靶向人c-Cbl基因重组干扰慢病毒与过表达腺病毒载体的构建、鉴定以及病毒功效研究

目的:构建可调控c-Cbl基因表达的重组慢病毒与腺病毒并评估其功效。方法:应用基因重组技术,分别构建靶向人c-Cbl基因的干扰慢病毒和过表达腺病毒。采用定量PCR和免疫印迹法检测病毒感染后白血病细胞(HL60、THP1)c-Cbl基因表达与转录本的变化。结果:3个靶向人c-Cbl基因的重组干扰慢病毒载体经测序验证构建成功,包装的病毒滴度均大于1×10^(8)TU/ml,其中shRNA-2号慢病毒干扰效率最高,白血病细胞感染后c-Cbl基因的表达约下调95%,CBL蛋白的表达约下调60%;同时,靶向人c-Cbl基因的重组过表达腺病毒载体也经测序验证构建成功,包装的病毒滴度大于1×10^(9)TU/ml,细胞感染腺病毒后,c-Cbl基因表达可瞬时上调约10倍,CBL蛋白表达约上调1.5倍。结论:重组干扰慢病毒和过表达腺病毒均可高效感染白血病细胞,并能分别下调和上调c-Cbl基因与CBL蛋白的表达,为后续研究肿瘤细胞内c-Cbl基因功能打下前期基础。

常用血液学指标动态变化对乙型肝炎病毒相关性慢加急性肝衰竭预后的预测价值

目的本研究探讨常用血液学指标的动态变化对乙型肝炎病毒相关性慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)预后的预测价值。方法采用回顾性病例对照研究,纳入2018年1月-2022年10月于上海交通大学医学院附属瑞金医院确诊和治疗的HBV-ACLF患者137例。根据患者入院后28 d是否生存,将其分为死亡组(69例)与生存组(68例)。收集患者基线与入院后14 d的生物化学指标、血常规、CRP、降钙素原(PCT)等指标,计算并比较入院后14 d的各项指标与基线的差值。采用单因素和多因素分析影响HBV-ACLF患者预后的因素,并绘制ROC曲线评估其预测价值。结果死亡组患者年龄显著高于生存组(P<0.05)。入院后14 d,死亡组患者总胆红素(TBil)、血白细胞计数(WBC)、中性粒细胞百分比(NE%)、CRP、PCT、血清肌酐(sCr)和INR的增高值均显著大于生存组患者(P值均<0.001)。多因素分析结果显示,血清TBil、WBC、NE%、sCr、PCT和INR增高是影响HBV-ACLF预后的独立危险因素(P值均<0.05)。绘制ROC曲线结果显示患者入院后14 d血清TBil、WBC、NE%、sCr、PCT、INR较基线增高的程度对患者预后有较高的预测价值(P值均<0.001)。结论患者入院后14 d的血清TBil、WBC、NE%、sCr、PCT、INR较基线增高程度对HBV-ACLF的预后有一定的预测价值。

MAFA-PDX1过表达慢病毒感染人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞的分化

背景:干细胞来源胰岛β细胞移植被认为是治疗1型糖尿病的有效手段。人脐带间充质干细胞是理想的细胞来源,但其向胰岛β细胞分化的效率不高。目的:研究MAFA、PDX1修饰促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化的潜能。方法:构建MAFA-PDX1过表达慢病毒载体,用细胞形态学、RT-qPCR法、双硫腙染色比较3种方案[方案A:单纯慢病毒组;方案B:先药物(尼克酰胺、β-巯基乙醇)诱导再加慢病毒组;方案C:慢病毒和药物诱导同时进行组]诱导人脐带间充质干细胞分化为胰岛素分泌细胞的效率和潜能。结果与结论:(1)细胞形态学改变:经3种方案诱导后细胞形态均发生了改变,方案B在诱导第11天细胞聚集生长最为明显,出现聚集生长的胰岛样细胞团;(2)RT-qPCR检测胰岛相关基因的表达差异:同一诱导时间点3种方案横向比较,在诱导第5天,方案C的MAFA和PDX1基因表达量最高,方案B的GCG基因表达量最高;在诱导第11天,方案B的MAFA、PDX1基因表达量以及INS和GLUT2基因表达量最高;(3)双硫腙染色鉴定锌离子:3种方案诱导第11天部分细胞被双硫腙染成棕红色,其中方案B中部分小岛状细胞被染成棕红色,颜色较深(阳性表达);(4)结果表明,MAFA和PDX1共过表达可促进人脐带间充质干细胞向胰岛素分泌细胞分化;MAFA-PDX1基因修饰联合药物诱导方案优于单纯基因修饰方案。

