慢病毒介导的胶质瘤模型在教学中的应用

目的比较移植性肿瘤动物模型与慢病毒介导的胶质瘤模型在教学中的应用效果。方法选取50名临床8年制5年级学生,根据不同的实验操作,将学生随机分为移植性肿瘤动物模型组(n=25)以及慢病毒介导的胶质瘤模型组(n=25)。移植性肿瘤动物模型组以大鼠胶质瘤细胞系9L脑纹状体注射Wistar大鼠模型进行实验操作;而慢病毒介导的胶质瘤模型组则以慢病毒载体介导Ras的表达以及Akt的激活,注射胶质纤维酸性蛋白(GFAP)-Cre基因小鼠进行实验操作。教学结束后比较两组的教学反馈和教学成果。结果与移植性肿瘤动物模型组相比,慢病毒介导的胶质瘤模型组成员对该模型的教学反馈评价更高,该模型的重复性更好,使学生对肿瘤分子水平的认识更深入,差异具有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒介导的胶质瘤模型在教学中应用具有可行性,不仅提供了一个较新的模型,也使得学生能够从分子水平认识肿瘤,对于肿瘤的理解更为深入。

慢病毒介导小鼠K26/KAP26.1基因过表达对相关基因的调控作用

【目的】利用慢病毒介导过表达技术,明确小鼠K26和KAP26.1基因过表达后对角蛋白关联蛋白基因KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1和对骨形态发生蛋白基因BMP-4、BMPR-IB的影响,探究小鼠绒毛细度变化的影响机制,达到人为调控(如慢病毒载体技术)使相关基因过表达,改善动物绒毛品质的目的,为哺乳动物绒毛细度调控的研究奠定理论基础,【方法】试验在辽宁省生物技术与分子药物研发重点实验室完成,小白鼠采自大连医科大学实验动物中心,选取出生后5周龄昆明种雄鼠。在Genebank查找到小鼠基因K26(Gene ID:NM_001033397)及KAP26.1(Gene ID:NM_027105.2)序列,根据目的基因序列设计引物,将质粒转入生长状态良好的293T细胞,构建小鼠K26和KAP26.1基因慢病毒过表达载体,将含有目的基因K26及KAP26.1的慢病毒表达载体分别转染小鼠皮肤成纤维细胞,用荧光显微镜观察其转染情况,确定慢病毒表达载体转染成功后,从病毒感染后的细胞中抽提总RNA,将RNA反转录成c DNA后放入Eppendorf Realplex荧光定量PCR仪,检测K26和KAP26.1基因过表达对KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因表达的影响。【结果】经RT-PCR检测,证明小鼠慢病毒载体p Lenti6.3-K26-IRES-EGFP和p Lenti6.3-K26.1-IRES-EGFP构建成功。经荧光场对比,发现目的慢病毒载体转染293T细胞72h时转染率最高。经PCR检测,证实包装好的目的慢病毒K26及KAP26.1转染小鼠成纤维细胞72 h后转染成功。经RT-PCR检测与SPSS Statistics 19软件分析目的基因表达量与阳性对照组(空载体质粒组,BLACK)、阴性对照组(小鼠表皮成纤维细胞,NC)表达量之间的显著性差异,发现K26基因过表达会导致KAP26.1基因上调,反之亦然,说明K26和KAP26.1基因之间存在一定的协同作用;K26和KAP26.1基因过表达后,均能导致KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因下调;K26基因过表达能使BMP-4基因表现为上调,而BMPR-IB基因表现为下调;KAP26.1基因过表达时,BMP-4和BMPR-IB基因均表现为上调。【结论】K26与KAP26.1基因在毛囊的内根鞘中起到协同作用,K26和KAP26.1基因的高表达会抑制KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1基因的表达,影响m TOR下游蛋白合成信号,进而起到调节绒毛粗细的作用;K26和KAP26.1基因过表达均能使BMP-4基因表现为上调,BMP-4是BMP信号通路的激活剂,能够激活BMP信号通路向下游转导,进而影响到毛囊的发育周期;K26基因过表达下调BMPR-IB基因的表达,而KAP26.1基因过表达上调BMPR-IB基因的表达,BMPR-IB基因是BMP信号的Ⅰ型受体,当BMPR-IB受体减少时,会抑制BMP信号向下游转导,从而使绒毛生长周期重新开始;当BMPR-IB受体增加时,会促进下游信号分子转录,进而影响毛囊发育周期。说明K26和KAP26.1基因过表达均能激活BMP信号通路,并由BMP和m TOR信号调节KAP6.2、KAP7.1、KAP8.2、KAP11.1、BMP-4和BMPR-IB基因的表达,但K26与KAP26.1基因对BMPR-IB基因的相反调节作用有待深入研究。

慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞杀伤作用的实验研究

目的:探讨慢病毒介导的双自杀基因对T淋巴细胞的杀伤作用。方法:在脂质体介导下将慢病毒包装系统的包装结构基因pCMVΔ8.2、包膜基因pCMV.VSVG、目的基因pHR'CS.GFP或pHR'CS.CDglytk导入病毒包装细胞293T,包装成病毒后,收集病毒上清,浓缩后转染T淋巴细胞,荧光显微镜及RT-PCR检测基因的整合及表达。给予前体药物5-氟胞嘧啶(5-FC)和/或无环鸟苷(GCV)后,MTT法测定细胞的存活率,流式细胞仪检测细胞的凋亡率。结果:慢病毒的3种质粒可高效转染入293T细胞。对照组荧光显微镜下观察可见大量的绿色荧光,透射电镜下观察可见许多病毒颗粒。慢病毒介导的双自杀基因在T淋巴细胞中高效、稳定表达,单独使用GCV或5-FC对T细胞/CD+tk的存活率与未转染T细胞比较明显降低(P<0.01),与单独使用5-FC或GCV比较,联合使用5-FC和GCV时T细胞的存活率明显降低(P<0.01)。结论:慢病毒介导的双自杀基因可高效稳定转染T淋巴细胞,双自杀基因系统较单一自杀基因系统(CD/5-FC或HSV-tk/GCV)对T淋巴细胞的杀伤具有明显增强作用。

慢病毒介导CD-TK融合基因转染对神经干细胞体外增殖的影响

目的探讨慢病毒介导胞嘧啶脱氨酶(cytosine deaminase,CD)及胸腺嘧啶激酶(thymidine kinase,TK)融合基因转染对神经干细胞体外增殖的影响。方法原代培养新生Wistar大鼠室下区神经干细胞并鉴定,经传代纯化后,用CD-TK基因包装的慢病毒处理3～5 d。MTT实验检测神经干细胞增殖活性,免疫荧光技术检测转染后神经干细胞GFAP、NSE表达。结果 MTT结果显示CD-TK融合基因转染对神经干细胞增殖无影响(P>0.05)。免疫荧光结果显示:神经干细胞Nestin标记阳性;CD-TK融合基因转染后,神经干细胞NSE及GFAP均表达阳性。结论 CD-TK融合基因转染对神经干细胞增殖无影响。

慢病毒介导的RNA干扰鉴定RIG-Ⅰ、MDA-5和TLR3在猪上皮细胞识别RNA病毒中的作用

病原体识别受体是宿主抗病毒免疫反应所必需的,这些特异的受体能识别保守的病毒化合物并诱导Ⅰ型干扰素(IFN)和促炎细胞因子。本试验在猪细胞系PK-15中研究了RIG-Ⅰ、MDA-5和TLR3在IFN-β对古典猪瘟病毒(CSFV)、口蹄疫病毒(FMDV)、水泡性口炎病毒(VSV)和A型流感病毒(IAV)的识别中的作用。本研究鉴定了猪基因特异性小干扰RNA序列,并用慢病毒(LV)系统来表达相应的短发夹RNA,构建了基因表达下调细胞系,并检测基因表达下调水平与时间和IFN-β刺激的相关性。试验细胞经多次传代,报告基因eGFP的表达和目的基因的RNA减少水平都是稳定的,而后者相对变化较大。IFN-β诱导干扰素应答基因(如RIG-Ⅰ)表达,但其水平在试验细胞系中仍低于对照细胞。病毒介导的IFN-βmRNA反应结果表明,在PK-15细胞中,口蹄疫病毒的识别完全是由MDA-5介导的,而VSV和IAV主要由RIG-Ⅰ检测到,MDA-5也起到一定作用,CSFV是通过MDA-5,RIG-Ⅰ和TLR3识别。

