转Cry1Ac活性杀虫蛋白及慈菇蛋白酶抑制剂B基因的棉花(英文)

根据植物基因的结构特征,合成了CrylAc活性杀虫蛋白的编码序列并与内质网定位肽编码序列组成嵌合杀虫蛋白基因Bt29K。构建了含Bt29K基因及慈菇蛋白酶抑制剂B(API-B)基因表达框的双抗虫基因植物表达载体。通过根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens (Smith et Townsend )Conn LBA4404)介导转化了棉花(Gossypium hirsu-tum L.)的两个生产品种(系)。根据抗棉铃虫(Heliothis armigera )试验及农艺性状的观察调查结果,经6代筛选,获得了抗棉铃虫90.0％-99.7％且农艺性状优良的9个双价抗虫棉纯合品系。分子生物学分析结果表明,两个抗虫基因在棉花基因组中的插入拷贝数为1个或2个。活性CrylAc和API-B蛋白在转基因抗虫棉株系中的表达量分别约占总可溶性蛋白的0.17％和0.09％。对双抗纯合系植株及仅转Bt基因的棉花纯合系抗虫性检测结果表明前者的抗虫性明显高于后者,因此推断本研究采用的双抗虫基因表达载体构建策略是合理的。

尿胰蛋白酶抑制剂分离纯化研究进展

尿胰蛋白酶抑制剂(Urinary Trypsin Inhibitor,UTI)是从人类尿液中分离纯化得到的一种具有丝氨酸蛋白酶抑制活性的硫酸软骨素蛋白聚糖,其对胰蛋白酶、透明质酸酶、粒细胞弹性蛋白酶、纤溶酶等蛋白酶均具有良好抑制作用,被广泛用于临床治疗急性胰腺炎和作为急性循环衰竭的抢救辅助用药。本文主要综述了尿胰蛋白酶抑制剂的来源、结构、生理功能、传统分离纯化工艺以及基因工程技术生产新方法等,旨在为尿胰蛋白酶抑制剂的高质量生产以及应用提供参考。

小麦半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因家族的鉴定与表达分析

以小麦品种中国春的基因组为参考序列,利用Hummer search技术在小麦全基因组水平上对小麦TaCYS家族基因进行了鉴定。对TaCYS家族基因的进化关系、基因结构、保守基序列、顺式作用元件等进行了分析。结果表明,系统进化树分析将TaCYS分为A、B、C三类且同组的TaCYS的基因结构与motif分布相对保守。染色体定位显示,TaCYS位于除chr 6 A、chr 5 B外的19条染色体上。通过分析启动子区域的顺式作用元件,推测TaCYS基因的表达可能受到光照、温度、激素等因素的调控。对小麦转录组数据分析显示,大部分A类的TaCYS基因在小麦不同时期的根、叶、穗、粒中均表达,大部分B类与C类的TaCYS基因只在生殖发育时期的籽粒中表达。TaCYS基因在抵抗不同营养型真菌入侵时可能具有专一性,TaCYS35-D、TaCYS37-D能激活PTI反应,对生物胁迫的反应更为强烈。

