蜜蜂慢性麻痹病毒荧光定量RT-PCR检测方法的建立

为建立慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)快速诊断方法,本研究根据CBPV RNA依赖RNA聚合酶(RdRp)基因保守区设计特异性引物和TaqMan探针,建立了荧光定量RT-PCR检测方法。结果显示,以构建的重组质粒为标准品建立的TaqMan荧光定量PCR方法,标准曲线具有良好的线性关系,线性相关系数达0.998;该方法最低检出限为10拷贝/μL,与蜜蜂急性麻痹病毒等常见蜜蜂病毒无交叉反应,具有良好的灵敏性和特异性;组内和组间变异系数分别低于0.5%和2%,具有较好的稳定性。本研究建立的CBPV荧光定量RT-PCR检测方法,可用于实验室检测、流行病学调查和疫情监测。

山东省意大利蜜蜂慢性麻痹病毒感染情况调查及防控建议

蜜蜂慢性麻痹病是由蜜蜂慢性麻痹病毒引起的对蜂群造成毁灭性破坏的病毒病,该病的发生与蜂群的环境因素有密切关系。因此,明确蜜蜂慢性麻痹病的感染情况,有利于该病的预防。研究采用实地考察和高效灵敏的PCR检测相结合的方法,对山东省17个地市意大利蜜蜂蜂场的蜜蜂慢性麻痹病毒感染情况进行了调查。结果显示,山东省蜜蜂慢性麻痹病毒感染率为7.5%。根据调查结果提出了相应的防治措施,为山东省蜜蜂慢性麻痹病的防控以及养蜂业的健康持续发展提供了科学的理论依据。

2014-2015年中国部分地区蜜蜂慢性麻痹病病毒流行病学调查及系统发育分析

【目的】前期笔者课题组对北京地区蜂群进行了常见病毒感染情况的调查,发现蜜蜂慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)在病蜂群中的检出率显著高于在健康蜂群中的检出率,据此推测可借助病蜂群对CBPV进行研究。鉴于目前国内CBPV流行病学数据的匮乏,论文旨在了解中国主要养蜂区病蜂群中CBPV的分布及遗传变异情况,以期为该病的防控提供依据。【方法】2014—2015年间从四川、安徽、浙江、河南、山东、山西、黑龙江、北京8个主要养蜂省(市)共采集到136份病蜂样品,采用RT-PCR法检测CBPV的感染情况。每份样品随机选取10只蜜蜂,取其头部,利用Trizol法提取样品的总RNA;通过凝胶电泳及Nanodrop ND-2000对总RNA的质量进行定性与定量检测。以样品总RNA为模板合成cDNA第一条链,而后以cDNA为模板扩增CBPV的特异性片段。所有扩增片段均进行琼脂糖凝胶电泳,对部分阳性样品进行测序与序列分析;通过扩增片段与阳性片段的比对确定每份样品中CBPV的检出情况。为研究CBPV中国分离株的系统发育特性,以样品cDNA为模板,扩增全部阳性样品的Rd RP基因(RNA-dependent RNA polymerase)特异性片段,而后进行测序与序列分析。将序列提交至GenBank获取基因登录号。对获得的分离株的Rd RP基因与GenBank上发表的相应序列进行比较分析,利用CLUSTAL W软件对全部参考序列及本研究获得的分离株的对应序列进行同源性比对,应用软件MEGA 6.0中邻接法(neighbor-joining)对所有序列绘制系统进化树。【结果】蜜蜂头部总RNA质量检测结果显示,所有样品的总RNA相对完整,且浓度处于(980.5±37.1)ng·μL^(-1)范围内,A260/A280在1.92—2.24。CBPV感染率检测结果显示,136份病蜂样本中共检出120份CBPV阳性样品,阳性率高达88.2%。全部阳性样品的电泳结果可见与预期大小一致的特异性片段,其序列与靶序列同源性达到99%以上。Rd Rp基因特异性片段的序列分析表明,本研究共获得8个CBPV中国分离株,其序列与多种其他地区的CBPV的相应序列同源性达到97%以上。中国分离株GenBank登录号分别为KT374042—KT374049。对其系统进化树分析后可知,世界流行的CBPV分离株可分为5个进化分支:两个欧洲分支(European clade 1、European clade 2),两个中日混合分支(Chinese-Japanese clade 1、Chinese-Japanese clade 2)和一个美国分支(US clade)。获得的8个中国分离株均存在于同一进化分支上,且与之前得到的6个江苏分离株以及4个日本分离株共同形成两个混合分支。【结论】进一步证实了中国病蜂群中普遍存在CBPV感染;系统进化关系表明,目前国内CBPV分离株之间的遗传关系无明显地域性特征,与日本分离株亲缘关系较近。有关CBPV的监测工作亟需加强,且其预警作用需引起重视。

