基于MEK/ERK通路研究桂枝茯苓丸改善慢性阻塞性肺疾病小鼠气道重塑的作用与机制

目的:研究桂枝茯苓丸通过丝裂原活化细胞外信号调节蛋白激酶(MEK)/细胞外调节蛋白激酶(ERK)通路改善慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠气道重塑的作用与机制。方法:采用烟熏的方法建立COPD小鼠模型,将32只造模成功小鼠随机分为模型组、桂枝茯苓丸组、PD98059组和桂枝茯苓丸+PD98059组,每组8只。另取8只未烟熏的小鼠为空白组。各组予相应药物灌胃14 d。采用小动物肺功能仪测定小鼠每分钟通气量(MV)、呼气峰值流速(PEF)和吸气峰值流速(PIF),HE染色评估肺组织炎症,Masson染色观察气道重塑改变,Western blotting检测COL1A1、COL3A1、MEK1、p-MEK1、ERK(1/2)和p-ERK(1/2)蛋白相对表达量。结果:模型组小鼠MV、PIF和PEF水平均低于空白组(P<0.05)。与空白组比较,模型组小鼠肺组织出现明显炎症和气道重塑,且肺组织COL1A1、COL3A1、p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK/MEK和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)均高于空白组(P<0.05)。桂枝茯苓丸组、PD98059组和桂枝茯苓丸+PD98059组小鼠MV、PEF、PIF水平均高于模型组(P<0.05),肺组织COL1A1、COL3A1、p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK/MEK和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)均低于模型组(P<0.05)。与模型组比较,桂枝茯苓丸组、PD98059组和桂枝茯苓丸+PD98059组小鼠的肺组织炎症和气道重塑改善。桂枝茯苓丸+PD98059组小鼠MV、PIF、PEF水平高于桂枝茯苓丸组和PD98059组(P<0.05)。桂枝茯苓丸组小鼠MV、PIF和PEF水平与PD98059组比较,差异无统计学意义(P>0.05)。桂枝茯苓丸组小鼠肺组织COL1A1和COL3A1蛋白相对表达量低于PD98059组(P<0.05),高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。PD98059组小鼠肺组织COL1A1和COL3A1蛋白相对表达量高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。桂枝茯苓丸组小鼠肺组织p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK1/MEK1和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)低于PD98059组(P<0.05),高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。PD98059组小鼠肺组织p-MEK1、p-ERK(1/2)、p-MEK1/MEK1和p-ERK(1/2)/ERK(1/2)高于桂枝茯苓丸+PD98059组(P<0.05)。结论:桂枝茯苓丸能显著改善COPD小鼠气道重塑过程,抑制MEK/ERK通路可能是其作用机制之一。

热毒宁注射液雾化吸入改善烟熏诱导的慢性阻塞性肺疾病小鼠肺部炎症的作用及机制

目的:探究热毒宁注射液(RDN)对烟熏诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)模型小鼠肺部炎症的治疗作用及其机制。方法:采用高效液相色谱法(HPLC)测定RDN中绿原酸和栀子苷的含量。制备烟熏诱导的COPD小鼠模型,并雾化吸入RDN进行治疗。采用瑞氏染色法检测肺泡灌洗液(BALF)中炎症细胞种类及数量;采用苏木素-伊红(HE)染色法观察肺组织病理学改变;采用免疫组织化学染色法(IHC)检测肺组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和IL-6的表达;采用转录组学技术筛选对照组、模型组及RDN高剂量组小鼠肺组织的差异表达基因,并对其进行基因本体(GO)和京都基因与基因组百科全书(KEGG)富集分析;采用蛋白质免疫印迹法(Western blot)检测Toll样受体4(TLR4)信号通路中相关蛋白的表达水平。结果:RDN中绿原酸和栀子苷的质量浓度分别为4.75、7.60 mg·mL^(–1);RDN能降低BALF中巨噬细胞和中性粒细胞的数量,并能改善小鼠肺间质与肺泡腔出血、肺泡壁水肿、炎性浸润等病理学变化;RDN能抑制肺组织炎症因子TNF-α、IL-1β和IL-6的表达;转录组学测序结果显示,3组小鼠存在149个共有差异表达基因,KEGG富集结果显示其主要涉及IL-17信号通路、TLR信号通路、TNF-α信号通路和核转录因子-κB(NF-κB)信号通路;RDN能降低肺组织TLR4的表达,并能抑制下游相关蛋白p38、c-Jun N末端激酶(JNK)、细胞外蛋白调节激酶(ERK)和p65的磷酸化水平。结论:RDN对烟熏诱导的COPD模型小鼠肺组织炎症反应具有改善作用,机制与其抑制TLR4信号通路有关。