慢病毒介导的稳定表达鸭干扰素-γ细胞株的构建

干扰素-γ是一种具有抗病毒活性和免疫调节能力的细胞因子之一。为了建立稳定表达鸭干扰素-γ(duIFN-γ)的细胞系,本研究优化并合成了duIFN-γ基因,插入到慢病毒表达载体plenti-GIII-CMV-GFP-2A-Puro,获得重组质粒plenti-IFN,将plenti-IFN与辅助质粒共转染包装细胞293T,筛选出了携带duIFN-γ基因的重组慢病毒rlenti-IFN,将该病毒感染中国仓鼠卵巢(Chinese hamster ovary, CHO)细胞,利用有限稀释法和抗性加压筛选法,筛选出了30个具有嘌呤霉素抗性基因的单克隆细胞系。利用RT-qPCR荧光定量法对这些单克隆细胞的duIFN-γ mRNA水平进行检测,筛选出了duIFN-γ mRNA水平最高的1个单克隆细胞,对其进行扩大培养,获得了1株稳定细胞系。Western blot检测结果表明,duIFN-γ稳定表达于该细胞系中。本研究获得了1株稳定表达duIFN-γ蛋白的细胞系,该研究为开展duIFN-γ生物学功能研究、建立duIFN-γ检测方法及生产廉价鸭(禽)用干扰素奠定了基础。

牦牛六个多能性相关转录因子OSKMNL的克隆和多顺反子慢病毒载体的构建

旨在克隆牦牛6个多能性相关转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Nanog、Lin28(OSKMNL),构建多顺反子慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry。本研究以1头3~5月龄健康雌性牦牛胎儿的生殖嵴组织为研究材料,利用RT-PCR技术克隆牦牛6个多能性相关转录因子OSKMNL的完整编码区序列,并对其进行生物信息学分析;应用无缝克隆技术构建慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;用293T细胞包装慢病毒,将包装好的慢病毒感染293T细胞和牦牛成纤维细胞,通过观察荧光表达和RT-PCR技术检测病毒感染情况(试验分为病毒感染组和空白对照组,每个组设置3个重复)。结果表明,克隆的牦牛OSKMNL基因的编码区大小分别为1 083、963、1 434、1 320、903、618 bp;序列分析发现牦牛OSKMNL氨基酸序列与黄牛的同源性在99%以上,其中Sox2、Klf4、c-Myc与黄牛的同源性为100%;进化树结果显示牦牛与黄牛、瘤牛、水牛的亲缘关系最近,与小鼠的亲缘关系最远;蛋白结构预测发现牦牛的6个转录因子OSKMNL都具有该基因家族相应蛋白功能的结构,比如POU结构域、HOX结构域、HMG结构域、Znf-C2H2结构域、HLH结构域、CSP结构域等;构建了慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;慢病毒感染293T细胞发现试验组表达红色和绿色荧光;慢病毒感染牦牛成纤维细胞发现试验组表达红色和绿色荧光,RT-PCR结果显示预期大小的条带。本研究成功克隆了牦牛的6个多能性相关转录因子OSKMNL;构建了分别携带牦牛3个转录因子的慢病毒载体FUW-teto-OSM-EGFP和FUW-teto-KNL-mCherry;包装的慢病毒能感染牦牛成纤维细胞。有利于推动多能性相关转录因子OSKMNL在牦牛干细胞中的应用,也为后续研究牦牛iPSC做准备。