慢性蜜蜂麻痹病毒中国株RNA1序列克隆及进化分析

慢性麻痹病是成蜂中的一种传染性疾病,患病蜜蜂呈现一些神经性行为如颤抖、爬行,能引起两种不同的症状,可导致蜜蜂体表发黑光亮无毛或腹部膨大。该病的病原体是慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,以下简称CBPV),对其致病性起决定性作用的是RNA依赖RNA聚合酶(RdRp),而RdRp位于CBPV基因组的RNA1片段上。为了深入理解CBPV的感染特点及致病机理,本文克隆中国北京株CBPV RNA1的全基因组序列并对其进行了遗传进化分析,为深入开展病毒研究提供信息数据。

慢性蜜蜂麻痹病的分布危害及季节特征和防治药物

慢性蜜蜂麻痹病是一种危害成年蜂的病毒病,世界许多国家普遍都有此病分布,1982～1985年调查表明,在我国,慢性麻痹病的发病率占成年蜂病的66.8％。该病严重影响密蜂的寿命,造成蜂群群势下降,蜂蜜和王浆产量降低。发病与季节关系密切,一年之中,以春、秋季节发病为重。应用“抗蜂病毒一号”药物防治该病,对蜜蜂安全,疗效达90％以上,现已在全国推广,经济效益和社会效益显著。

一例慢性蜜蜂麻痹病的诊断报告

慢性麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)感染主要引起成年蜜蜂神经麻痹痉挛,身体颤抖,丧失飞行能力,出现爬行现象,俗“爬蜂病”,疾病发展至后期会出现腹部发黑,所以又被称为黑蜂病、瘫痪病。目前CBPV已经呈现出一种世界范围流行,在欧洲、美洲、亚洲均有发现,而且在生产的蜂蜡中可作为CBPV的传播媒介,可能因巢脾的重复使用而导致CBPV传播得进一步扩大。目前在我国,东方蜜蜂蜂场和西方蜜蜂蜂场检测样本中CBPV感染普遍存在,表明CBPV已严重威胁我国养蜂业发展。

昆虫病毒分类最新进展

自1970年国际病毒分类与命名委员会(IC-TV)成立起,就将昆虫病毒纳入整个病毒分类系统中进行分类与命名。从此昆虫病毒有了与其它病毒进行比较的机会。到1982年的十余年里,ICTV先后四次讨论对包括昆虫病毒在内的整个病毒界(Kingdom: Vita)进行分类和命名。谢天恩(1986)曾对1982年以前昆虫病毒分类状况做了详细的综述。近年来,昆虫病毒的研究又取得了许多新进展。

蜜蜂麻痹病研究进展

蜜蜂麻痹病是一种由慢性麻痹病毒或急性麻痹病毒引起的成年蜜蜂传染病,给养蜂生产带来严重损失。发病的蜜蜂通常表现为身体颤抖,丧失飞行能力,出现爬行现象。本文对急性麻痹病毒、慢性麻痹病毒以及麻痹病的传播途径、患病特征和检测技术等进行综述,以期为生产实践中防控和治疗蜜蜂麻痹病提供理论依据。

蜜蜂病毒病（一）

蜜蜂病毒病（一）［加拿大］斯科特──杜普雷，Ｃ．等迄止目前已鉴定出２０种蜜蜂病毒。在美国和加拿大约有１２种病毒侵染蜜蜂。病毒的鉴定是昂贵的，大多数养蜂者只能根据所观察到的症状进行诊断。以下对已知存在于北美大陆的较重要的蜜蜂病毒引起的症状、传播方式和现...

蜜蜂麻痹病的发生和防治

蜜蜂麻痹病,又叫黑蜂病、瘫痪病,是由慢性麻痹病毒或急性麻痹病毒引起的一种成年蜜蜂传染病,分为腹部膨大型和体黑瘦小型。一旦蜂群发病,表现症状为行动迟缓,身体瘦小,头尾发黑,颤抖,病蜂常伏于蜂箱壁及巢门前。这种病传染快、病性重,比较顽固难治,对蜜蜂的危害很大。如不及时防治,轻则造成蜂蜜严重减产,重则会使蜜蜂出现大量死亡。