慢性阻塞性肺疾病小鼠益气固表丸灌胃后内脏脂肪堆积及代谢性炎症反应观察

目的观察益气固表丸灌胃对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠内脏脂肪堆积、白色脂肪棕色化及代谢性炎症反应的影响,并探讨其可能的机制。方法将30只C57BL/6雄性小鼠随机分为空白对照组、COPD组、益气固表丸组,每组10只。COPD组、益气固表丸组采用吸入香烟烟雾暴露联合香烟烟雾提取物腹腔注射的方法建立COPD模型;益气固表丸组于建模后灌胃给予益气固表丸溶解液200μL,1次/天,连续2周;空白对照组及COPD组给予等体积生理盐水灌胃。测算各组小鼠的Lee's指数及脂体比,处死后取肺组织和白色、棕色脂肪组织进行病理观察;采用Western blotting法检测白色脂肪组织棕色化相关指标[沉默信息调节因子1(SIRT1)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、酶偶联蛋白1(UCP1)、过氧化物酶体增殖物活化受体γ共激活因子1α(PGC-1α)、PR结构域蛋白16(PRDM16)]及炎症反应相关指标[肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素8(IL-8)]蛋白表达,免疫荧光法检测白色和棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度,实时荧光定量PCR法检测白色脂肪组织TNF-α、IL-6、IL-8 m RNA表达,ELISA法检测血清IL-6、IL-8、TNF-α水平。结果COPD组小鼠肺组织可见较大面积肺泡壁轻度增厚,肺泡间隔增宽,炎症细胞浸润;益气固表丸组小鼠肺脏组织上述表现较COPD组减轻。与空白对照组比较,COPD组白色、棕色脂肪组织内的脂肪细胞体积均增大,细胞内空泡均增多;与COPD组比较,益气固表丸组白色、棕色脂肪组织内的脂滴减小,呈现出棕色化表现。与空白对照组比较,COPD组小鼠Lee's指数、脂体比及血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均升高,白色脂肪组织TNF-α、IL-6、IL-8蛋白及m RNA相对表达量均升高,白色脂肪组织SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白相对表达量及白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度均降低(P均<0.05);与COPD组比较,益气固表丸组小鼠Lee's指数、脂体比及血清IL-6、IL-8、TNF-α水平均降低,白色脂肪组织TNF-α、IL-6、IL-8蛋白及m RNA相对表达量均降低,白色脂肪组织SIRT1、PPARγ、UCP1、PGC-1α、PRDM16蛋白相对表达量及白色、棕色脂肪组织UCP1相对荧光强度均升高(P均<0.05)。结论益气固表丸可减轻COPD小鼠的内脏脂肪堆积及代谢性炎症反应,其机制可能与靶向SIRT1/PPARγ/UCP1信号通路而促进白色脂肪棕色化有关。

健脾补肾益肺方减轻慢性阻塞性肺疾病小鼠氧化应激的实验研究

目的观察健脾补肾益肺方对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠氧化应激的影响,探讨该方抗氧化应激的机制。方法将30只C57BL/6J小鼠随机分为正常组、模型组、中药高剂量组、中药低剂量组、西药组。每组6只。除正常组外,其余各组采用气管滴注脂多糖加熏香烟方法建立COPD小鼠模型。中药高、低剂量组分别给予健脾补肾益肺方[合生药量29.9、14.95 g/(kg·d)]灌胃,西药组给予丙卡特罗26μg/(kg·d)灌胃,正常组和模型组予同等体积的生理盐水灌胃。采用动物肺功能分析系统测定各组小鼠FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%并留取标本。采用ELISA法测定各组小鼠肺泡灌洗液中活性氧(ROS)、丙二醛(MAD)水平,采用免疫组织化学法测定各组小鼠超氧化物歧化酶(SOD)、血红素加氧酶1(HO-1)、醌氧化还原酶1(NQO1)、核因子红系2相关因子2(Nrf2)蛋白的表达量。结果中药高剂量组小鼠FEV0.15/FVC%、FEF50%、FEF75%较模型组显著增高(P<0.01);模型组ROS、MDA较正常组均显著增高(P<0.01),而模型组SOD较正常组显著减少(P<0.01),两组HO-1、NQO1无显著差异(P>0.05);中药高、低剂量组较模型组ROS均显著减少(P<0.01),中药高剂量组MDA比模型组显著减少(P<0.01),中药高、低剂量组SOD均较模型组显著增多(P<0.01或P<0.05),中药高剂量组HO-1、NQO1、Nrf2较模型组显著增多(P<0.01)。结论健脾补肾益肺方可能通过上调COPD小鼠Nrf2的表达而增加抗氧化剂的产生,从而减轻COPD小鼠的氧化应激程度。

