TNF-α诱导的NF-κB慢病毒报告基因系统的构建

目的:构建一种肿瘤坏死因子α(TNF-α)诱导的NF-κB慢病毒报告基因系统。方法:以NF-κB信号通路为基础,设计并构建含有NF-κB响应元件和mCherry报告基因序列的表达载体,并进一步建立受NF-κB调控表达mCherry的细胞株,最后使用TNF-α进行刺激验证。结果:质粒经过双酶切鉴定,得到约1500 bp的目的片段,符合预计大小且测序分析正确,表明质粒构建成功;在TNF-α刺激实验中,NF-κB信号通路的刺激物TNF-α作用于构建的NF-κB调控表达mCherry荧光蛋白的细胞株后出现特异性荧光反应,TNF-α诱导组的细胞有较强的mCherry表达,阳性率约为90%,而未加TNF-α组细胞mCherry阳性表达率约为10%。结论:构建了受NF-κB调控稳定表达mCherry的慢病毒报告基因系统,可用于对NF-κB活化效果的检测及筛选,具有普适性的应用价值。

用于转化生长因子β/Smad信号转导通路抑制剂筛选的慢病毒报告载体的构建

目的构建由转化生长因子β(TGF-β)诱导的含有Smad响应元件(SmadRE)和红色荧光蛋白mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,为筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂提供有效工具。方法合成UAS-SmadRE-Pmin-Gal4VP64-mCherry和UAS-SmadRE-Pmin-Gal4VP64-lucifer⁃ase报告基因序列,分别将其插入经EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后的pCDH-GFP-Puro-noCMV慢病毒质粒载体,获得响应TGF-β的含有SmadRE和mCherry或荧光素酶报告基因序列的慢病毒报告载体,分别命名为pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase。利用慢病毒三质粒包装系统在293FT细胞中分别包装出慢病毒并感染A549细胞(分别命名为USPG-mCherryA549和USPG-luciferaseA549细胞),在倒置荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白(GFP)的表达,鉴定A549细胞是否被感染成功。用TGF-β(10μg·L^(-1))及其受体拮抗剂LY2109761(5μmol·L^(-1))和SB431542(10μmol·L^(-1))分别处理USPG-mCherry A549和USPG-luciferaseA549细胞24 h,倒置荧光显微镜下观察USPG-mCherryA549细胞mCherry的表达,用荧光素酶报告基因检测试剂盒检测USPG-luciferaseA549细胞荧光素酶的表达,验证所构建慢病毒报告载体用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂的可行性。用TGF-β及其受体拮抗剂LY2109761和SB431542处理A549细胞24 h,Western印迹法检测A549细胞磷酸化Smad2/3蛋白表达,验证LY2109761和SB431542对TGF-β/Smad信号转导通路的抑制作用。结果经限制性内切酶酶切鉴定及测序分析,成功构建pCDH-USPG-mCherry和pCDH-USPG-luciferase慢病毒重组质粒;分别转染293FT细胞包装出慢病毒并感染A549细胞,倒置荧光显微镜下观察到被感染的A549细胞表达GFP,表明USPGmCherryA549和USPG-luciferaseA549细胞构建成功。加入TGF-β处理24 h后,USPG-mCherryA549细胞表达mCherry,USPG-luciferaseA549细胞表达荧光素酶;而加入LY2109761和SB431542后,USPG-mCherryA549细胞几乎检测不到mCherry的表达,USPG-luciferaseA549细胞检测不到荧光素酶的表达。Western印迹法结果表明,TGF-β刺激后A549细胞中有磷酸化Smad2/3蛋白表达,加入LY2109761和SB431542后未检测到磷酸化Smad2/3蛋白表达。结论成功构建由TGF-β诱导的受Smad调控表达mCherry和荧光素酶的2个慢病毒报告载体,可有效感染目的细胞。该慢病毒报告载体可用于筛选TGF-β/Smad信号转导通路抑制剂。