中和外周循环的IL1β可减缓慢病毒感染OPTN^(E478G)肌萎缩侧索硬化症小鼠模型的进展

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种不可逆的神经退行性疾病,大部分患者一旦发病,仅有3~5年存活期,且目前没有安全有效的延缓该疾病进展的药物。因此,迫切需要开发一种基于症状的治疗方法,以提高ALS患者的生存率并改善他们的生活质量。据报道,炎症状态,尤其是白细胞介素1β(IL1β)升高,在ALS进展中起关键作用。本研究发现通过中和外周循环IL1β可减缓ALS小鼠模型的进展。

中和阻断中和外周循环的IL1β可减缓慢病毒感染OPTN^(E478G)肌萎缩侧索硬化症小鼠模型肌萎缩侧索硬化症的进展

肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)是一种不可逆的神经退行性疾病,大部分患者一旦发病,仅有3~5年存活期,且目前没有安全有效的延缓该疾病进展的药物。因此,迫切需要开发一种基于症状的治疗方法,以提高ALS患者的生存率并改善他们的生活质量。据报道,炎症状态,尤其是白细胞介素1β(IL1β)升高,在ALS进展中起关键作用。本研究发现通过中和外周循环IL1β可减缓ALS小鼠模型的进展。

慢病毒感染方法构建稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系

PDRG1(p53 and DNA-damage regulated 1)是实验室通过文库筛选发现的参与NF-kB信号通路调控的一个新基因。已知PDRG1在多种肿瘤中高表达,并参与p53信号通路;同时该基因受UV以及基因毒性等刺激调控。但其在NF-κB信号通路中作用尚未见报道,为了深入研究PDRG1对NF-κB信号通路的调控机理,构建了稳定干涉PDRG1的HeLa细胞系。选择了基于慢病毒载体pLKO.1的感染体系,该慢病毒体系可以同时感染分裂期与非分裂期的细胞,将目的基因干涉序列稳定整合至靶细胞基因组中;再经过抗生素压力筛选后在短时间内获得稳定干涉目的基因表达的细胞株。设计合成PDRG1干涉序列并克隆至pLKO.1载体,转染病毒包装细胞293TN后收集慢病毒上清感染HeLa细胞系,进一步经过嘌呤霉素压力筛选成功获得稳定表达PDRG1干涉序列的细胞株。该稳定细胞株的建立为PDRG1的功能研究提供了必要的实验工具。

慢病毒感染稳定敲减eIF4E基因的鼻咽癌CNE2细胞系的建立

目的构建稳定干扰真核起始因子4E(eIF4E)基因的鼻咽癌CNE2细胞系。方法设计针对eIF4E基因mRNA序列的RNA干扰序列,以慢病毒载体pGC-LV为基础构建感染体系。慢病毒感染CNE2细胞后,经嘌呤霉素压力筛选稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞株。采用定量聚合酶链反应和免疫印迹法检测eIF4EmRNA和蛋白的表达水平;采用细胞增殖和迁徙实验验证eIF4E敲减对CNE2细胞的影响。结果成功构建并筛选获得带有eIF4E特异性短发夹RNA的慢病毒颗粒;将慢病毒颗粒转入CNE2细胞,经抗菌药物压力筛选获得稳定敲减eIF4E基因的CNE2细胞(CNE2siEp)及阴性对照细胞(CNE2siNC)。与CNE2siNC细胞相比,CNE2siEp细胞eIF4EmRNA表达水平下调76.0%,蛋白表达水平下调50.0%,细胞增殖活性下调85.0%,运动活性下调59.0%。结论成功构建稳定敲减eIF4E的CNE2细胞系,其eIF4E基因表达水平与功能明显受抑。

