胶质类芽孢杆菌与慢生大豆根瘤菌复合接种效果评价

【目的】胶质类芽孢杆菌(Paenibacillus mucilaginosus)和慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)作为微生物肥料的生产菌种,凭借其良好的解钾溶磷促生效果及共生固氮功能,广泛应用于农业生产,目前对其单一菌种促生或固氮效果及机理已有较多报道。本研究旨在开展胶质类芽孢杆菌与慢生大豆根瘤菌复合接种研究,评价其接种效果,并对作用机理初探,为开发功能复合型微生物菌剂,丰富微生物肥料产品提供技术支持。【方法】田间小区试验在山东省泰安市农业科学院邱家店科研基地进行。设T1(空白对照),T2(胶质类芽孢杆菌3016单接种),T3(慢生大豆根瘤菌5136单接种),T4(胶质类芽孢杆菌3016和慢生大豆根瘤菌5136复合接种)和T5(常规施肥)5个处理,4次重复。分析大豆播种前(0 d)、花荚期(50 d)、鼓粒期(80 d)和成熟期(110 d)土壤肥力、土壤微生物区系的变化及对大豆品质的影响。【结果】接种胶质类芽孢杆菌和大豆根瘤菌的各处理均能提高单株籽粒重、产量和收获指数,其中以复合接种处理效果最优,分别高于对照处理12.8%、9.3%和41.0%,且差异显著;该处理下,大豆茎叶和籽粒的氮、磷、钾含量都具有较高水平,特别是籽粒钾、茎叶氮和茎叶磷,分别比对照提高了5.7%、9.3%和38.5%,复合接种能显著提高大豆产量和品质。在土壤肥力方面,施用胶质类芽孢杆菌、根瘤菌和化学肥料对土壤全氮、速效磷、速效钾和有机质均有一定程度的改善和提高,其中以复合接种效果最佳,成熟期各指标分别比对照提高了16.5%、43.7%、8.5%和15.5%;相对于化学肥料,施用胶质类芽孢杆菌和慢生大豆根瘤菌的各处理,对土壤肥力提高效果更有持久性且对土壤p H影响更小,其中复合接种能显著改善土壤肥力。除此之外,复合接种还能够丰富土壤微生物群落多样性,提高微生物总量,尤其是增加细菌和放线菌数量,抑制真菌增长,有利于土壤实现由"真菌型"向"细菌型"的良性转变。典型对应分析结果表明,p H和速效钾是引起土壤细菌群落变化的主控环境因子。【结论】胶质类芽孢杆菌和慢生大豆根瘤菌复合接种不仅能够改善大豆品质、增加产量,还能提高土壤肥力、改善土壤微生物区系,是一种节本增效的施肥方式,具有良好的应用前景。

我国南北大豆产区慢生大豆根瘤菌的遗传多样性和系统发育研究

利用16S rRNA基因RFLP、16S rRNA基因序列分析以及16S-23S rRNA IGS PCR RFLP技术对分离自我国南北大豆产区的慢生大豆根瘤菌进行了群体遗传多样性和系统发育研究。16S rRNA基因PCR RFLP分析以及16S rRNA基因序列分析结果表明:所有供试慢生大豆根瘤菌可分为B.japonicum和B.elkanii两个类群,其中属于B.japonicum的为优势种群,占供试菌株的91%,属于B.elkanii的仅占9%,多样性水平较低。16S-23S rRNA IGS PCRRFLP研究结果表明:属于B.japonicum的慢生根瘤菌具有较丰富的遗传多样性,在69%的相似性水平上可分为群Ⅰ和群Ⅱ两大类群。群I的菌株以分离自黑龙江和河北等北部区域的菌株为代表,群Ⅱ的菌株以分离自广西和江苏等南部地域的菌株为代表,反映出明显的地域特征。两群菌株在系统发育上均与USDA6、USDA110和USDA122等B.japonicum的模式或代表菌株有差异。