乙肝病毒相关慢加急性肝衰竭患者中PMN-MDSC的表达及意义

目的:探讨乙肝病毒相关慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF)患者中多核型髓源性抑制细胞(polymorphonuclear myeloid-derived suppressor cell,PMN-MDSC)的表达及意义。方法:选取2022年9月—2023年8月皖南医学院弋矶山医院收治的HBV-ACLF患者40例为研究组,同期在该院诊治或体检的慢性乙肝(chronic hepa-titis B,CHB)患者20例、健康对照(healthy control,HC)10例为对照组,收集临床资料,留取血标本。流式细胞术检测入院当日外周血PMN-MDSC频率,比较研究组和两个对照组外周血PMN-MDSC频率的差异。采用Spearman检验分析HBV-ACLF外周血PMN-MDSC频率与炎症指标、疾病严重度的相关性。分别根据是否合并或继发感染及访视期第28天预后情况对HBV-ACLF患者分组,比较各组外周血PMN-MDSC频率的差异。结果:HBV-ACLF组外周血PMN-MDSC频率显著高于CHB组和HC组(P均<0.001),CHB组和HC组之间PMN-MDSC频率差异无统计学意义。HBV-ACLF外周血PMN-MDSC频率与白细胞计数、中性粒细胞淋巴细胞比值、降钙素原水平、国际标准化比值、总胆红素水平、Child-Turcotte-Pugh评分、终末期肝病模型评分均呈正相关(r=0.347、0.799、0.506、0.450、0.462、0.470、0.481,P均<0.05),与淋巴细胞计数呈负相关(r=-0.428,P<0.01)。40例HBV-ACLF患者中,合并感染18例,继发感染17例,28 d预后差21例,其外周血PMN-MDSC频率均高于对照组患者,差异有统计学意义(P均<0.001)。结论:HBV-ACLF患者外周血富集PMN-MDSC,其频率与感染风险、疾病严重度及患者短期预后密切相关。

293T细胞生产慢病毒工艺优化

随着细胞治疗的快速发展,大规模慢病毒的生产成为工艺环节中的瓶颈,因此,优化293T高滴度和高纯度的CAR慢病毒载体生产工艺显得至关重要。本研究旨在优化包装慢病毒的293T贴壁细胞,节省时间,节约成本,提高慢病毒包装的能力。同时对优化慢病毒载体中出现悬浮细胞结团生长的现象进行探索,检测其影响结团的因素。分别采用快速、慢速驯化方式将293T贴壁细胞驯化为悬浮培养,并比较其细胞形态、细胞密度、细胞活率、慢病毒包装能力和冻存复苏后稳定一致性,筛选出最优的悬浮驯化条件。通过调节Ca^(2+)浓度和EDTA添加量来研究比较细胞结团生长状况。结果证明,使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂(medium)可以将293T贴壁细胞快速驯化为293T悬浮细胞,并能制备出慢病毒滴度且优于贴壁细胞的包装滴度(^(*)P<0.05)。Ca^(2+)浓度会影响细胞结团大小,添加EDTA能有效分离分散非必要的细胞抱团生长。研究结果显示,传统293T贴壁细胞可以使用无血清培养基OPM-293 CD05溶剂快速驯化成悬浮细胞;在一定范围内,Ca^(2+)浓度越高细胞所结团块及粒径越大,EDTA添加量越高细胞所结团块及粒径变小。这为优化慢病毒载体包装工艺和悬浮培养条件,同时为体外规模化细胞培养放大和生产奠定了理论基础,具有一定的实用价值。

采用慢病毒载体干扰TRAF2表达的MH7A细胞稳转株的构建及意义

目的 用慢病毒载体构建干扰肿瘤坏死因子受体相关因子2(TRAF2)表达的类风湿关节炎(RA)患者滑膜细胞株MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号在MH7A异常增殖的作用。方法 根据人TRAF2的基因序列和shRNA序列设计原则,设计并合成3对TRAF2-shRNA干扰序列,通过PCR对引物进行退火,通过双酶切PLKO.1-puro获得线性载体,将线性化载体与退火后引物通过Solution I连接,连接产物导入感受态细胞,涂板,挑取阳性菌落进行测序。构建3种不同的PLKO.1-TRAF2-shRNA慢病毒重组质粒,借助慢病毒包装质粒对对数生长期的HEK 293T细胞进行慢病毒包装,收集病毒液感染MH7A细胞,同时使用嘌呤霉素对TRAF2低表达的MH7A稳转株进行筛选。使用CCK-8法、Western blot、qPCR检测MH7A中肿瘤坏死因子TNF-α诱导TRAF2低表达的MH7A增殖功能及下游信号TRAF2、P65蛋白表达和mRNA水平。结果 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1)、PLKO.1-TRAF2-shRNA(2)和PLKO.1-TRAF2-shRNA(3)慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro,将3个TRAF2-shRNA慢病毒载体质粒和对照组慢病毒载体质粒PLKO.1-puro分别与慢病毒包装质粒导入HEK 293T获得病毒液,将病毒液感染MH7A细胞后,经嘌呤霉素(2.00μg/ml)筛选,2 d得到MH7A稳转株;qPCR和Western blot结果显示,PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株中TRAF2 mRNA和蛋白的表达较阴性对照组明显下降;CCK-8和Western blot结果表明,MH7A中TRAF2敲低后,TNF-α诱导的TRAF2低表达的MH7A细胞增殖和P65的磷酸化水平明显下降。结论 成功构建了PLKO.1-TRAF2-shRNA(1) MH7A细胞稳转株,研究TNF-α-TRAF2信号活化介导RA滑膜细胞异常增殖中的作用。