桂枝茯苓丸对慢性阻塞性肺疾病小鼠气道重塑的影响

目的研究桂枝茯苓丸对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠气道重塑的影响。方法40只C57BL/6小鼠随机分为空白组、模型组、桂枝茯苓丸组、EVP4593(NF-κB抑制剂)组和桂枝茯苓丸+EVP4593组,每组8只。采用烟熏的方法建立COPD小鼠模型,成模后予以相应药物灌胃14 d。小动物肺功能仪测定小鼠每分钟通气量(MV)、呼气峰值流速(PEF)和吸气峰值流速(PIF),HE染色半定量评估肺组织炎症和气道管壁厚度,Masson染色观察气道纤维化改变,ELISA法检测肺组织IL-6、IL-8和TNF-α水平,Western blot法检测肺组织E-cadherin、α-SMA、Snail、IκBα、NF-κB、p-IκBα和p-NF-κB蛋白表达。结果与模型组比较,各给药组小鼠肺组织炎症评分、气道管壁厚度、气道蓝染胶原纤维区降低(P<0.05),肺功能指标MV、PEF和PIF值升高(P<0.05),肺组织IL-6、IL-8和TNF-α水平降低(P<0.05),肺组织E-cadherin蛋白表达升高(P<0.05),α-SMA、Snail、p-IκBα和p-NF-κB蛋白表达降低(P<0.05),p-IκBα/IκBα和p-NF-κB/NF-κB比值降低(P<0.05),其中以桂枝茯苓丸+EVP4593组作用最为显著(P<0.05)。结论桂枝茯苓丸可通过抑制NF-κB/Snail信号通路所介导的上皮间质转化(EMT)改善COPD气道重塑。

补肺活血中药对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能及炎症反应的影响

目的观察补肺活血中药对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠肺功能、炎症反应的影响。方法用随机数字表法将60只小鼠分为空白对照组、模型组、补肺活血中药组,每组20只。模型组、补肺活血中药组采用鼻腔滴入LPS加熏香烟的方法建立COPD小鼠动物模型,空白对照组经鼻腔滴入等量生理盐水。空白对照组、模型组于建立模型第1~22天灌服生理盐水0.2 mL/d;补肺活血中药组于建立模型第1~22天灌服补肺活血中药溶液0.82 g/kg,0.2 mL/d。对比各组肺功能指标[呼吸系统阻力(R)、主气道阻力(Rn)、呼吸系统弹力(E)、呼吸系统顺应性(C)],肺组织病理学变化,肺组织上清液中肿瘤坏死因子α(TNF-α),肺组织中免疫球蛋白A(IgA)、角质细胞生长因子(KGF)基因表达。结果补肺活血中药组与模型组相比毛发较有光泽,躁动程度减轻,呼吸较均匀。与空白对照组比较,模型组R、Rn高,E、C低,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,补肺活血中药组R、Rn低,E、C高,差异有统计学意义(P<0.05)。补肺活血中药组肺组织病理损伤较模型组减轻。与空白对照组比较,模型组肺组织上清液中TNF-α高,肺组织中IgA、KGF表达高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型对照组比较,补肺活血中药组肺组织上清液中TNF-α低,肺组织中IgA、KGF表达低,差异有统计学意义(P<0.05)。结论补肺活血中药可改善COPD小鼠肺功能,减轻炎症反应。

金水六君煎对慢性阻塞性肺疾病小鼠模型巨噬细胞M1/M2表型分化的影响

目的:探讨巨噬细胞M1/M2表型分化在慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠模型中的作用及金水六君煎的干预机制。方法:将32只SPF级ICR小鼠随机分为空白组、模型组、西药组、中药组,每组8只。除空白组外,其余各组通过熏烟方式制备COPD小鼠模型。空白组及模型组灌胃生理盐水,西药组及中药组灌胃相应药物。评估各组小鼠毛发、精神及体质量等差异,给药结束后检测肺功能评估COPD严重程度,采用HE染色观察肺组织病理改变,ELISA检测肺组织白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-8(IL-8)水平,采用流式细胞术、免疫荧光实验评估巨噬细胞M1/M2极化情况。结果:空白组小鼠肺组织完整,肺泡无明显破裂融合现象。模型组可见肺泡破裂融合,为明显的COPD肺组织征象。与模型组比较,中药组和西药组肺泡破裂融合现象明显减少。模型组小鼠每分钟通气量(MV)、吸气峰流量(PIE)、呼气峰流量(PEF)水平均低于空白组(P<0.05),肺组织IL-6和IL-8水平均高于空白组(P<0.05);中药组和西药组小鼠MV、PIF和PEF水平均高于模型组(P<0.05),肺组织IL-6和IL-8水平均低于模型组(P<0.05);中药组小鼠MV、PIF和PEF水平均高于西药组(P<0.05),肺组织IL-6和IL-8水平均低于西药组(P<0.05)。模型组小鼠肺组织CD68、CD206占比和CD206/CD68均高于空白组(P<0.05);西药组、中药组小鼠肺组织CD68占比低于模型组,CD206占比和CD206/CD68均高于模型组(P<0.05);中药组小鼠肺组织CD68占比高于西药组(P<0.05),CD206占比和CD206/CD68均低于西药组(P<0.05),提示经过治疗后,肺组织中巨噬细胞有向M2极化趋势。模型组小鼠肺组织CD86/CD163和CD86阳性比例高于空白组(P<0.05),提示巨噬细胞激活以M1极化为主。西药组与中药组小鼠肺组织CD86/CD163和CD86阳性比例低于模型组(P<0.05),CD163阳性比例高于模型组(P<0.05),提示巨噬细胞以M2方向极化趋势为主。结论:巨噬细胞M1极化在COPD小鼠模型中具有加重炎症症状的作用;金水六君煎可能通过抑制巨噬细胞向M1表型分化,促进巨噬细胞向M2表型分化,抑制炎症反应,起到治疗COPD的效果。