小鼠趋化因子受体7重组慢病毒感染对DC2.4细胞免疫原性和迁移功能的影响

目的 观察含有趋化因子受体7（CCR7）基因的重组慢病毒感染树突细胞（DC）株DC2.4细胞,对其免疫和迁移功能的影响. 方法 常规培养DC 2.4细胞,构建带有绿色荧光蛋白（GFP）的空载慢病毒和带有上调CCR7基因的慢病毒.按照随机数字表法将细胞分为3组：DC 2.4组（DC2.4细胞未经任何处理）、GFP-DC 2.4组（用GFP空载慢病毒感染DC 2.4细胞）和CCR7-DC2.4组（用GFP标记CCR7上升基因的慢病毒感染DC 2.4细胞）.流式细胞术、蛋白质印迹法、激光扫描共聚焦显微镜分别观测各组细胞表面分子组织相容性复合物Ⅱ（MHCⅡ）、CD80、CD86、CCR7的表达,体外趋化实验检测细胞迁移功能的变化；混合淋巴细胞反应检测各组细胞免疫功能的差别,另设LPS-DC 2.4组作为阳性对照.对数据进行单因素方差分析和t检验. 结果 成功构建表达稳定的慢病毒,感染DC 2.4细胞的效率为87.4％.流式细胞检测结果显示,3组之间MHCⅡ、CD80及CD86的表达差异无统计学意义（F值为0.17～1.19,P值均大于0.05）.CCR7-DC 2.4组CCR7蛋白表达量为45.1 ±2.1,明显高于DC 2.4组的25.3±1.4和GFP-DC 2.4组的28.6±0.9（F=162.90,P ＜0.01）；后2组之间比较,差异无统计学意义（t=2.20,P＞0.05）.激光扫描共聚焦显微镜显示,CCR7-DC 2.4组较DC 2.4组CCR7荧光强度明显升高.CCR7-DC 2.4组细胞体外趋化迁移率为（41.0±2.0）％,明显高于DC 2.4组的（6.0±0.5）％和GFP-DC 2.4组的（6.8±0.3）％（F=84.21,P ＜0.01）；后2组之间比较,差异无统计学意义（t=0.45,P＞0.05）.混合淋巴细胞反应显示,DC2.4、GFP-DC 2.4、CCR7-DC 2.4及LPS-DC 2.4组吸光度值分别为1.6±0.4、1.9±0.4、1.7±0.4、3.8±0.4,前3组之间差无统计学意义（F =1.56,P＞0.05）,LPS-DC 2.4组对T淋巴细胞刺激能力明显高于其他3组（t值为1.53～1.82,P值均小于0.01）. 结论 成功构建能高效表达CCR7的DC 2.4细胞对CCL19有较高的趋化性且对免疫功能无明显影响.

一类具有慢型病毒感染率的病毒动力学模型的稳定性

基于基本病毒动力学模型,构建了一类具有慢型病毒感染项的病毒动力学模型,并研究了病毒消亡平衡点和病毒幸存平衡点的全局稳定性,数值模拟验证了该理论的正确性。

Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞向肌腱细胞的定向分化

背景:Scleraxis作为肌腱细胞特异性表达分子,不仅参与肌腱祖细胞的聚集及分化,还影响肌腱细胞外基质的形成。人羊膜间充质干细胞具有多向分化潜能,在体外不同诱导条件下可分化为骨、软骨及其他结缔组织。目的:探讨Scleraxis慢病毒基因感染人羊膜间充质干细胞能否向肌腱细胞定向分化并观察其分化效果。方法:取足月产胎盘羊膜组织,两步酶消化法分离人羊膜间充质干细胞并采用倒置相差显微镜观察和流式细胞鉴定。取第3代细胞分3组进行培养,单纯人羊膜间充质干细胞培养组为空白组,人羊膜间充质干细胞经Slclerxis基因慢病毒感染后为过表达组,人羊膜间充质干细胞经不携带Scleraxis基因慢病毒感染后为空质粒组。细胞培养7 d内CCK-8法检测各组细胞增殖能力细胞。细胞培养后3 d和7 d,分别进行实时荧光定量PCR和Western Blot检测评价各组细胞向肌腱细胞定向分化的效果。结果与结论:(1)CCK-8检测显示:培养7 d内,过表达组、空质粒组与空白组细胞在增殖能力上无明显差异(P>0.05);(2)Westen blot检测显示:过表达组Scleraxis蛋白表达水平明显高于空质粒组和空白组(P<0.05);(3)实时荧光定量PCR显示:3 d时,过表达组Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白及肌腱蛋白C m RNA表达水平明显高于空质粒组(P<0.05),而腱调蛋白的表达与空质粒组无明显差异(P>0.05);7 d时,Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原、纤连蛋白、肌腱蛋白C及腱调蛋白的表达水平明显高于空质粒组(P<0.05);(4)结果提示:人羊膜间充质干细胞经Scleraxis慢病毒基因感染后可向肌腱细胞定向分化。

