基于CRISPR/cas9文库筛选的慢病毒库包装方法研究

目的探讨基于CRISPR/cas9(Clustered regularly interspaced short palindromic repeat sequences/CRISPR-associated protein 9)文库筛选的慢病毒库包装优化条件。方法采用RT-PCR、酶联免疫吸附试验(ELISA法)和免疫荧光法,对不同质粒配比、不同收毒时间以及不同量的Lipofectamine 3000 reagent包装出的慢病毒滴度进行检测,最后通过高通量测序技术评价慢病毒库的sgRNA(single guide RNA,单链引导RNA)覆盖度和reads数分布。结果当质粒配比psPAX2∶pMD2.0G∶Lentivirus library=2∶1∶1时,慢病毒滴度较高;当加入Lipofectamine 3000 reagent的量为10 μl时,慢病毒滴度较高。两种情况,RT-PCR和ELISA法结果一致。免疫荧光显示,收毒时间为60 h时慢病毒滴度较高。经Ion Torrent高通量测序,按照本研究的最优条件包装出的慢病毒库覆盖度达99.3%,sgRNA的reads数符合正态分布。结论本研究探索了慢病毒库包装的优化条件,为下一步CRISPR/cas9文库筛选提供保证。