慈姑蛋白酶抑制剂基因转化小白菜获抗虫转基因植株

通过根癌农杆菌的介导将慈姑蛋白酶抑制剂基因（ＡＰＩ）导入小白菜（Ｂｒａｓｓｉｃａ ｃａｍ ｐｅｓｔｒｉｓｓｓｐ．ｃｈｉｎｅｎｓｉｓＬ．）。Ｋａｎａｍ ｙｃｉｎ 筛选浓度为１０～１５ ｍ ｇ·Ｌ－ １，抑制农杆菌生长的抗生素选用Ｃａｒｂｅｎｉｃｉｌｌｉｎ，浓度为３００～５００ ｍ ｇ·Ｌ－ １。小白菜带柄子叶被农杆菌感染后，抗性芽的诱导频率为０．２％ ～２．０％ 。加入适量的ＡｇＮＯ３ 不仅可以抑制过度生长的农杆菌，还可以使抗性芽的诱导频率约提高到５％ 。试验获得转基因植株９７ 株。其中８１ 株ＰＣＲ 检测为阳性。部分转基因植株经ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ 及ＲＴＰＣＲ 的进一步分子检测分析，证明ＡＰＩ基因已被整合进小白菜植株的基因组中。转基因小白菜的叶片离体饲虫初步试验结果表明：对鳞翅目害虫菜青虫的生长发育有一定的抑制作用，其幼虫摄食转基因植株叶片后，平均体重、体长均分别比对照（摄食非转基因植株叶片）减轻和短小，且约有２７．８％ 的幼虫不能正常羽化，而对照全部正常羽化。

用花粉管通道法将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻获得转基因植株

采用花粉管通道法遗传转化技术,将慈姑蛋白酶抑制剂基因(API)导入水稻品系9311中,获得了转基因植株。抗虫性鉴定结果表明:部分转基因植株对水稻螟虫的抗性比对照明显提高;PCR扩增获得了与引物扩增片段长度相同的DNA片段,证实API基因已整合到受体植株的基因组中。遗传分析表明,API基因能在有性生殖过程中传递给后代,并于T4代分离出抗性纯合的株系。

慈姑蛋白酶抑制剂(API)基因导入棉花获得转基因植株

通过花粉管通道技术将慈姑蛋白酶抑制剂API(ArrowheadProteinaseInhibitor)基因转入棉花 ,获得了转基因植株。经对棉铃虫抗虫性鉴定和PCR、RT PCR、Southernblotting分析 。

慈菇蛋白酶抑制剂对亚洲玉米螟消化酶的影响

亚洲玉米螟幼虫中肠消化酶主要为胰蛋白酶。利用慈菇蛋白酶抑制剂研究它对玉米螟消化酶的影响，发现这种抑制剂体外强烈抑制玉米螟幼虫中肠消化酶。同时我们又比较了长时间取食（三龄至五龄第二天）和短时间取食（四龄未取食４８小时）抑制剂的幼虫体内胰蛋白酶活性，当它们短时间取食抑制剂后，体内消化酶水平迅速下降，取食更长时间时，胰蛋白酶活力下降更明显，仅为对照的２７．２％。由此可见，慈菇蛋白酶抑制剂严重影响了玉米螟的正常消化，阻断了玉米螟营养与食物间的联系，使玉米螟生长发育不良。

转豇豆胰蛋白酶抑制剂基因抗虫甘蓝植株的获得

利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导,将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入甘蓝(Brassica oleracea var.capitata L.)栽培品种“京丰”和“迎春”,并分别获得了转基因再生植株。对NPTⅡ的ELISA检测表明,标记基因NPTⅡ已在再生植株中得到有效表达。对转化植株进行Southern blot分子杂交实验进一步证明CpTI基因已整合到甘蓝的基因组。实验室内的叶片离体饲虫及盆栽饲虫试验表明,转基因甘蓝对菜青虫具有一定抗性。实验中还观察到,采用愈伤组织分化途径可以获得较高的转化频率,但嵌合体较多;而直接分芽的途径转化率低,但嵌合体较少。

根癌农杆菌介导豇豆胰蛋白酶抑制剂基因转入苹果主栽品种

研究建立起一套简单、高效的苹果遗传转化系统。利用根癌农杆菌介导的叶圆片转化法将高效启动子启动的豇豆胰蛋白酶抑制剂基因 (CpTI)转入富士、乔纳金、王林、嘎拉等苹果主栽品种中 ,经卡那霉素抗性、PCR、点杂交、Southern杂交检测证明了 4个品种均获得转化再生植株 。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的克隆及其转基因烟草抗虫性初探