金水六君煎对慢性阻塞性肺疾病小鼠气道黏液潴留的影响及机制研究

目的 探讨金水六君煎对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠气道黏液潴留的影响及其可能机制。方法 将72只C57BL/6小鼠随机分为空白组、COPD组、金水六君煎低剂量组、金水六君煎中剂量组、金水六君煎高剂量组和罗氟司特组,每组12只。除空白组外,其余组采用鼻腔滴注脂多糖加烟熏的方法建立COPD模型。成模后,金水六君煎低、中、高剂量组分别给予3.705 g/(kg·d)、7.41 g/(kg·d)、14.82 g/(kg·d)金水六君煎液灌胃,罗氟司特组给予65μg/(kg·d)罗氟司特灌胃,空白组和COPD组给予等量生理盐水灌胃,均1次/d,连续14 d。灌胃结束后,采用小动物肺功能仪测定各组小鼠每分钟通气量(MV)、呼气峰值流速(PEF)和吸气峰值流速(PIF),HE染色半定量评估肺组织炎症,PAS染色观察气道黏液分泌和杯状细胞增生情况,比色法检测肺泡灌洗液中唾液酸、尿素含量,并计算两者比值,ELISA法检测肺组织中环腺苷酸(cAMP)和V-ATP酶含量及肺泡灌洗液中黏蛋白5ac(Muc5ac)含量,qRT-PCR和Western blot法分别检测肺组织中囊性纤维化跨膜转导调节因子(CFTR)、Foxi1 mRNA和蛋白表达情况。结果 与空白组比较,COPD组的MV、PEF、PIF、尿素含量、cAMP和V-ATP酶含量及CFTR、Foxi1 mRNA和蛋白相对表达量均明显降低(P均<0.05),肺组织病理评分、气道阳性着色面积占比和唾液酸、Muc5ac含量及唾液酸/尿素均明显升高(P均<0.05)。与COPD组比较,金水六君煎各组(除金水六君煎低剂量组cAMP外)和罗氟司特组的MV、PEF、PIF、尿素含量、cAMP和V-ATP酶含量及CFTR、Foxi1 mRNA和蛋白相对表达量均明显升高(P均<0.05),肺组织病理评分、气道阳性着色面积占比和唾液酸、Muc5ac含量及唾液酸/尿素均明显降低(P均<0.05)。结论 金水六君煎可改善COPD小鼠气道黏液潴留,其机制可能与调控CFTR和Foxi1表达有关。

烟雾诱导慢性阻塞性肺疾病小鼠模型合并抑郁的评估

目的 探究单纯烟草烟雾慢性暴露诱导的慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)小鼠模型能否合并发生抑郁。方法 SPF级小鼠分为对照组(CTL组)和烟雾暴露组(CS组)。将CS组小鼠连续24周暴露在烟草烟雾中,最后一次烟熏24 h后进行旷场测试、悬尾测试,再进行肺功能检测。ELISA检测支气管肺泡灌洗液(BALF)上清中炎症因子白细胞介素-6(IL-6)、角质形成细胞衍生趋化因子(KC)的水平变化,以及血清中5-羟色胺(5-HT)的含量变化。H&E染色和尼氏染色观察小鼠肺组织、脑组织的病理学变化。结果 与CTL组相比,CS组小鼠体质量增长缓慢(P <0.001),肺功能检测FRC、FVC显著升高(P <0.001),FEV20/FVC和FEV50/FVC显著降低(P <0.05);CS组小鼠的BALF中IL-6、KC的表达水平升高(P <0.01),血清中5-HT水平明显降低(P <0.001);旷场实验中CS组小鼠的运动总路程、进入中央区次数、中央区滞留时间均降低(P <0.05),悬尾测试中CS组小鼠的静止不动时间增加(P <0.05);H&E染色显示CS组的肺组织平均肺泡截距显著增加(P <0.001),尼氏染色显示CS组小鼠皮质(P <0.001)和海马区(P <0.01)受损的神经元数量显著增加。结论 单纯烟草烟雾慢性暴露诱导的COPD小鼠模型可合并抑郁发生。