慢病毒高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞的分化状态

背景:研究证实YY1主要在小鼠基底层未分化表皮细胞中表达,且随着表皮细胞向基底上层分化其表达逐渐下降,这种差异性表达方式说明YY1可能是表皮细胞分化过程中重要的调节因子之一。目的:采用慢病毒-YY1感染HaCaT细胞观察YY1过表达对细胞分化的影响。方法:将慢病毒-YY1感染至HaCaT细胞,经puromycin筛选,建立单克隆稳定细胞株,设对照组为慢病毒感染的HaCaT细胞和未感染的HaCaT细胞,Western blot检测分析YY1蛋白的表达水平;将慢病毒-YY1-HaCaT组和HaCaT-YY1组细胞各分成2组,一组在低钙(0.12 mmol/L)培养基条件下培养48 h,另一组在低钙(0.12 mmol/L)培养基条件下培养24 h后在高钙(0.35 mmol/L)培养基条件下再培养24 h,用Western blot法检测YY1过表达对HaCaT细胞分化中的表皮细胞特异性分化角蛋白K1、K10、K14和晚期分化产物外皮蛋白、中间丝相关蛋白、兜甲蛋白的影响。结果与结论:慢病毒-YY1成功感染HaCaT细胞,高钙条件下获得的单克隆细胞株过表达YY1蛋白,可抑制K1、外皮蛋白和兜甲蛋白的合成,从而阻止表皮细胞角质化进程并使细胞处于未分化状态。结果说明慢病毒可高效感染皮肤人永生化表皮细胞株HaCaT细胞,YY1可能是抑制基底表皮细胞分化并维持其未分化增殖状态的重要因子之一。

重组慢病毒介导人凝血Ⅸ因子基因感染HUCMSCs的实验研究

目的探讨慢病毒介导人凝血Ⅸ因子(human clotting factorⅨ,hFⅨ)感染人脐带间充质干细胞(human um-bilical cord mesenchymal stem cells,hUCMSCs)后hFⅨ的表达情况。方法重组构建慢病毒载体GV240-hFⅨ-EGFP。以脂质体介导法共转染293T细胞包装生产慢病毒。以不同感染复数(multiple of infection,MOI)感染hUCMSCs,荧光显微镜观察细胞感染效率,流式细胞仪检测验证。以最适MOI感染hUCMSCs,RT-PCR检测hFⅨmRNA水平,ELISA检测FⅨ蛋白含量(FⅨ∶Ag)及一期法检测FIX凝血活性(FⅨ∶C)。结果制备出了滴度为2×108TU/mL的重组慢病毒。MOI=10时能高效感染hUCMSCs,感染效率为(92.92±6.32)%。RT-PCR结果示只有转染组有hFⅨmRNA转录。感染后1 d,hUCMSCs即可有效分泌hFⅨ,在5 d时达到最高峰,FⅨ∶Ag为(87.18±0.86)ng/(106.24 h),FⅨ∶C为(44.3±3.2)%,高水平分泌可至少持续29 d。结论重组GV240-hFⅨ-EGFP慢病毒感染hUCMSCs后能持续高水平分泌具有凝血功能活性的hFⅨ蛋白。

慢病毒是如何感染致病的

慢病毒(Slow Virus)是英国兽医病理学家Sigurdsson于1954年在研究绵羊慢性传染病时提出来的。近年来,我国学者认为病毒作为分子生物,其生物特征无所谓怏与慢,只是其引起的临床表现依病程而言有快有慢而已。