单链抗体导向的慢病毒介导VP22-TK系统对MUC1^+人卵巢癌裸鼠腹腔移植瘤的作用

目的 探讨抗MUC1单链抗体 (scFv)导向的慢病毒介导的单纯疱疹病毒结构蛋白VP2 2和胸苷激酶 (TK)融合基因及丙氧鸟苷 (GCV)自杀基因系统对MUC1+ 人卵巢上皮癌的特异靶向性生长抑制作用。方法 将慢病毒包装质粒、包膜质粒、转移载体质粒采用磷酸钙沉淀法共转染包装细胞2 93T ,收集病毒上清 ,并建立MUC1+ 人卵巢上皮癌 (3AO)细胞株腹腔移植瘤模型。单药组分为scFv VP2 2 TK +生理盐水 (NS)组、VP2 2 TK +NS组、NS +NS组 ,分别用慢病毒scFv VP2 2 TK、VP2 2 TK或NS1ml腹腔注射 ,继予NS腹腔注射 ;联合用药组分为scFv VP2 2 TK +GCV组、VP2 2 TK +GCV组、NS +GCV组分别应用慢病毒scFv VP2 2 TK、VP2 2 TK及NS腹腔注射 ,2 4h后给予GCV腹腔注射治疗。每组裸小鼠均为 5只。观察各组裸鼠的生存时间及慢病毒的毒性作用。结果 平均生存时间scFv VP2 2 TK +NS组、VP2 2 TK +NS组、NS +NS组、NS +GCV组、VP2 2 TK +GCV组、scFv VP2 2 TK +GCV组分别为 18.4d± 2 .9d、18.8d± 1.5d ,17.6d± 1.1d ,18.5d± 1.6d ,2 4d± 5d和 4 6d± 2 2d ,6组比较 ,差异有显著意义 (χ2 =2 4 .82 ,P =0 .0 0 2 ) ;并且scFv VP2 2 TK +GCV组较VP2 2 TK +GCV组裸鼠平均生存时间明显延长 (χ2 =7.4 3,P =0 .0 0 6 )。

重组慢病毒介导的人凝血因子Ⅸ cDNA在培养细胞和血友病B小鼠中的表达

为探索慢病毒载体介导的人凝血因子Ⅸ(hFⅨ) cDNA在培养细胞中的表达水平, 及重组慢病毒应用于血友病B基因治疗的可行性, 分别构建由肝特异性启动子ABP调控的hFⅨ的慢病毒载体FAXW, 以及由泛肽-C调控的hFⅨ慢病毒载体 FUXW; 用磷酸钙法, 将慢病毒载体与包装质粒CMV△R8.2和包膜质粒VSV-G共转染产毒细胞293 T, 以制备重组慢病毒.重组FUXW病毒分别感染293 T, BHK和L-02细胞, 经检测皆有hFⅨ蛋白表达.重组FAXW病毒感染细胞48 h后, 仅在L-02细胞检测到hFⅨ高表达(630 ng/106细胞), 而在其他感染细胞中hFⅨ表达较低.将重组FAXW病毒经尾静脉途径注射入血友病B小鼠体内, 小鼠血浆中可检测到接近治疗水平的hFⅨ抗原(45 ng/mL), 且持续时间超过60 d.上述结果表明, 慢病毒载体介导的基因转移为血友病B基因治疗提供了极有潜力的方法.

慢病毒介导人脑源性神经营养因子与绿色荧光蛋白基因转染神经干细胞的研究

目前对神经干细胞的研究大多集中在诱导分化与移植领域，使用慢病毒载体，同时进行人脑源性神经营养因子（hBDNF）和绿色荧光蛋白（GFP）基因转染的研究报道尚少。我们构建hBDNF-GFP基因共表达慢病毒载体，包装病毒后转染脑源性NSCs，使之稳定表达具有生物学活性的hBDNF。

慢病毒介导的RNA干扰技术建立hPARP-1缺陷细胞株

聚ADP核糖聚合酶（poly—ADP ribose polymerase，PARP）是真核细胞生物体内一类重要的DNA损伤修复酶家族。其在各种生物效应引起的DNA断裂的活化下，产生聚（ADP-核糖）合成活性与聚（ADP-核糖）转移活性，将ADP核糖单位转移至某些氨基酸残基上，对蛋白质进行修饰，继而产生各种不同的生物学效应。

慢病毒介导音猬因子基因转染对甲状腺乳头状癌细胞生物学性状的影响

音猬信号（Shh）通路涉及到肿瘤细胞的生长、转移等方面^[1]。启动信号Shh在人甲状腺乳头状癌（PTC）组织中表达增高，并与分期及淋巴结转移有关。我们用已构建的慢病毒载体pGC-FU-Shh-GFP转染PTC原代细胞，稳定过表达Shh^[2]，观察PTC细胞的增殖、侵袭及迁移能力的变化，探讨Shh通路在PTC的发生、发展中的作用。

慢病毒介导的AQP8稳定表达对子宫颈癌SiHa细胞迁移能力的影响、

水通道蛋白（aquaporins，AQP）是一个疏水的、小而完整的膜蛋白家族，广泛表达于动植物体内，相对分子质量约为30000，迄今为止，哺乳动物体内共发现有13个AQP成员（AQP0～12）[1]。