烟熏诱导慢性阻塞性肺疾病小鼠模型的建立及验证

目的建立一种烟熏诱导的慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠模型,并对其进行验证。方法将32只C57BL/6小鼠随机分为正常组、烟熏2周组、烟熏4周组、恢复组,各8只。正常组不予烟熏,烟熏2、4周组及恢复组置于熏烟箱中,被动吸烟6支/次,每次1 h;两次间隔30 min呼吸新鲜空气,4次/d,5 d/周。烟熏2周组第10天停止吸烟,烟熏4周组第26天停止吸烟,恢复组烟熏4周后再正常饲养2周。观察各组一般情况及体质量变化,测定支气管肺泡灌洗液(BALF)中蛋白含量;取肺组织制备切片,HE染色观察病理形态变化及肺泡直径。结果建模开始后正常组体质量呈上升趋势,烟熏2、4周组及恢复组出现精神萎靡、食欲降低,体质量较同时间点正常组降低(P均<0.01);恢复组停止烟熏后体质量缓慢上升,但仍低于正常组(P均<0.05)。BALF蛋白含量:烟熏2、4周组及恢复组均明显高于正常组(P均<0.01);烟熏4周组及恢复组明显高于烟熏2周组,恢复组明显低于烟熏4周组(P均<0.01)。肺组织病理形态学显示,正常组肺组织有少量淋巴细胞,肺泡结构完整;烟熏2周组有少量中性粒细胞、大量单核细胞及淋巴细胞浸润,肺泡扩大,部分肺泡间隔断裂并融合;烟熏4周组肺组织伴有少量中性粒细胞浸润,单核细胞及淋巴细胞浸润较烟熏2周组明显增多;支气管上皮细胞变性、坏死脱落,部分肺泡间隔变窄、断裂并融合成肺大疱。肺泡直径:烟熏2、4周组及恢复组均大于正常组,烟熏4周组及恢复组均大于烟熏2周组(P均<0.01),烟熏4周组与恢复组比较差异无统计学意义(P>0.05)。结论单纯烟熏4周法成功制备COPD小鼠模型;该模型符合人类COPD的病理和功能改变,是进行COPD动物实验的理想建模方法。

加味四君子汤对慢性阻塞性肺疾病小鼠膈肌线粒体损伤的修复作用

【目的】探讨加味四君子汤对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠膈肌线粒体损伤的修复作用及机制。【方法】将50只小鼠随机分为5组,即正常组,模型组,中药高、低剂量组和N-乙酰半胱氨酸(NAC)组,每组10只。除正常组,其余小鼠采用烟熏法复制COPD模型,持续8周。熏烟4周后,中药高、低剂量组给予加味四君子汤(剂量分别为20、10 g·kg-1·d-1)灌胃,NAC组给予NAC泡腾片混悬液(剂量为100 mg·kg-1·d-1)灌胃,正常组、模型组给予等体积生理盐水灌胃,共4周。给药结束后观察肺组织病理及膈肌线粒体结构变化,检测膈肌超氧化物歧化酶(SOD)活性、丙二醛(MDA)含量及琥珀酸脱氢酶(SDH)活性变化。【结果】与正常组比较,模型组小鼠肺组织出现了符合COPD的病理改变,膈肌线粒体结构受损,而各给药组肺组织、膈肌病理表现较模型组有所改善。与正常组比较,模型组SOD、SDH活性显著降低(P <0.05),而MDA含量显著升高(P <0.05);与模型组比较,中药高、低剂量组SOD、SDH活性显著升高(P <0.05),MDA含量显著下降(P <0.05);与NAC组比较,中药高剂量组对SOD、SDH活性的升高作用及对MDA含量的降低作用更明显(P <0.05)。【结论】加味四君子汤可减轻COPD小鼠氧化应激水平,保护膈肌线粒体结构免于损伤,维持线粒体能量的正常代谢。

慢性阻塞性肺疾病小鼠模型制备方法的比较研究

目的:采用香烟烟雾(cigarette smoke,CS)暴露、肺炎克雷伯杆菌(Klebsiella pneumoniae,KP)感染、聚肌胞苷酸(polyinosinic-polycytidylic acid,Poly I:C)滴鼻、CS暴露联合KP感染和CS暴露联合Poly I:C滴鼻5种方法,建立并比较慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary disease,COPD)小鼠模型。方法:将288只雄性BALB/c小鼠随机分为正常组(normal组)、CS组、KP组、CS+KP组、Poly I:C组及CS+Poly I:C组,每组48只。第1~8周造模,分别于第4、8、16和24周末取材。观察小鼠肺组织平均肺泡数(mean alveolar number,MAN)、肺泡平均截距(mean linear intercept,MLI)、肺功能呼气峰流速(peak expiratory flow,PEF)和50%潮气量呼气流量(50%tidal volume expiratory flow,EF50)的变化,检测肺组织中肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)、白细胞介素6(interleukin-6,IL-6)和基质金属蛋白酶2(matrix metalloproteinase-2,MMP-2)的表达,采用R值综合评价法分析不同造模方法的COPD小鼠病变程度。结果:与normal组比较,第4周,CS+KP组PEF和MAN显著降低,MLI及TNF-α水平和IL-6显著升高(P<0.05);第8周,各模型组小鼠肺组织出现大量炎症细胞浸润、肺泡腔扩张、肺泡壁断裂融合、气管壁增厚等病理变化,MAN显著降低,MLI显著升高,肺功能PEF和EF50显著降低,TNF-α、IL-6和MMP-2水平显著升高(P<0.05);观察至第24周CS+KP组和CS+Poly I:C组仍然表现出COPD的病理特征;综合所有时点R值综合评价结果显示,CS+KP组和CS+Poly I:C组R综合值较CS组、KP组和Poly I:C组显著升高,KP组和Poly I:C组R综合值较CS组显著降低(P<0.05)。结论:CS暴露联合细菌感染或Poly I:C滴鼻组COPD的病理特征明显、出现早、持续时间长、远后观察稳定。