从未成熟的大豆子叶中提取总RNA，利用RT－PCR方法扩增出大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因单一目的片段，克隆到pBluescriptKS（＋）SmaI位点上。序列分析表明，该基因与报导的序列高度同源：其核苷酸序列及推论的编码氨基酸序列的同源率分别为99．5％和98．2％。由此，构建了大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的植物高效表达载体pBinSKTI。并采用农杆菌介导的叶盘法转化了烟草，获得的转基因烟草再生植株经抗虫测试表明：与对照烟草相比，具有明显的抗棉铃虫能力。

大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂基因的分离及其在抗虫植物基因工程中的应用

大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂属于丝氨酸蛋白酶抑制剂，具有抗虫特性。从未成熟的大豆（ＧｌｙｃｉｎｅｍａｘＬ．）子叶中提取总ＲＮＡ，然后反转录成单链ｃＤＮＡ，以此为模板，用ＰＣＲ方法扩增出大豆Ｋｕｎｉｔｚ型胰蛋白酶抑制剂基因，并克隆到ｐＢｌｕｅｓｃｒｉｐｔＫＳ（＋）的ＳｍａⅠ位点上。序列分析表明：克隆片段大小为６６３ｂｐ，包含了基因完整的编码序列。编码多肽由２１７个氨基酸组成，其中包括Ｎ端２５个氨基酸组成的信号肽序列，１８１个氨基酸组成的成熟蛋白序列和Ｃ端１１个氨基酸组成的液泡定位信号序列。构建了此基因的一系列植物表达载体，用于烟草（ＮｉｃｏｔｉａｎａｔａｂａｃｕｍＬ．）、水稻（ＯｒｙｚａｓａｔｉｖａＬ．）、棉花（ＧｏｓｙｐｉｕｍｈｉｒｓｕｔｕｍＬ．）等作物的转化。利用棉铃虫（ＨｅｌｉｏｔｈｉｓａｒｍｉｇｅｒａＨｕｂｎｅｒ）对经ＰＣＲＳｏｕｔｈｅｒｎ杂交验证获得的转基因烟草进行了抗虫测试，结果表明，转基因烟草和对照烟草相比，具有明显的抗虫能力。

豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)抗虫转基因新疆杨的获得

利用根癌农杆菌介导法将广谱抗虫基因豇豆胰蛋白酶抑制剂 (CpTI)基因导入新疆杨 (Populusal bavar pyramidalis) ,经筛选获得了大量转基因植株。对转基因植株经PCR鉴定、PCR Southern和点杂交分子检测结果证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。部分转基因植株的饲虫实验表明 。

家蚕丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)的基因克隆、原核表达和多克隆抗体制备

丝氨酸蛋白酶抑制剂4(serpin-4)为丝氨酸蛋白酶抑制剂家族中的一员。本研究旨在研制高效价的家蚕Bombyxmoriserpin-4多克隆抗体,为深入研究serpin-4基因的生理功能打下物质基础。首先于家蚕脂肪体中克隆了serpin-4基因,利用基因重组技术构建了pET28a-serpin-4原核表达载体,经IPTG诱导,获得原核表达重组融合蛋白,利用镍柱回收纯化技术,获得目的蛋白;经SDS-PAGE和抗His多抗检测,纯化蛋白的分子量大小与预测的一致,即获得了高纯度的目的蛋白,以此蛋白为免疫抗原,采用4次免疫方式对昆明小鼠进行抗原免疫,最终获得抗serpin-4的多克隆抗体血清;该血清经ELISA和Westernblot验证,效价达到1:20000,特异性较好。家蚕serpin-4多克隆抗体的成功制备,一方面表明应用于其他生物的多克隆抗体制备所采用的方法对于家蚕serpin基因的研究同样适用;另一方面,也为深入研究家蚕serpin-4的生理功能打下了物质基础。