经尿道灌注慢病毒转染豚鼠膀胱的研究

目的观察慢病毒介导绿色荧光蛋白(GFP)转染膀胱的效果,并确定取得较好转染效果的病毒量。方法豚鼠经尿道灌注及静脉注射不同量的携带GFP基因的慢病毒,饲养7 d后取膀胱、肝、肺、肾等组织冰冻切片,激光共聚焦显微镜下观察各组织GFP分布。结果滴度为4×108的慢病毒,经尿道膀胱灌注30μL时可见组织黏膜下有绿色荧光,40μL时组织肌层有广泛绿色荧光分布,50μL时组织肌层有更强绿色荧光分布,静脉注射25μL时组织肌层可见有广泛绿色荧光分布;经尿道灌注各病毒量下未在膀胱外组织见有明显绿色荧光分布,静脉注射下在肝、肺等组织见有较膀胱更强绿色荧光。结论慢病毒可以成功介导GFP转染豚鼠膀胱,并且经尿道灌注可以避免静脉注射带来的病毒在膀胱外组织广泛分布,能够为膀胱疾病的临床治疗带来新的研究方向和手段。

Let-7c慢病毒载体对骨髓间充质干细胞体外诱导分化为神经细胞的影响

背景:微小RNA参与调控干细胞增殖、分化、衰老等过程,通过了解Let-7家族成员Let-7c对骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的影响可以为干细胞移植治疗提供新思路。目的:探讨Let-7c慢病毒载体在体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化中的作用。方法:构建Let-7c上调及下调慢病毒载体并体外转染大鼠骨髓间充质干细胞,筛选最适转染复数;实验分为未转染组、阴性转染组(转染空白慢病毒)、转染上调组(转染LV-rno-Let-7c-up)、转染下调组(转染LV-rno-Let-7c-5p-inhibition);采用法舒地尔诱导转染后的大鼠骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,倒置荧光显微镜下观察骨髓间充质干细胞转染后荧光表达,免疫细胞化学染色检测神经元标记物NSE和MAP-2的表达,RT-PCR检测MAP-2 m RNA的表达,MTT法检测细胞存活率。结果与结论:倒置荧光显微镜下观察大鼠LV-rno-Let-7c-up和LV-rno-Let-7c-5p-inhibition慢病毒载体转染成功。法舒地尔可以诱导骨髓间充质干细胞分化为神经细胞,与阴性转染组相比,转染上调组的诱导效率升高(P<0.05),NSE和MAP-2表达率上升(P<0.05),转染下调组的诱导效率下降,NSE和MAP-2表达率下降(P<0.05)。转染LV-rno-Let-7c-up后骨髓间充质干细胞经法舒地尔诱导向神经细胞分化比率增加,Let-7c可能具有促进骨髓间充质干细胞向神经细胞分化的作用。