健脾益气复方中药联合肠内营养粉剂对慢性阻塞性肺疾病小鼠的治疗作用

目的评估健脾益气复方中药颗粒剂联合肠内营养粉剂安素治疗慢性阻塞性肺疾病(COPD)的有效性与安全性。方法选取雄性小鼠96只,其中24只作为正常对照组,其余72只采用烟熏小鼠法建立COPD模型,随机分3组:COPD模型组、安素治疗组(0.558 g/m L安素,0.1 m L/10 g小鼠)及中药联合安素治疗组(0.558 g/m L安素,0.1 m L/10 g小鼠+2.5 g/m L中药,0.06 m L/10 g小鼠)。所有小鼠在实验全程进行体重监测,并分别在治疗前、治疗后2周及5周进行血清学检测及肺组织切片检查。结果与正常对照组小鼠相比,COPD模型组小鼠体重增加明显减缓,血清总蛋白和白蛋白含量均明显降低(P<0.05),血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量均明显升高(P<0.05)。与COPD模型组小鼠相比,中药联合安素治疗组小鼠的体重明显回升,治疗后5周,血清总蛋白和白蛋白含量均显著增加(P<0.05),血清谷草转氨酶和谷丙转氨酶含量均明显下降(P<0.05)。病理切片结果也证实了中药联合安素治疗对COPD肺部病理改变具有明显改善作用。结论健脾益气复方中药联合肠内营养粉剂安素可明显改善COPD营养不良状况,并有效改善其肺组织受损情况。

二甲双胍调控AMPK通路对稳定期慢性阻塞性肺疾病小鼠的影响及机制

目的探讨二甲双胍调控腺苷酸活化蛋白激酶(AMPK)通路对稳定期慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠的影响及机制。方法野生型(WT)C57BL/6J小鼠随机分为AMPK-WT组、AMPK-WT+COPD组、AMPK-WT+COPD+二甲双胍组,肺AMPK特异性敲除小鼠随机分为AMPK-敲除(KO)组、AMPK-KO+COPD组、AMPK-KO+COPD+二甲双胍组,采用香烟烟雾吸入的方法建立稳定期COPD模型,给予二甲双胍干预。比较各组间肺组织病理改变、AMPK、核因子(NF)-κB、核因子E2相关因子(Nrf)2、CCAAT/增强子结合蛋白同源蛋白(CHOP)、含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶(Caspase)-12表达及肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-6、IL-8、丙二醛(MDA)、超氧化物歧化酶(SOD)含量的差异。结果AMPK-WT+COPD组肺组织出现了典型的COPD病理改变,p-AMPK、NF-κB、CHOP、Caspase-12的表达水平及TNF-α、IL-6、IL-8、MDA含量均明显高于AMPK-WT组,Nrf2表达水平及SOD的含量均明显低于AMPK-WT组(P<0.05);AMPK-WT+COPD+二甲双胍组肺组织的病理改变明显改善,p-AMPK、Nrf2表达水平及SOD的含量均明显高于AMPK-WT+COPD组,NF-κB、CHOP、Caspase-12表达水平及TNF-α、IL-6、IL-8、MDA含量均明显低于AMPK-WT+COPD组(P<0.05);AMPK-KO+COPD+二甲双胍组肺组织病理改变加重且不表达p-AMPK,NF-κB、CHOP、Caspase-12表达水平及TNF-α、IL-6、IL-8、MDA含量明显高于AMPK-WT+COPD+二甲双胍组,Nrf2表达水平及SOD含量明显低于AMPK-WT+COPD+二甲双胍组(P<0.05)。结论二甲双胍能够改善香烟烟雾诱导稳定期COPD小鼠肺组织病理改变并抑制炎症反应、氧化应激及内质网应激,且这一作用与激活AMPK有关。

慢性阻塞性肺疾病小鼠膈肌细胞凋亡的机制研究

目的探讨慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠膈肌细胞凋亡可能的调控机制。方法选取SPF级C57BL/6J小鼠20只,雄性,6～8周龄,体重18～22 g。按照随机数字表法将小鼠分为正常对照组和COPD组,每组各10只。COPD组为将小鼠暴露于香烟烟雾中,烟熏3个月,通过病理检测COPD小鼠造模是否成功,使用平均肺泡间隔里衬(MLI)评估肺气肿严重程度,TUNEL检测膈肌细胞凋亡情况,实时荧光定量聚合酶链反应(RT-PCR)检测凋亡相关基因天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶-3(Caspase-3) mRNA和Caspase-8 mRNA的表达,以及死亡受体5(DR5)及下游信号分子Fas相关死亡结构域(FADD)的表达。结果肺脏病理提示COPD模型造模成功,COPD组MIL(87. 25±5. 84μm)明显高于正常对照组(34. 89±5. 82μm),差异具有统计学意义(P <0. 001)。TUNEL结果提示,COPD组膈肌细胞凋亡较正常对照组增多,差异具有统计学意义(P <0. 001)。RT-PCR结果提示,COPD组DR5、FADD、Caspase-8 mRNA、Caspase-3 mRNA相对表达量较正常对照组增高,差异均具有统计学意义(P <0. 01)。结论慢性阻塞性肺疾病小鼠膈肌细胞存在凋亡,可能与香烟烟雾激活死亡受体信号通路有关。