慢生大豆根瘤菌与竞争结瘤相关的lrp基因的克隆

通过对重组质粒 pGXN30 0中的 2 .3kbEcoRI片段测序分析发现 ,其中含有一完整的lrp基因和部分 putA基因 ,与King等报道的B .japonicum的lrp基因DNA序列有 88%同源性。应用Tn5gusA5定位诱变的方法获得了gusA基因表达的根瘤菌lrp基因突变体GX2 0 10 8。植株试验表明 ,突变株结瘤时间明显推迟 。

慢生大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)的克隆和序列测定

以苜蓿根瘤菌Rm10 2 1的 phaC基因突变体菌株Rm1114 4 (phaC ::Tn5 - 2 33)为受体菌 ,通过功能互补 ,成功地从构建的Bradyrhizobium japonicum USDA110基因文库中 ,筛查到能与Rm1114 4互补 ,使之恢复在以乙酰乙酸为唯一碳源的M9培养基 (M9-AA)平板上 5d形成明显可见菌落 ,以及在MOPS平板上形成粘液型菌落的表型的重组粘粒 pDC2 ;经证实 ,该粘粒带有 phbC基因 .完成了该基因的全序列测定并已在GenBank登记 ,登记号为AY0 775 80 .B .japonicumphbC基因由 180 3碱基对组成 ,GC含量 6 1.8% ,AT含量 38.2 % ;编码 6 0 0个氨基酸 ,Mr=6 6 .95× 10 3 .图 3表 3参

慢生大豆根瘤菌存在碱性磷酸酶的报告

利用磷饥饿的方法,在一株慢生大豆根瘤菌中发现可作为胞周蛋白标记酶的高活性碱性磷酸酶。该酶属诱导型,当磷酸盐浓度降至55μM时诱导已相当充分。培养物上清液中没有酶活。使用溶菌酶——EDTA和冷渗冲击的方法均没有提取出该酶。推测该酶可能与胞周空间外侧、外膜内侧的脂多糖结合。

pH对土壤中土著快、慢生大豆根瘤菌结瘤的影响

The effect of pH on the nodulation of Sinorhizobium fredii and Bradyrhizobium japonicum was examined by analy- zing the indigent soybean rhizobia,predominant indigent rhizobia,and specific rhizobia,respectively.The results showed that very acid and very alkaline environment could retard the nodulation and inhibit the growth of the rhizobia.Sinorhizohium fredii could endure environment more strongly than Bradyrhizobium japonicum,and had a high competitive nodulation capacity.Bradyhizobium japonicum could endure acid environment more strongly than Sinorhizobium fredii.In very acid and very alkaline environment,the nodulation capacity of S.fredii and B.japonicum was mainly determined by their physiological characteristics.

导入dctABD和 parCBA/DE基因提高大豆慢生根瘤菌固氮效率和稳定性的研究

以ｐＬＡＦＲ３为载体构建重组质粒ｐＨＮ２０７，携带有来自首苜蓿根瘤菌（Ｓｉｎｏｒｈｉｚｏｂｉｕｍｍｅｌｉｌｏｔｉ）的四碳二羧酸转移酶基因 ｄｃｔＡＢＤ、来自 ｐＴＲ１０２的ｐａｒＣＢＡ／ＤＥ基因和标记发光酶基因 ｌｕｘＡＢ。利用 ２亲本杂交法，将重组质粒 ｐＨＮ２０７导入大豆慢生根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＴＡ１１和ＣＢ１８０９，分别考察了转移接合子中外源重组质粒在人工培养条件和共生条件下的稳定性，结果表明ｐａｒ基因的引入明显提高ｐＬＡＦＲ３在ＴＡ１１和ＣＢ１８０９中的稳定性。ｄｃｔＡＢＤ基因可显著提高ＴＡ１１和ＣＢ１８０９在大豆黑龙３３、宁镇一号和渝豆一号上的共生固氮能力，使结瘤植物的地上部分干重（生物量）和总氮量等指标较对照组有显著提高。

慢生型大豆根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum)聚羟丁酸合成酶基因(phbC)突变体的构建及其特性

