代感染的PK-15细胞都可观察到绿色荧光,表明重组病毒具有良好的稳定性;流式细胞仪分析结果表明,rCSFV-Venus比rCSFV-EGFP荧光强度强且感染效率高。说明本研究成功拯救了稳定表达Venus基因的rCSFV-Venus,为筛选介导CSFV入侵的功能性受体提供了有力工具。