炎症和免疫指标对乙型肝炎病毒感染相关慢加急性肝衰竭预后判断价值研究进展

乙型肝炎病毒感染相关慢加急性肝衰竭(hepatitis B virus-related acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF)是在慢性乙型肝炎病毒感染导致的慢性肝病基础上,短期内出现急性肝功能失代偿的临床综合征。HBV-ACLF具有病情进展迅速、治疗效果差、死亡率高的特点。炎症和免疫应答是HBV-ACLF发生、发展及产生多器官、组织损伤的重要原因。本文对超敏C反应蛋白、降钙素原、白细胞介素类、淋巴细胞亚群类、趋化因子等炎症指标,以及超敏C反应蛋白/白蛋白比值、中性粒细胞/淋巴细胞比值、血小板/白细胞比值等多因素指标在HBV-ACLF病情及预后判断中的应用进行综述,发现动态观察炎症和免疫相关指标对HBV-ACLF预后判断、治疗方式选择等具有指导意义,且多因素指标判断HBV-ACLF患者预后的灵敏度及特异度优于单因素指标。炎症和免疫指标对HBV-ACLF患者预后判断具有指导意义。

富马酸替诺福韦二吡呋酯与恩替卡韦治疗乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭的效果比较

目的 比较富马酸替诺福韦二吡呋酯与恩替卡韦治疗乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭(HBV-ACLF)的效果。方法 按照随机数字表法将2022年1月—2023年7月龙岩市第二医院收治的HBV-ACLF患者100例分为恩替卡韦组与富马酸替诺福韦二吡呋酯组(TDF组),各50例。恩替卡韦组予以恩替卡韦分散片,TDF组予以富马酸替诺福韦二吡呋酯片,2组均连续治疗6个月。比较2组临床疗效,治疗前后肝功能指标[丙氨酸氨基转移酶(ALT)、天冬氨酸氨基转移酶(AST)、总胆红素(TBil)]、血常规(白细胞计数、中性粒细胞计数及血小板计数)、乙型肝炎病毒(HBV)-DNA水平、健康调查量表36(SF-36)评分,不良反应。结果 TDF组治疗总有效率为96.00%,高于恩替卡韦组的80.00%(χ^(2)=6.061,P=0.014)。治疗6个月后,2组血清ALT、AST水平及白细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数及TDF组血清TBil水平低于治疗前,且TDF组血清ALT、AST、TBil水平低于恩替卡韦组(P<0.05或P<0.01);2组白细胞计数、中性粒细胞计数、血小板计数比较,差异无统计学意义(P>0.05)。治疗1、3、6个月后,2组HBV-DNA水平低于治疗前,且TDF组低于恩替卡韦组(P<0.05或P<0.01)。治疗6个月后,2组SF-36评分高于治疗前,且TDF组高于恩替卡韦组(P<0.01)。TDF组不良反应总发生率为6.00%,低于恩替卡韦组的24.00%(χ^(2)=6.353,P=0.012)。结论 与恩替卡韦比较,HBV-ACLF患者使用富马酸替诺福韦二吡呋酯治疗的效果更佳,可明显改善患者肝功能,有效降低HBV-DNA水平,减轻炎症,提升患者生活质量,且不良反应更少。

从乙型肝炎病毒病原学探讨慢性乙型肝炎病毒相关性肝病的中医病因病机

慢性乙型肝炎病毒相关性肝病是由乙型肝炎病毒持续感染引起的肝脏慢性炎症性疾病,包括从肝炎向肝纤维化/肝硬化甚至肝癌发展的一系列疾病,属于中医“胁痛”“黄疸”“积聚”“鼓胀”等疾病范畴,病因病机与“虚”“湿”“疫”“毒”“瘀”有关。正气本虚是本病发生的根本原因,外感疫毒是疾病发展的始动因素,湿毒邪恋贯穿疾病始终;随着疾病的进展,还会表现出气滞血瘀、脾虚痰浊、癥瘕积聚、气阴两虚等病机特点。在治疗上应将扶正祛邪的思想贯穿始终,抗病毒治疗的基础上,灵活采用益气活血、清热解毒、补脾化痰、利湿通络等方法,达到既病防变、截断病势的治疗目的。