通过转座子Tn5诱变和同源重组 ,构建了BradyrhizobiumjaponicumUSDA110聚羟丁酸合成酶基因 (phbC)突变体 .序列测定确定了转座子插入的精确位置 ,所获得的 4个转座子诱变的质粒其Tn5插在 phbC基因内两个相距仅 9bp的位点 .被Southern和PCR证实的突变体菌株仍能产生相当于野生型菌株 12 .97%～ 2 5 .10 %的PHB ,并且在突变体和野生型菌株总DNA杂交图上都呈现出一条约 5kb的阳性带 ,推测在B .japonicum基因组中存在不止一个聚羟丁酸合成酶基因 .图 3表 4参

慢生型大豆根瘤菌的遗传多样性研究

采用选择性扩增片断长度多态性 (简称AFLP)DNA指纹技术对来自泰国北部的 2 45株慢生型大豆根瘤菌进行遗传多样性的研究 .通过AFLP图谱揭示出该地区的慢生型大豆根瘤菌有较显著的遗传多样性 .从 2 45株中选择出 92个代表株用计算机进行的树状图分析结果表明 ,所分析的菌株在 82 %的相似性水平上聚类成 8个群 .对这 92个代表株的部分菌株和慢生型大豆根瘤菌的参比菌株进行多聚酶链反应 (PCR)扩增的 16SrDNA的 4种限制性内切酶长度多态 (简称 16SrDNAPCR RFLP)分析 ,得出 2个不同的 16SrDNAPCR RFLP类型的菌株 ,分别与慢生型大豆根瘤菌的参比菌株Bradyrhizobiumjaponicum和Bradyrhizobiumelkanii相同 .图 1表 2参

利用Tn5 gusA5对大豆慢生根瘤菌lrp基因的诱变

通过对重组质粒ｐＧＸＮ３００中的 ２．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ片段测序分析发现，其上有一完整的ｌｒｐ基因和部分 ｐｕｔＡ基因，与 Ｋｉｎｇ ＮＤ等［１］报道的 Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ的ｌｒｐ基因ＤＮＡ序列有 ８８％同源性。利用 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５定位 诱变方法，对质粒ｐＧＸＮ３００进行插入诱变，得到２．３ｋｂ ＥｃｏＲＩ片段上有Ｔｎ５ｇｕｓＡ５插入位点的质粒ｐＧＸＮ３００－ Ｔ３８，将ｐＧＸＮ３００－Ｔ３８转移到大豆馒生根瘤苗（Ｂ．ｊａｐｏｎｉｃｕｍ）ＧＸ２０１中，得到的ＧＸ２０１转移接合子与不相容 质粒ｐＰＨ１ＪＩ发生同源双交换。通过抗性及ｇｕｓＡ活性检测，筛选到一ｌｒｐ基因突变株。Ｓｏｕｔｈｅｍ杂交分析证 明这突变株的 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５插入确实是同源交换而不是转座产生，表明 Ｔｎ５ ｇｕｓＡ５ 诱变可以应用于大豆慢生根 瘤菌中的突变林筛选。

慢生型大豆根瘤菌染色体的16kb EcoRⅠDNA片段的亚克隆测序分析

亚克隆测序分析发现 ,在 Bradyrhizobium japonicum的 GX2 0 1菌株染色体的 1 6kb Eco R DNA区段上含有一个与 put A基因同源的基因的 ORF30 54( Open Reading Frame) .该基因 ORF长 30 54bp,在核苷酸水平上与已报道的 put A基因有 94 %一致性 .其推断性的编码产物在氨基酸水平上与 put A编码产物脯氨酸脱氢酶 ( Pro DH)有 95%一致性 .利用 Tn5gus A5诱变的方法获得了该同源基因的标记置换突变体 ,该突变体在液体培养基 ( YMA)

慢生型大豆根瘤菌nfeC基因的定位

在前期工作中 ,从慢生型大豆根瘤菌菌株 GX2 0 1的基因文库中筛选到一个含 nfe C基因同源片段的重组质粒 p GXN2 0 1。在本工作中 ,将 nfe C基因同源片段定位在 4 kb Cla I+Xba I片段上。对该片段的部分序列分析表明与已报道的 nfe C基因具有