慢性蜜蜂麻痹病毒SP1蛋白的原核表达及免疫原性分析

慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)主要侵袭成年工蜂,造成患病蜜蜂神经麻痹,丧失飞行能力,出现爬行现象。CBPV据推测有两个结构蛋白SP1和SP2,通过对SP1蛋白的免疫原性探索,为SP1蛋白的功能研究和CBPV生物制剂研制奠定基础。本研究根据大肠杆菌密码子的偏嗜性,对CBPVSP1基因进行优化和合成,将其克隆至原核表达载体pET-32a,获得重组表达质粒pET-Opti-SP1。将重组质粒转化至宿主菌BL21(DE3)中诱导表达,用SDS-PAGE和Western Blot方法对该蛋白进行分析和鉴定,然后对最佳表达条件进行摸索。在此基础上,用纯化后的SP1蛋白免疫接种BALB/c小鼠,同时设置纯化病毒组、pET-32a对照组和空白对照组,检测免疫小鼠的淋巴细胞增殖指数(SI)和血清中抗体水平。结果表明,首次成功表达和纯化了重组SP1蛋白,且该蛋白能诱导产生特异性抗CBPV的抗体,促进淋巴细胞的增殖和提高IL-4、IL-10、IFN-γ水平,具有较好的免疫原性。本研究为进一步研究CBPV SP1蛋白的功能和防治CBPV生物制剂的研发提供了帮助。

慢性蜜蜂麻痹病毒Ch1株的编码区测序及其序列的分析

对中国分离株慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)Ch1编码区全基因序列进行克隆、测序、分析。利用RT-PCR方法和生物信息学软件,对本实验室分离到的Ch1株CBPV编码区的基因序列进行克隆,测序,与GenBank收录的CBPV毒株进行同源性比较,并以RdRp为靶基因构建了遗传进化树。结果显示,CBPV Ch1株的编码区由RNA1(GenBank No.KU950353)和RNA2(GenBank No.KU950354)两部分构成,全长5 979个核苷酸。其中RNA1片段全长3 674个核苷酸,编码3个开放阅读框,RNA2片段全长2 305个核苷酸,编码4个开放阅读框,RNA2片段中ORF2和ORF3,可能编码两个结构蛋白,分别命名为SP1和SP2。RNA1和RNA2核苷酸序列与2005年法国分离株Fr2核苷酸序列同源性最高,分别为96.1%和95.5%,但预测蛋白SP1核苷酸序列同源性与2006年乌拉圭分离株Ur1核苷酸序列同源性最高(96.9%)。基于RdRp为靶基因进行了遗传进化分析表明,Ch1株与Fr2株位于同一分支,且在该区域,Ch1株与Fr2株的核苷酸序列同源性最高(96.5%)。本实验成功分离到一株CBPV(KU950353,KU950354),并命名为Ch1株,完成了Ch1株CBPV的编码区的序列测定以及核苷酸序列与推导的氨基酸序列同源性比较及遗传进化分析,为研究CBPV的致病机制和免疫机制提供重要信息。

慢性蜜蜂麻痹病毒半套式PCR检测方法的建立

参考NCBI(National Center of Biotechnology Information)已发表的慢性蜜蜂麻痹病毒(Chronic bee paralysis virus,CBPV)的全基因序列,设计3条检测CBPV的特异性引物,建立CBPV半套式PCR(Polymerase Chain Reaction)检测方法,对其外引物退火温度(52、54、56和58℃)、内引物退火温度(48、50、52和54℃)、引物浓度(0.1、0.2和0.4mmol/L)和ExTaq酶体积(0.25、0.5和1μL)进行优化,并对优化后的方法进行了特异性、敏感性验证,同时,利用该方法对20份临床样品进行检测。结果表明,该半套式PCR最佳外引物退火温度、内引物退火温度、引物浓度和ExTaq酶体积分别为56℃、50℃、0.2mmol/L和0.25μL;感染CBPV与健康蜜蜂、急性蜜蜂麻痹病毒(Acute paralysis virus,ABPV)、中蜂囊状幼虫病病毒(Chinese sacbrood bee virus,CSBV)、黑蜂王台病毒(Black queen cell virus,BQCV)、蜜蜂残翼病毒(Deformed wing virus,DWV)的cDNA均无交叉反应,检出最低下限为10-3pg;从20份临床样品中检出4份阳性。说明建立的CBPV半套式PCR检测方法具有快捷、敏感、特异等优点,可用于CBPV感染的临床诊断和流行病学调查。

外媒

CBPV呈上升趋势英国慢性蜜蜂麻痹病毒(CBPV)的增加已在一篇新论文中得到证实,该论文认为,进口蜂王的输入、庞大的蜂群、英国气候的无常(尤其在春季)以及一种新的病毒株可能是关键因素。