和厚朴酚通过Notch信号通路抑制慢性阻塞性肺疾病小鼠免疫失衡并提供肺保护作用

目的探讨和厚朴酚(HNK)对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠免疫失衡及肺功能的影响,并考察Notch信号通路是否介导该过程。方法将30只6~8周龄雄性BALB/c小鼠随机分为3组:正常对照组(Normal)、COPD组和COPD+HNK组,每组10只。通过香烟烟雾诱导COPD小鼠模型,然后对COPD+HNK组小鼠隔日腹腔注射HNK(10.00 mg/kg),共30 d。采用法国EMKA GYD-003型动物肺功能测试系统检测吸气峰流速(PIF)和呼气峰流速(PEF)。苏木精-伊红(HE)染色评价肺组织病理变化。用流式细胞仪检测小鼠脾T细胞Th1/Th2和Th17/Treg亚群的比值。Western blot检测T细胞中Notch 1/2/3/4、Hes1、Hes5和Hey1的蛋白表达。采用ELISA法检测小鼠血清IFN-γ、IL-4、IL-17和IL-10水平。结果与COPD组相比,COPD+HNK组小鼠的PIF和PEF均显著升高(P<0.05)。COPD+HNK组小鼠肺组织病变较COPD组减轻,炎性细胞浸润减少,肺泡数增多,肺泡腔缩小。与COPD组相比,COPD+HNK组小鼠的Th1百分比、Th1/Th2比值、Th17百分比和Th17/Treg比值均显著降低(P<0.05)。与COPD组相比,COPD+HNK组小鼠脾T细胞中的Notch1、Notch2、Notch3、Notch4、Hes1、Hes5、Hey1的蛋白相对表达量均显著降低(P<0.05)。与COPD组相比,COPD+HNK组小鼠血清中的IFN-γ和IL-17水平均显著降低(P<0.05),而IL-4和IL-10水平显著升高(P<0.05)。结论和厚朴酚通过抑制COPD小鼠脾T细胞Notch信号通路的激活,进而纠正了COPD小鼠Th1/Th2和Th17/Treg细胞的失衡,从而改善了肺功能。

Apaf-1、Mfn2、Caspase-10在慢性阻塞性肺疾病小鼠模型肺组织中的表达

目的观察小鼠慢性阻塞性肺疾病(COPD)动物模型肺组织中的凋亡蛋白:凋亡蛋白酶活化因子-1(Apaf-1)、线粒体融合蛋白2(Mfn2)、半胱氨酸蛋白酶-10(Caspase-10)的表达,探讨COPD细胞凋亡的机制。方法健康SPF级、6周龄C57BL/6J雄性小鼠30只,适应性饲养2周后,按照随机数字表法分为两组:COPD组采用自制香烟烟雾暴露箱行香烟(含尼古丁0.9 mg,焦油12 mg)烟雾暴露;健康对照组放入另一相同的烟雾发生器中,不燃烧香烟,自由呼吸新鲜空气,自由饮食饮水。两组小鼠均于第91天处死。取肺组织行常规石蜡包埋,运用HE染色、电镜对肺组织形态学进行观察;用免疫组化检测两组小鼠肺组织Apaf-1、Mfn2、Caspase-10蛋白表达水平;用原位检测法测定两组小鼠肺组织内细胞凋亡率。结果 COPD组小鼠形态学结果符合COPD临床病理形态学改变,肺功能提示存在气流受限;COPD组凋亡蛋白Apaf-1、Mfn2、Caspase-10均较健康对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05);COPD组肺组织内皮细胞凋亡率较健康对照组升高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论凋亡蛋白Apaf-1、Mfn2、Caspase-10可能通过多种凋亡途径共同促进了COPD细胞凋亡的发生。

益气化痰方对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能及IL-17、TNF-α的影响

目的:观察益气化痰方对慢性阻塞性肺疾病小鼠的肺功能及肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-17(IL-17)的影响。方法:将60只C57BL小鼠随机分成6组,分别是正常对照组、COPD模型组、低剂量中药组、中剂量中药组、高剂量中药组、地塞米松组,每组10只。香烟烟熏方法建立慢性阻塞性肺疾病小鼠模型,给药后分别观察小鼠肺功能以及对肺泡灌洗液中TNF-α、IL-17的变化。结果:与正常对照组相比,COPD模型组吸气峰流量(PIF)、呼气峰流量(PEF)及每分钟通气量(MV)数值均降低,差异均有统计学意义(P<0.01),低、中、高剂量的益气化痰方均能明显改善COPD小鼠气道的高反应状态,差异均有统计学意义(P<0.01,P<0.05)。与COPD模型组比较,中、高剂量组肺泡灌洗液中IL-17和TNF-α逐渐降低,差异均有统计学意义(P<0.01)。结论:益气化痰方能明显改善COPD小鼠的气道高反应,同时降低气道炎症反应。