水稻巯基蛋白酶抑制剂基因在烟草叶绿体中的表达

将水稻巯基蛋白酶抑制剂 (Oryzacystatin,OC) c DNA基因克隆、测序分析后 ,与烟草 (N icotiana tabacum L .)叶绿体 16 S r DNA基因启动子和 T393终止子构建表达盒 ,与抗壮观霉素选择标记基因 aad A表达盒相连 ,以烟草叶绿体基因组同源片段 rbc L和 ORF5 12一起构建成叶绿体转化载体 p ZOC。通过基因枪轰击烟草幼苗叶片 ,壮观霉素筛选 ,获得转化再生植株。经 Southern、 Western检测及子代遗传学分析实验证明 OC基因已整合到烟草叶绿体中 ,并且可以遵循非孟德尔的母性遗传规律稳定遗传给后代。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因(cpti)及其在抗虫转基因作物中的应用

豇豆胰蛋白酶抑制剂(cowpea trypsin inhibitor,CpTI)来自豇豆的可食用部分,由于其具有抗虫谱广且昆虫不易对其产生耐受性的特点,cpti基因被作为抗虫植物基因工程一个重要的候选基因。目前,cpti基因已经被转到烟草、水稻、棉花和番茄等多种作物中。本文介绍了CpTI的特性、抗虫机理、基因工程研究进展,以及转cpti基因水稻的安全性研究,并对蛋白酶抑制剂的分类和安全性问题做了相关介绍。CpTI在分类上属于Bowmun-Birk家族,大量医学研究表明,该家族蛋白质对于癌症的预防和辅助治疗都有积极作用,对人体不存在任何危害。

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA克隆与序列分析(英文)

对多种已知植物巯基蛋白酶抑制剂(cystatin)基因的氨基酸序列进行比对分析,根据其高度保守的氨基酸序列设计一对简并引物,并从茶树品种龙井43鲜叶中提取总RNA,用RT-PCR法扩增出-204 bp的cDNA特异片段,然后通过3'/5'RACE的方法,分别扩增出3'端和5'端的序列,从而获得茶树巯基蛋白酶抑制剂基因的cDNA全长序列,所得序列全长627 bp,编码101个氨基酸,分子量约11.062 KDa.该基因在推测的氨基酸序列中含有巯基蛋白酶抑制剂家族中高度保守的、与其活性有关的QXVXG结构,且经Blast分析表明,该基因序列与其他植物巯基蛋白酶抑制剂基因的氨基酸序列同源性为54%～77%.

豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因转化欧美杨的研究

本研究建立了欧美107杨的高频再生体系,用改良的根癌农杆菌介导法将豇豆胰蛋白酶抑制剂(CpTI)基因导入107杨中。经过严格的卡那霉素(Km)筛选,得到了Km抗性(Kmr)植株。对部分Kmr植株进行PCR及PCR-Southern杂交鉴定,证实CpTI基因已整合进杨树基因组中。转基因植株的饲虫实验表明,其中部分株系的叶片可在一定程度上抑制扁刺蛾幼虫的生长。

水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因转化桑树获得转基因植株的初报

利用基因枪法将水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因 (OC)导入桑树组织 ,经抗性筛选和组织培养获得再生植株 ,通过对转基因植株的PCR Southern杂交及RNA点杂交等检测 ,证实OC基因转化桑树成功 ,为选育抗虫性桑树品种奠定了基础。

豇豆胰蛋白酶抑制剂基因的克隆

利用 RT- PCR的方法 ,从豇豆种子、子叶及成熟叶片中分别提取 RNA,反转录后以该基因两端的保守序列为引物进行 PCR扩增 ,PCR产物与 p UCm- T载体连接进行克隆 ,蓝白筛选重组子 ,经测序 ,其核苷酸同源性高达 1 0 0 % ,蛋白质同源性达 91 %。本试验同时对该基因的表达时期差异进行了大致检测 ,结果是种子的表达量最高 ,子叶其次 。