慢生型大豆根瘤菌nfeC基因的克隆及序列分析

通过亚克隆 ,将重组质粒 pGXN2 0 1中与nfeC基因同源的片段定位在 4kbClaI+XbaI片段上。序列分析表明该片段全长 40 38个碱基。该片段上含有一个完整的阅读框架。该阅读框架编码一个含 2 75个氨基酸的多肽 ,与已报道的nfeC基因编码的蛋白质具有 93%的同源性。

根瘤菌与促生菌双接种对大豆生长和土壤酶活的影响

【目的】慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌单一菌株固氮或促生效果及机理已有较多研究,但两者双接种对作物的作用和增产机理尚未有所报道。本研究以慢生大豆根瘤菌5136与胶质类芽孢杆菌3016为研究对象,通过田间小区试验研究根瘤菌与促生菌不同施用模式对大豆生长和土壤酶活的影响,以期为开发新型高效复合菌剂提供理论依据。【方法】试验设对照(T1)、接种胶质类芽孢杆菌3016菌剂(T2)、接种慢生大豆根瘤菌5136菌剂(T3),胶质类芽孢杆菌3016和慢生大豆根瘤菌5136双接种(T4)和常规施肥(T5)5个处理,分别于大豆不同生育期调查大豆的农艺性状和结瘤状况,测定土壤酶活性,用BOX-PCR技术监测慢生大豆根瘤菌5136的占瘤率。【结果】1)在大豆成熟期,双接种(T4)处理的大豆单株分枝数、单株粒数、收获指数和产量均为最高,分别比T1高11.3%、9.7%、41.0%和9.3%,且单株空荚数最低,比T1降低了44.0%。2)在花荚期,双接种(T4)处理的占瘤率为25.4%,比T3处理高8.0%,且单株根瘤数和单株根瘤干重均为最高,分别比T1高41.6%和47.1%;说明双接种处理下,胶质类芽孢杆菌3016能够促进慢生大豆根瘤菌5136结瘤固氮。3)接种微生物菌剂均可不同程度地提高土壤酶活性,以双接种(T4)处理的效果最为显著,在大豆成熟期,土壤过氧化氢酶、脲酶和蔗糖酶活性均为最高,分别比对照高12.9%、8.9%和9.4%。4)相关性分析表明,土壤酶活性与大豆收获指数显著正相关或极显著正相关(P<0.01或P<0.05),其中过氧化氢酶与产量显著正相关;单株根瘤数和单株根瘤干重均与收获指数和蔗糖酶活性呈极显著正相关,与产量呈显著正相关。【结论】慢生大豆根瘤菌和胶质类芽孢杆菌双接种可以促进大豆生长,显著增加大豆的单株分枝数、单株粒数、收获指数和占瘤率,降低单株空荚数,增加大豆产量,同时可显著提高相关土壤酶活性,是一种节本增效的农艺措施。

慢生型大豆根瘤菌菌株GX201的脯氨酸脱氢酶基因(putA)的分子克隆

根据已报道的脯氨酸脱氢酶基因（ｐｕｔＡ）序列，通过ＰＣＲ方法，从慢生型大豆根瘤菌菌株ＧＸ２０１的总ＤＮＡ中扩增到—ＰＣＲ产物。序列分析表明，该ＰＣＲ产物的长度为４１８ｂｐ，与已报道的ｐｕｔＡ基因具有９３．５％的同源性。以广谱寄主范围质粒ｐＬＡＦＲ３为载体，在大肠杆菌ＤＨ５α中构建了ＧＸ２０１的基因文库，并以该ＰＣＲ产物为探针，从基因文库中筛选到一重组质粒ｐＧＸＮ３００。