p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

SOX7基因慢病毒载体的构建及其在缺氧条件下对HUVECs增殖与迁移功能的影响

目的构建过表达SRY-box transcription factor 7(SOX7)基因的慢病毒载体,建立SOX7基因过表达的人脐静脉内皮细胞株(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs),并在常氧和缺氧条件下探究过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。方法使用聚合酶链式反应(Polymerase chain reaction,PCR)技术扩增SOX7基因,通过同源重组法构建以pHAGE-CMV-MCS-IRES-ZsGreen为载体的SOX7-pHAGE重组质粒。实时荧光定量PCR(Quantitative real-time PCR,qPCR)和免疫印迹(Western blot)法检测目的基因的mRNA和蛋白表达。将SOX7-pHAGE重组质粒和包装质粒共转染293T细胞,获得含有SOX7-pHAGE慢病毒悬液,经浓缩后感染HUVECs,构建SOX7稳定感染细胞株。应用qPCR和Western blot技术检测SOX7基因的mRNA和蛋白的表达。在常氧及缺氧条件下,通过细胞划痕实验和CCK-8法检测过表达SOX7对HUVECs迁移和增殖能力的影响。结果SOX7-pHAGE重组质粒经测序后,序列比对正确。qPCR和Western blot法成功检测出SOX7-pHAGE重组质粒转染的293T细胞在mRNA水平过表达约111.4倍(P=0.0028),在蛋白质水平上出现过表达条带;qPCR和Western blot技术成功检测到SOX7-pHAGE慢病毒感染的HUVECs在mRNA水平上显著升高约68.2倍(P=0.0030),在蛋白水平上显著升高约1.7倍(P=0.0043),SOX7-pHAGE重组质粒及SOX7稳定感染细胞株构建成功。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的迁移能力没有发生改变(P>0.9999),而在缺氧条件下其迁移能力增强约1.2倍(P=0.0044)。在常氧条件下,SOX7稳定感染细胞株的增殖能力增强约1.3倍(P=0.0087),在缺氧条件下其增殖能力也显著增强约1.4倍(P=0.0228)。结论SOX7稳定感染细胞株可促进HUVECs的增殖能力。在缺氧条件下,SOX7稳定感染细胞株可回补HUVECs被抑制的迁移和增殖能力。

BMP7过表达慢病毒载体构建及其对小鼠主动脉平滑肌细胞钙化的影响

目的构建骨形态发生蛋白7(BMP7)过表达慢病毒载体,分析BMP7过表达对小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达的影响及其对共培养血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法根据目的基因信息Mouse-BMP7(NM_007557.3)和质粒信息pLVX-zsGreen-C1进行基因序列合成,构建BMP7过表达慢病毒。qPCR检测BMP7过表达慢病毒感染效率;Western blot检测其感染的小鼠主动脉内皮细胞Jagged1蛋白表达。将过表达BMP7慢病毒感染的内皮细胞与VSMCs共培养,茜素红染色观察共培养后VSMCs钙化情况。结果成功构建BMP7过表达慢病毒载体并转染至小鼠主动脉内皮细胞。qPCR检测结果提示,与正常对照组比较,BMP7过表达组的BMP7 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),空载体对照组BMP7 mRNA无显著变化(P>0.05)。Western blot结果显示,BMP7过表达组内皮细胞Jagged1蛋白表达水平较正常对照组显著降低(P<0.01),而空载体对照组内皮细胞Jagged1蛋白水平较正常对照组无显著改变(P>0.05)。茜素红染色结果提示,与感染过表达BMP7慢病毒的内皮细胞共培养后,VSMCs的钙化程度明显增加。结论成功构建小鼠BMP7过表达慢病毒载体,并发现过表达BMP7可以降低小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达,并促进共培养的VSMCs钙化。