慢病毒介导的血管内皮生长因子干扰对瘢痕成纤维细胞及内皮细胞的影响

增生性瘢痕是创面愈合过程中的病理现象，严重影响患者的容貌、外观，有的甚至引发功能障碍。在临床上，瘢痕进展的过程中皮肤颜色的变化提示瘢痕的形成和成熟与组织中血管的作用有关。抗血管生成可能能够治疗增生性瘢痕。本实验室前期已构建了针对人血管内皮生长因子（VEGF）的干扰慢病毒，本研究拟在体外瘢痕成纤维细胞培养模型上探讨稳定的干扰VEGF对成纤维细胞的影响和内皮细胞的影响。

逆转录病毒与慢病毒介导HSV-TK/GCV防治移植物抗宿主病的比较研究

移植物抗宿主病（GVHD）是限制异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的最主要并发症，现有的防治方法均不理想，应用自杀基因系统防治GVHD是一个新的尝试。本实验将携带单纯疱疹病毒胸苷激酶（HSV-TK）基因的逆转录病毒和慢病毒分别感染供鼠（C57BL／6小鼠）脾细胞，感染后细胞与供鼠骨髓细胞混合移植到经Co^60γ射线照射后的受鼠（BABL/C小鼠），移植后分别给受鼠腹腔注射更昔洛韦（GCV），初步观察HSV-TK／GCV系统控制GVHD的效果，并在体内外实验中对两种载体进行比较研究。

慢病毒介导可调控表达维甲酸诱导基因G的肺癌细胞A549的建立

为了进一步研究维甲酸诱导基因G（RIG-G）基因,特别是RIG-G基因的肿瘤抑制功能是否可以复现在肺癌细胞中,我们采用Tet-on表达系统,利用慢病毒载体介导RIG-G基因转染肺癌细胞株A549细胞,建立RIG-G可调控表达的稳转细胞株,观察RIG-G在肺癌细胞A549中的表达及生物学作用.一。

慢病毒介导RNA干扰抑制野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1基因对胆管癌细胞生长的影响

野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1（Wip1）和野生型p53关系密切，在恶性肿瘤的发生发展中具有重要作用。本研究中，我们拟探讨慢病毒介导RNA干扰抑制野生型p53诱导的蛋白磷酸酶1基因对胆管癌细胞生长的影响。

慢病毒介导特异性核转录因子尾型同源基因2过表达对人胃癌裸鼠耐药模型耐药性的影响及其机制

肿瘤细胞多药耐药性与某些基因密切相关，Takakura等研究结果显示，特异性核转录因子尾型同源基因2（CDX2）与肿瘤多药耐药性密切相关，但作用机制尚不明确。本实验旨在观察CDX2基因过表达后对人胃癌耐顺铂细胞SGC-7901／DDP裸鼠皮下移植瘤耐药性产生的影响，并进一步检测经典多药耐药相关基因多药耐药基因1（MDR1）、

慢病毒介导细胞因子信号转导抑制因子3基因沉默对糖尿病大鼠胰岛素信号通路的影响

细胞因子信号转导抑制因子3（suppressors of cytokine signaling 3,SOCS3）可通过抑制信号转导与转录活化因子3 （signal transducer and activator of transcription3,STAT3）异常活化调节细胞因子信号传导,在维持机体内环境平衡中起重要作用[1].研究表明STAT3-SOCS3信号参与胰岛素抵抗的形成过程,在2型糖尿病（T2DM）的发病机制中起重要作用[2-4].本课题组前期研究结果显示,T2DM大鼠SOCS3基因表达上调,可能通过增加胰岛素受体底物（insulin receptor substrate, IRS）降解并促进其丝氨酸磷酸化水平,导致胰岛素抵抗[5-6].RNAi（RNA interference, RNAi）是通过小干扰RNA（small interfering RNA,siRNA）诱导细胞内同源mRNA降解介导的转录后水平基因沉默技术[7],慢病毒介导的RNAi技术,已广泛用于疾病的治疗和研究中[8].本研究利用慢病毒载体介导RNAi技术下调T2DM大鼠SOCS3基因,观察胰岛素信号通路相关分子的变化,探讨沉默SOCS3基因对胰岛素信号通路的影响.