经尿道灌注干细胞白血病基因慢病毒转染豚鼠糖尿病膀胱病变的效果研究

目的 制备糖尿病膀胱病变（DCP）豚鼠模型,经尿道灌注干细胞白血病（SCL）基因慢病毒,观察其转染效果及稳定性。方法 2014年11月—2015年6月,采用随机数字表法在75只普通级荷兰种雄性豚鼠中选取60只单次腹腔注射链脲佐菌素（200 mg/kg）,常规饲养6周后按血糖水平〉11.1 mmol/L筛选糖尿病模型,再常规饲养4周后通过尿流动力学检测仪筛选DCP模型;另15只作为对照组,单次注射配制的链脲佐菌素缓冲液,饲养时间相同。采用随机数字表法从成功造模的DCP模型中选取15只后,再采用随机数字表法分为Ⅰ组（3只）和实验组（12只）,Ⅰ组不予处理,实验组经尿道分2次灌注SCL基因慢病毒（1.6×10^7TU）,于2次灌注结束后第2、7、14、28天分别采用颈椎脱臼法处死实验组豚鼠3只,记为Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ组,Ⅰ组与Ⅱ组一同处死,取膀胱组织冷冻于液氮中,甘油封固后激光共聚焦显微镜下观察组织中绿色荧光分布情况。采用qRT-PCR检测SCL mRNA表达水平。结果 DCP模型造模过程中,糖尿病模型筛选时弃去18只,尿流动力学检测仪筛选时弃去19只,最终得到DCP模型豚鼠23只,记为DCP模型组。DCP模型组豚鼠最大逼尿肌压低于对照组,最大膀胱容量大于对照组（P〈0.01）。Ⅰ组豚鼠膀胱组织未见绿色荧光分布,Ⅱ组豚鼠膀胱组织绿色荧光不明显,Ⅲ组豚鼠膀胱组织可见全层遍布极强绿色荧光,Ⅳ组豚鼠膀胱组织可见全层强绿色荧光,Ⅴ组豚鼠膀胱组织仍可见绿色荧光存在。Ⅰ组豚鼠膀胱组织SCL mRNA表达水平为（1.00±0.00）,Ⅱ组豚鼠膀胱组织SCL mRNA表达水平是Ⅰ组的（1.22±0.06）倍,Ⅲ组豚鼠膀胱组织SCL mRNA表达水平是Ⅰ组的（50.45±3.17）倍,Ⅳ组豚鼠膀胱组织SCL mRNA表达水平是Ⅰ组的（24.75±6.49）倍,Ⅴ组豚鼠膀胱组织SCL mRNA表达水平是Ⅰ组的（3.27±1.00）倍。结论 SCL基因慢病毒载体转染豚鼠DCP膀胱成功,并能稳定表达,有可能为DCP的临床治疗带来新的研究方式。

Tmub1过表达及沉默慢病毒载体转染对大鼠BRL-3A肝细胞增殖的影响

目的探讨Tmub1蛋白在肝细胞增殖中的作用。方法分别使用Tmub1沉默慢病毒载体、Tmub1过表达慢病毒载体及对应的空载体转染大鼠BRL-3A肝细胞,得到稳定转染的细胞。转染后采用Western blotting检测Tmub1蛋白的表达,MTT法检测细胞增殖情况,流式细胞术检测细胞周期。结果转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显增加,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞Tmub1蛋白表达明显降低,与正常肝细胞比较,差异均有统计学意义(P<0.01)。转染LV-Tmub1慢病毒的肝细胞增殖最快,转染LV-Tmub1-RNAi慢病毒的肝细胞增殖最慢,两组之间差异有统计学意义(P<0.01)。过表达Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞的G2+S期明显长于沉默Tmub1慢病毒载体转染的肝细胞,差异有统计学意义(P<0.01)。结论 Tmub1蛋白可促进BRL-3A肝细胞的增殖。

携带Bcl-2基因的慢病毒对原代培养的人卵巢颗粒细胞的影响

目的探讨携带Bcl-2基因的慢病毒对体外培养的原代人卵巢颗粒细胞感染效率及对细胞凋亡的影响。方法构建携带Bcl-2基因的慢病毒载体,包装成高滴度慢病毒,将重组慢病毒在体外分别以不同感染复数(MOI)值(10、50、100、200、400)感染人卵巢原代颗粒细胞,观察感染24、48、72、96h后的感染效率及细胞增殖情况;将人卵巢颗粒培养24h后,分为3组。实验组:加MOI值为100的重组慢病毒GC-FU-Bcl-2;空白对照组:不加病毒;空载体对照组:加空载病毒GC-FU-EGFP。转染后第3、7天,采用Western blotting及反转录聚合酶链反应(RT-PCR)分别检测目的基因Bcl-2在人卵巢原代颗粒细胞中的蛋白及mRNA的表达水平。同时转染后第3天采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果原代培养的人卵巢颗粒细胞24h即贴壁,集落样生长,呈多角形或梭形;当MOI为100时,细胞的形态和生长不受影响,且感染效率较高,感染后72h达高峰,感染率达60%。携带Bcl-2基因的慢病毒感染靶细胞后,实验组中检测到Bcl-2基因及蛋白的表达,且卵巢颗粒细胞的凋亡率明显低于空载体对照组。结论携带Bcl-2基因的慢病毒感染原代培养的人卵巢颗粒细胞后可过度分泌Bcl-2蛋白,抑制细胞凋亡。