一种可满足产业化需求的靶向EpCAM嵌合抗原受体慢病毒生产工艺

目的建立一种可满足产业化需求的靶向上皮细胞粘附分子(EpCAM)嵌合抗原受体(CAR)慢病毒生产工艺。方法以EpCAM蛋白为抗原,免疫小鼠获得EpCAM单抗,采用EpCAM单抗的scFv为胞外单链可变区,构建人源化靶向EpCAM的第三代CAR载体质粒,并通过EpCAM CAR载体质粒与慢病毒包装质粒共转染HEK 293T细胞获得慢病毒粗毒液,粗毒液经核酸酶孵育、过滤澄清、Core 700层析、浓缩换液、除菌过滤、制剂分装等工序获得EpCAM慢病毒成品。结果通过EpCAM单抗成功构建了靶向EpCAM抗原的嵌合抗原受体Humanized EpCAM ScFv-CD28-CD3ζ-CAR,并通过该EpCAM CAR进行2 L悬浮体系慢病毒包装所收获粗毒液,经层析及超滤浓缩等纯化工艺收获慢病毒成品100 mL,成品慢病毒转导滴度达2.16×10^(8)TU/mL,慢病毒总量达2.16×10^(10)TU。成功开发了可满足产业化需求的靶向EpCAM CAR慢病毒上游包装及下游纯化生产工艺。结论具有成本效益的慢病毒(LV)载体制备对于满足产业化需求至关重要,本研究在EpCAM蛋白、EpCAM抗体、及EpCAM CAR载体质粒的基础上,结合完整的慢病毒悬浮生产工艺,制备高滴度高纯度的靶向EpCAM嵌合抗原受体慢病毒,为EpCAM CAR-T细胞治疗实体瘤应用及其产业化奠定基础。

慢病毒载体介导的稳定表达eIF5A细胞系的建立及其对猪繁殖与呼吸综合征病毒增殖的影响

本研究旨在通过慢病毒载体构建稳定表达真核翻译起始因子5A(eukaryotic translation initiation factor 5A,eIF5A)的MARC-145细胞系并验证该细胞系对PRRSV感染的影响。全基因合成eIF5A序列,双酶切后构建慢病毒表达载体pLV-CMV-MCS-EF1a-Puro。将该载体和慢病毒包装质粒psPAX2与包膜蛋白质粒pMD2.G共转染HEK293T细胞,包装得到能表达eIF5A的慢病毒。将慢病毒转导至MARC-145细胞,经过嘌呤霉素筛选、细胞有限稀释法获得能稳定表达eIF5A的MARC-145细胞系。MTS试验证实构建的细胞系细胞活力无显著变化,病毒TCID50测定、实时荧光定量PCR、蛋白质免疫印迹和间接免疫荧光技术检测eIF5A稳定表达对PRRSV滴度、PRRSV N基因及N蛋白表达的影响,发现MARC-145-eIF5A细胞系能显著促进PRRSV的增殖。本研究成功构建了稳定表达eIF5A的细胞系MARC-145-eIF5A,PRRSV感染试验证实体外稳定表达eIF5A可以促进PRRSV在MARC-145细胞的增殖。

血栓弹力图预测乙型病毒性肝炎慢加急性肝衰竭并发出血风险的应用研究

目的应用血栓弹力图(thromboelastography,TEG)检测乙型肝炎病毒相关慢加急性肝衰竭(HBV-related acute-on-chronic liver failure,HBV-ACLF)患者的凝血功能,评估其在发生出血风险及预后方面的价值。方法收集132例HBV-ACLF患者的临床资料,用TEG检测患者全血凝血动力学,同时检测其常规生化、凝血功能等指标;比较消化道出血组和无消化道出血组之间,生存组和死亡组之间上述指标的差异;比较分析凝血参数与TEG各参数[凝血因子活性(R值)、纤维蛋白原功能(K值)、纤维蛋白原功能(α-角)等]在是否出血及是否血栓形成之间的相关性;并用ROC曲线评价TEG的参数R值和PT对HBV-ACLF患者出血预后评估的能力。结果生存组和死亡组两组间的PT、AARC评分、终末期肝病模型(MELD)、D二聚体、乳酸、总胆红素、直接胆红素均存在统计学差异(P<0.05),提示死亡组的PT、AARC、MELD、D二聚体、乳酸、总胆红素、直接胆红素均高于生存组;消化道出血组和未出血组两组间MA、Angle存在统计学差异(P<0.05),提示消化道出血组MA、Angle均较未消化道出血组明显缩短。对HBV-ACLF患者否并发出血风险的预测分析评估中MA、Angle值和K值的AUC曲线下面积分别为0.332、0.359、0.682,K值优于MA、Angle值,P值均<0.001,差异均有统计学意义。结论TEG检测能真实反映HBV-ACLF患者凝血和抗凝功能在低水平的“再平衡”状态,MA、Angle缩短提示患者并发消化道出血的风险增加,K值对于预测消化道出血风险的价值优于MA、Angle值。