慢病毒介导的shRNA沉默PTTG基因抑制人PRL型垂体腺瘤细胞生长的体外实验研究的护理方式

大型生长激素（ PRL）型垂体腺瘤是一种较为常见的激素分泌性垂体瘤［1］，在此类型中所占的比重约为35％～45％［2］，PRL垂体腺瘤种类中的侵袭性腺瘤具有全切率低、复发率高的特点［3］，成为临床治疗的难点。但是经过医疗科学人员的不懈努力，终于研制出了对抗PRL垂体腺瘤的方式，但是在目前医疗技术水平条件的制约下，手术、放疗、药物等治疗措施仍很难将其彻底根治。经过体外实验研究表明，垂体肿瘤细胞转化基因（ PTTG）成为了垂体腺瘤靶向治疗的重要基因之一，近年来成为垂体腺瘤基础研究的热点。

慢病毒介导RNA干涉Cbl-b抑制A549细胞增殖机制研究

目的探讨敲减Cbl-b对程序性死亡配体1(programmed cell death-ligand 1, PD-L1)蛋白表达及肺腺癌A549细胞增殖能力的影响。方法对数生长期A549细胞分为对照组和敲减组,2组采用慢病毒感染法转染目的基因,对照组转染空载体,敲减组转染慢病毒介导的干涉Cbl-b基因,转染后72 h采用荧光显微镜观察绿色荧光蛋白情况,判断转染效率。采用MTT法检测2组细胞转染成功后第1～5天细胞增殖率,采用Western blot检测2组细胞转染后Cbl-b蛋白相对表达量及转染成功后第3、4天PD-L1、Ki-67蛋白相对表达量。结果转染后,敲减组细胞Cbl-b蛋白相对表达量(0.18±0.03)低于对照组(0.75±0.01)(P<0.05);转染后第4、5天,敲减组细胞增殖率[(59.6±0.4)%、(87.2±1.4)%]低于对照组[(65.5±1.7)%、(98.2±2.8)%](P<0.05);转染后第3、4天,敲减组细胞PD-L1(0.51±0.00、0.55±0.02)和Ki-67蛋白相对表达量(0.35±0.01、0.25±0.00)低于对照组(0.55±0.01、0.67±0.02,0.47±0.01、0.33±0.02)(P<0.05),敲减组转染后第4天PD-L1相对表达量高于第3天,Ki-67蛋白相对表达量低于第3天,但差异均无统计学意义(P>0.05)。结论转染慢病毒介导RNA干涉Cbl-b基因能抑制A549细胞Cbl-b蛋白表达及细胞增殖;该过程伴随PD-L1表达上调和Ki-67表达下调。

靶向沉默Eps8基因对人慢性髓系白血病K562细胞生物学活性的影响及其分子机制的探讨

目的:探索靶向沉默Eps8(表皮生长因子受体通路底物8)基因对人慢性髓系白血病K562细胞生物学活性的影响及其可能的分子机制。方法:采用慢病毒介导RNA干扰技术靶向沉默K562细胞中Eps8基因。实验分组为:空白对照(blank control)组、Eps8-shRNA靶向沉默(K562-shRNA)组和阴性对照(K562-NC)组。在荧光显微镜下观察转染效率;应用RT-PCR法和Western blot法分别从mRNA转录水平和蛋白水平验证Eps8基因沉默效率;台盼蓝拒染法和MTT法检测细胞体外增殖能力变化;流式细胞术检测细胞凋亡率变化;甲基纤维素克隆形成实验验证细胞集落形成能力;Western blot法检测沉默Eps8基因后AKT/mTOR及其下游信号通路磷酸化蛋白的表达情况。结果:成功建立稳定低表达Eps8的K562细胞株(K562-shRNA)和阴性对照细胞株(K562-NC)。与空白对照组和K562-NC组相比,沉默Eps8基因后K562-shRNA组细胞Eps8转录和蛋白表达水平均显著降低(P<0.01);体外培养48 h后,K562-shRNA组细胞增殖能力明显下降(P<0.05);K562-shRNA组细胞凋亡率为(5.81±0.39)%,空白对照组和K562-NC组细胞凋亡率分别为(1.02±0.70)%和(1.19±0.15)%,提示K562-shRNA组细胞凋亡率与空白对照组和K562-NC组之间有显著性差异(P<0.05),而空白对照组和K562-NC组之间没有显著性差异(P>0.05);体外甲基纤维素半固体培养10 d后,K562-shRNA组细胞集落形成能力与空白对照组和K562-NC组相比有显著性差异(P<0.05)。沉默Eps8基因可下调K562细胞p-AKT(308)和p-AKT(473)的表达(P<0.05),而t-AKT表达水平没有明显变化。另外,沉默Eps8基因可下调AKT下游的pmTOR和p-PRAS40蛋白的表达(P<0.05),而总mTOR和总PRAS40的表达水平没有明显变化。结论:利用慢病毒介导的RNA干扰技术靶向沉默Eps8基因能够抑制K562细胞增殖,促进其凋亡,其作用机制可能与AKT/mTOR及其下游信号通路下调有关。