单株根系来源的土著大豆慢生根瘤菌多样性

本文对由１株大豆根瘤分离、鉴定的１２个土著大豆慢生根瘤菌（Ｂｒａｄｙｒｈｉｚｏｂｉｕｍｊａｐｏｎｉｃｕｍ）菌株进行了种内多样性分析。在ＹＥＭ琼脂培养基上观察菌落大小不同（直径≥１０ｍｍ至≤０５ｍｍ）的菌株，有形成粘稠而半透明的Ｍ型菌落和稀薄而透明的Ｗ型菌落。以ＥＬＩＳＡ鉴定血清类型，分为ＬＬ１９血清族（包括Ｓｚ１１２ｓ）血清组和Ｓｚ１１９ｓ血清型及其他血清组）和非ＬＬ１９血清族（包括Ｓｚ１１３ｓ和Ｓｚ１２１ｓ两血清型及未知血清型）。以Ｄｉｇｏｘｉｇｅｎｉｎ标记的ｐＭＪＳ１２为探针检测菌株染色体ＤＮＡ的ＥｃｏＲＩ消化产物的分子杂交谱，出现称为Ⅰ型的９６ｋｂ和Ⅱ型的６４ｋｂ两种类型的单一分子杂交带。ＨＰ５８９０Ａ气相色谱分析细胞脂肪酸，检出８种成分。其中，Ｃ１４∶１、Ｃ１８∶１和Ｃ１４∶０存在于所有供试菌株中，为不同于快生根瘤菌的３种主要成分。

野大豆快生型根瘤菌共生固氮及其生理生化特性研究

实验围绕野大豆———快生型根瘤菌共生固氮和抗药、耐盐、代谢产物等生理生化特性方面进行检测和研讨,旨在为筛选抗逆性强、高固氮活性菌株和农业应用提供理论依据.

快生型大豆根瘤菌的研究

根瘤菌是一类可以在豆科植物上结瘤的杆状细菌,它们是重要的土壤微生物类群。曲于根瘤菌与豆科植物共生时,能够把空气中的氮气转化成氨及其化合物,供给植物利用,因而与人类的生活、生产有十分密切的关系。人类对根瘤菌的研究已将近一百年,而把根瘤菌应用到农牧业生产上也有几十年的历史了。可以说,根瘤菌在农牧业生产上发挥了重要的作用。现在,世界上许多国家的生物固氮研究项目中,根瘤菌一直是个重要的方面。

以luxAB为报告基因的大豆根瘤菌的竞争结瘤研究

将来自pHN101的luxAB基因和来自pTR102的parCBA /DE基因,经过一系列中间载体整合到PLAFR3上构建成广宿主、稳定性质粒PHN158。通过三亲本杂交将pHN158导入费氏中华根瘤菌得到4株能在癸醛的激发下发出荧光的转移接合子WZRL、HWRL、HZRL和WWRL。将它们与3株大豆慢生根瘤菌WHB1、WHB2和WWB组配成12对组合,并以黑龙33和Williams为宿主以luxAB为报告基因进行竞争结瘤试验。结果表明,费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的平均竞争结瘤能力相当;同类型根瘤菌不同菌株之间的竞争结瘤能力存在着显著的差异;同时根瘤菌的竞争结瘤能力也明显受到宿主的影响。表明费氏中华根瘤菌与大豆慢生根瘤菌之间的竞争结瘤是一个菌株之间、菌植之间复杂的相互作用的过程。

大豆根瘤菌研究的新进展

大豆根瘤菌可以和大豆植株共生结瘤,固定空气中的氮素供大豆植株吸收利用,从而促使大豆增产。对大豆根瘤菌的研究也在逐步深入。过去的研究把根瘤菌属分为快、慢二个类型。快生型根瘤菌,如苜蓿根瘤菌(Rhizobium meliloti)、豌豆根瘸菌(R.leguminosarum)、三叶草根瘤菌(R.trifolii)等,繁殖一代需时间为2—4小时。慢生型根瘤菌,如大豆根瘤菌(R.japonicum),羽扇豆根瘤菌(R.lupini)等繁殖一代所需时间为6小时或6小时以上。