小鼠Islet-1基因RNAi慢病毒载体的构建

目的构建高效沉默小鼠Islet-1基因的慢病毒载体。方法针对小鼠Islet-1基因设计3个RNAi靶序列,合成相应的短发卡RNA(shRNA)寡核苷酸序列(oligo):Sh1、Sh2、Sh3,分别插入经酶切后的PLVTHM载体。经PCR和测序方法筛选阳性克隆,抽提阳性克隆质粒经大肠埃希菌扩增后,与其辅助包装质粒共同感染293T细胞制备慢病毒载体,利用斑形成试验测定病毒滴度。感染C3H10T1/2细胞株,以流式细胞仪检测其感染效率、荧光定量PCR检测其干扰效率。结果与正常C3H10T1/2细胞比较,测序及PCR结果显示目的片段插入正确;病毒滴度值为3.87×108TU/ml;慢病毒载体对C3H10T1/2细胞感染效率达90.36%;3个靶点(抑制效率分别为76.8%5、5.1%和11.7%)均有干扰效果,与正常细胞比较,Sh1靶点干扰效果最为显著(76.8%,P<0.05)。结论成功构建高效沉默Islet-1基因慢病毒载体。

sox9和LMP1基因慢病毒载体共转染兔骨髓间充质干细胞后的表达

背景:与传统细胞因子诱导液诱导的方法相比,将基因通过慢病毒转染入宿主细胞,可以得到长期高效的持续表达,采取双/多基因共修饰治疗的策略,较采用单一的因子来诱导骨髓间充质干细胞向类髓核细胞方向转化可获得更好的效果。目的:构建sox9基因慢病毒载体以及LMP1基因慢病毒载体,并共转染兔骨髓间充质干细胞,观察SOX9和LMP1基因的表达情况。方法:双酶切从Gene Art提供的含sox9基因序列的质粒13ABIV6C_1366933并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-EGFP载体,获得含sox9基因的质粒p LMIG-13GS0345-1。通过单链oligo设计及合成LMP1基因序列,并克隆到p Lenti6.3_MCS_IRES2-Ds Red-Monomer载体,获得含LMP1基因的质粒13GS0318-1。再通过293T细胞包装后获得绿色荧光蛋白标记的sox9基因慢病毒载体(Lenti-SOX9-GFP),以及红色荧光蛋白的LMP1基因慢病毒载体(Lenti-LMP1-RFP)。将Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞,观察sox9基因及LMP1基因的表达情况。结果与结论:测序结果显示质粒p LMIG-13GS0345-1和13GS0318-1中的插入序列与基因库中sox9(NM_000346)及LMP1(AF345904.1)基因序列完全一致,成功构建Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体。Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP共转染兔骨髓间充质干细胞后同一视野下可观察到绿色和红色荧光蛋白的共表达,RT-PCR与Western Blot检测结果证明Lenti-SOX9-GFP和Lenti-LMP1-RFP可成功高效共转染目的细胞并可在m RNA及蛋白水平同时表达SOX9及LMP1。结果说明实验成功构建了绿色荧光蛋白标记的携带sox9基因的Lenti-SOX9-GFP慢病毒载体,以及红色荧光蛋白的携带LMP1基因的Lenti-LMP1-RFP慢病毒载体,为sox9和LMP1基因共修饰组织工程髓核的研究提供前期实验基础。