沉默lncRNA MEG3对慢性阻塞性肺疾病小鼠肺功能的改善作用及其机制

目的观察沉默lncRNA MEG3对慢性阻塞性肺疾病(COPD)小鼠肺功能的改善作用,并探讨其机制是否与调控白细胞介素1β(IL-1β)有关。方法将32只野生型C57BL/6J小鼠随机分成control组、COPD组、COPD+NC组、COPD+siMEG3组,每组8只;除control组小鼠外,均采用香烟烟雾烟熏的方法建立COPD模型,COPD+NC组、COPD+siMEG3组同时尾静脉注射siRNA-Lipofectamine、NC-Lipofectamine复合体2.5 mg/kg,control组、COPD组注射等量生理盐水,1次/周,共注射12次。ASPER数据库及染色质免疫共沉淀实验证实lncRNA MEG3与IL-1β启动子区域存在结合位点,二者存在靶控关系。比较各组小鼠肺组织病理改变、氧合指数及肺湿重/干重,肺组织及BALF中的lncRNA MEG3及IL-1βmRNA、蛋白表达。结果control组小鼠肺组织结构正常;COPD组及COPD+NC组小鼠肺泡结构紊乱,部分肺泡可见不规则扩大,肺泡、小气道及肺血管可见大量炎症细胞浸润;COPD+siMEG3组小鼠肺泡结构较COPD组及COPD+NC组完整,肺泡、小气道和肺血管少量炎症细胞浸润,支气管平滑肌层及管壁结构偶见异常。与control组和COPD+siMEG3组比较,COPD组、COPD+NC组肺湿重/干重均升高,氧合指数均降低(P均<0.05)。各组小鼠BALF中均未检测到lncRNA MEG3表达。与control组、COPD+siMEG3组比较,COPD组及COPD+NC组肺组织lncRNA MEG3表达均升高且肺组织、BALF中IL-1βmRNA、蛋白均升高(P均<0.05)。结论沉默lncRNA MEG3可通过降低IL-1β表达而减轻COPD小鼠的肺损伤,从而发挥肺保护作用。

下调HMGB1表达通过抑制炎性反应与上皮间质转化改善慢性阻塞性肺疾病小鼠疾病进展

目的在慢性阻塞性肺疾病(COPD)的小鼠模型中探究下调高迁移率族蛋白B1(HMGB1)表达对肺组织中炎性反应及上皮间质转化(EMT)的影响和相关机制。方法采用单纯香烟烟雾诱导建立小鼠COPD模型,使用小干扰RNA(siRNA)下调小鼠肺组织中HMGB1表达,并按实验目的将小鼠分为对照组、COPD组、si-NC处理组(COPD联合si-NC组),si-HMGB1处理组(COPD联合si-HMGB1组),并设立噻托溴铵(tiotropium)处理组(COPD联合tiotropium组)作为阳性对照组。香烟烟雾诱导4周后,观察小鼠的一般情况差异,并记录每周各组小鼠的体质量变化;HE染色观察各组小鼠肺组织病理改变;实时荧光定量PCR和Western blot法分别检测小鼠肺组织HMGB1 mRNA和蛋白表达;采集各组小鼠支气管肺泡灌洗液(BALF),ELISA检测BALF中白细胞介素6(IL-6)、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、IL-1β、转化生长因子β1(TGF-β1)的表达水平;免疫组织化学染色观察各组小鼠肺组织上皮钙黏蛋白(E-cadherin)和α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)的表达;Western blot法检测肺组织E-cadherin、α-SMA和HMGB1/核因子κB(NF-κB)信号通路中晚期糖基化终产物受体(RAGE)、Toll样受体4(TLR4)、TGF-β1表达和NF-κB p65磷酸化水平。结果成功建立香烟烟雾诱导的COPD小鼠模型,与COPD组相比,下调肺组织中HMGB1表达能显著改善小鼠的一般生命体征,促进其体质量增加,并能够改善小鼠肺组织病理学损伤;与对照组相比,COPD组、COPD联合si-NC组和COPD联合tiotropium组小鼠肺组织中HMGB1 mRNA和蛋白表达水平均明显增加,而COPD联合si-HMGB1组无明显HMGB1表达;且与对照组相比,COPD造模组小鼠BALF中IL-6、TNF-α、IL-1β、TGF-β1的分泌水平、肺组织中α-SMA、RAGE、TLR4、TGF-β1表达和NF-κB p65磷酸化水平均显著增加,而E-cadherin表达水平明显降低;而与COPD组或COPD联合si-NC组相比,COPD联合si-HMGB1组和COPD联合tiotropium组小鼠肺组织中上述指标变化均显著降低,后两组小鼠之间无显著差异。结论下调小鼠肺组织HMGB1表达能够通过抑制NF-κB途径减轻肺部炎症反应和EMT,从而改善香烟烟雾诱导的COPD疾病进展。