鞘内注射shRNA慢病毒载体缓解慢性炎性疼痛的机制研究

目的探究鞘内注射shRNA慢病毒载体对慢性炎性疼痛大鼠疼痛行为学及脊髓胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、OX42蛋白表达的影响。方法将54只SD大鼠随机分为正常组、空病毒组、慢病毒载体组,采用足底注射完全弗氏佐剂(CFA)建立大鼠慢性炎性疼痛模型,正常组大鼠足底注射生理盐水,鞘内注射PBS缓冲液;空病毒组和慢病毒载体组大鼠足底注射CFA,鞘内分别注射空病毒和慢病毒液。于建模前1 d及建模后第1、3、6、9、13天测量机械缩足阈值(PMWT)及热缩足潜伏期(PTWL);于建模后第3、6、13天留取大鼠L4~L5背根神经节(DRG)组织和脊髓节段组织,检测Nav1.7和GFAP、OX42蛋白表达水平。结果与正常组大鼠比较,空病毒组及慢病毒载体组大鼠PMWT值以及慢病毒载体组大鼠PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后逐渐升高;空病毒组PTWL值在建模后第1天明显下降,在建模后第3天下降达最低值,之后较第3天升高,但仍低于基础值。与空病毒组大鼠比较,慢病毒载体组大鼠PMWT、PTWL值从建模后第3天开始逐渐升高,差异有统计学意义(P<0.05)。在建模后第3、6、13天,正常组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平基本无变化;空病毒组和慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较正常组增加,差异有统计学意义(P<0.05);慢病毒载体组大鼠DRG中Nav1.7及脊髓GFAP、OX42蛋白表达水平较空病毒组下降,差异有统计学意义(P<0.05)。结论鞘内注射shRNA慢病毒载体可抑制大鼠DRG中Nav1.7表达,抑制脊髓胶质细胞活化,下调GFAP、OX42蛋白表达,缓解大鼠慢性炎性疼痛。

慢病毒介导的CBS基因沉默对人胶质瘤细胞增殖的影响

目的:探究催化产生内源性H2S的酶CBS在人胶质瘤细胞增殖中的作用。方法:以人脑胶质瘤U87细胞为实验对象,使用CBS基因shRNA慢病毒载体转染胶质瘤细胞CBS基因,利用0.5μg/mL嘌呤霉素筛选建立CBS-RNAi慢病毒的U87稳定细胞株,通过qPCR法对各组CBS基因的表达量检测,确定目标基因的沉默效果以及CBS基因沉默对于U87细胞的增殖能力的影响。结果:与空白对照组相比,CBS-RNAi 2组的CBS mRNA表达量明显降低,CBS-RNAi 1组和CBS-RNAi 3组的CBS mRNA表达量降低;证明慢病毒介导的RNAi可有效沉默人胶质瘤U87细胞的CBS基因,且CBS-RNAi组沉默人胶质瘤细胞CBS基因的效果最佳。结论:沉默CBS基因能够抑制人胶质瘤U87细胞的体外增殖,CBS基因或可成为临床治疗人脑胶质瘤的新靶点。

妊娠中期并发慢加急性乙型肝炎感染后成功实施原位肝移植:病例报道

我们报告了一名36岁的孕妇,因慢性和急性肝功能衰竭(Chronic and acute liver failure,CALF)和肝性脑病被转到重症监护病房。实验室检查显示肝功能异常,其他血清学检查符合乙肝病毒(HBV)感染。超声波检查显示一个死胎。该患者接受了非常紧急的供体肝移植(Liver transplantation,LT),使用的是一名死于蛛网膜下腔出血的ABO血型相同的56岁男性。肝脏组织学检查显示小结节性肝硬化,急性和慢性肝炎,符合坏死性HBV感染。手术后,患者同种异体移植功能逐渐恢复。免疫抑制方案是巴利昔单抗联合他克莫司。原位肝移植(OLT)后第6天,在超声引导下羊膜腔穿刺后,注射利凡诺引产。OLT后第8天,一个死胎在阴道分娩,并出现大量阴道出血。全麻下超声引导下进行胎盘钳夹术。到目前为止,患者在术后2个月一般状况良好和肝功能正常。