人TNF-α重组慢病毒载体构建及其脐血间质干细胞表达

目的构建带有人TNF-α基因的慢病毒载体,并且观察该基因在体外人脐血间质干细胞中的表达。方法通过逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)从PCD DNA-TNF-α质粒中获得人TNF-α基因,利用Infusion技术重组构建慢病毒载体穿梭质粒pGC-FU-TNF-α,在脂质体Lipofectamine 2000介导下与结构质粒pHelper 1.0和包膜质粒pHelper 2.0共转染293T细胞包装生产慢病毒。将人脐血间质干细胞分为实验组(pGC-FU-TNF-α)、空载体对照组(pGC-FU-EGFP)及空白组(脐血间质干细胞),分别用重组慢病毒、空载慢病毒、PBS感染后,采用RT-PCR以及ELISA方法检测TNF-α表达。结果所获TNF-α基因测序证明与GenBank中序列一致;重组慢病毒载体质粒pGC-FU-TNF-α经鉴定正确;三质粒共转染293T细胞成功,收集、浓缩病毒后测定其滴度为2×107TU/L,感染脐血间质干细胞后RT-PCR、ELISA检测3组细胞均有TNF-α表达,其中实验组大量表达TNF-α,与其余两组比较差异有显著性(F=11.677、21.321,P<0.01)。结论成功构建带有TNF-α基因的慢病毒载体并实现在脐血间质干细胞中的表达,为脐血间质干细胞转基因治疗胃癌的应用奠定基础。

慢病毒转染基质金属蛋白酶9对星形胶质细胞水通道蛋白4表达的研究

目的观察慢病毒转染基质金属蛋白酶9(matrix metalloproteinase 9,MMP-9)后,星形胶质细胞水通道蛋白4(aquaporin,AQP4)表达变化,探讨慢病毒转染星形胶质细胞的可行性。方法取出生2d的SD乳鼠大脑皮质进行星形胶质细胞纯化培养,利用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein,GFP)基因的慢病毒转染细胞,通过倒置荧光显微镜观察细胞内GFP显影效果。将细胞分为正常组、阴性对照组[转染小干扰RNA(siRNA)]和MMP-9慢病毒组(转染MMP-9siRNA),用RT-PCR检测MMP-9 mRNA和AQP4 mRNA表达变化。结果MMP-9慢病毒组细胞增殖较快,第3天细胞内GFP在倒置荧光显微镜显影>90%,到达80%左右转染率的最佳感染条件为复感染指数=30~50。正常组MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达为0.982±0.169和1.095±0.035,阴性对照组分别为1.104±0.271,1.112±0.026,MMP-9慢病毒组表达分别为0.552±0.197和0.652±0.042。正常组与阴性对照组MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达比较,差异无统计学意义(P>0.05);与阴性对照组和正常组比较,MMP-9慢病毒组细胞MMP-9mRNA和AQP4mRNA表达明显下调,差异有统计学意义(P<0.05)。结论慢病毒转染星形胶质细胞MMP-9可介导AQP4表达下调,为进一步利用星形胶质细胞进行缺血性脑水肿基因调节的研究提供实验依据。

红色荧光基因慢病毒转染骨髓间充质干细胞:表达21d对细胞活性无影响

背景:掌握转染的最佳感染复数和产生较强荧光强度的时间,可为后期观察人骨髓间充质干细胞在动物模型体内的示踪奠定基础。目的:探讨HIV-1来源的慢病毒携带增强型红色荧光蛋白转染人骨髓间充质干细胞的可行性。方法:将第4代人骨髓间充质干细胞分成空白组和感染复数为2,3,4组,以细胞数5.0×105个接种于12孔培养皿,添加含有体积分数为1%胎牛血清的成人骨髓间质干细胞完全培养基1 m L。调整慢病毒携带增强型红色荧光蛋白感染滴度为1.0×1011TU/L,加入各组培养皿中病毒液体积分别为10,15,20μL,感染复数分别为2,3,4,空白组加入10μL PBS。转染后24,72 h荧光倒置显微镜观察细胞红色荧光表达情况并计算出转染率。结果与结论:增强型红色荧光蛋白在骨髓间充质干细胞中稳定表达,转染后24 h倒置荧光显微镜下可见红色荧光,72 h荧光达到最强,细胞转染率与感染复数值呈线性增长关系。转染后21 d内,各转染实验组的人骨髓间充质干细胞数量与空白组比较差异无显著性意义(P>0.05),以上结果提示采用HIV-1来源的慢病毒载体介导增强型红色荧光蛋白转染标记人骨髓间充质干细胞是可行的,当感染复数为4时转染效率高并可持续表达至少21 d,且标记后对其增殖活性无影响。