p62基因过表达慢病毒载体的构建及表达

目的构建p62基因过表达慢病毒载体及其表达系统,并在人单核细胞白血病细胞(THP-1)中稳定表达,为在细胞水平研究p62基因的作用提供途径与方法。方法采用聚合酶链式反应(PCR)扩增p62基因片段,将扩增产物连接至线性化pcDNA3.1-Flag-PCDH10真核表达慢病毒载体;PCR鉴定重组质粒,将构建成功的重组质粒和包装质粒共转染至人胚胎肾细胞293(HEK 293T);用重组慢病毒感染人单核细胞白血病(THP-1)细胞,氨苄霉素筛选阳性细胞克隆株;Western blot和实时荧光定量聚合酶链反应(RT-qPCR)检测高表达p62基因的THP-1细胞株(过表达组)和转染不含p62基因空质粒(对照组)的THP-1细胞株;感染肺炎克雷伯菌(Klebsiella Pneumoniae,K.p.)后,RT-qPCR检测THP-1细胞中肿瘤坏死因子(TNF)-α、白细胞介素(IL)-1β和趋化因子1(Cxcl1)表达水平。结果通过PCR成功获得p62基因片段并连接到pcDNA3.1-Flag-PCDH10病毒载体上,并且PCR检测显示p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10重组质粒构建成功;挑选慢病毒感染THP-1细胞后抗氨苄青霉素细胞株,Western blot检测结果显示药筛存活的THP-1细胞较对照组细胞P62蛋白表达增多(P<0.001),且RT-qPCR检测显示p62 mRNA表达增高(P<0.001),说明成功构建高表达P62蛋白的THP-1细胞株;感染K.p.后,高表达P62的THP-1细胞中TNF-α、IL-1β和Cxcl1表达水平增高(P<0.01)。结论经三质粒包装系统可以成功构建p62-pcDNA3.1-Flag-PCDH10慢病毒载体及高表达P62蛋白THP-1细胞株,为后续p62基因的研究提供了基础。

BMP7过表达慢病毒载体构建及其对小鼠主动脉平滑肌细胞钙化的影响

目的构建骨形态发生蛋白7(BMP7)过表达慢病毒载体,分析BMP7过表达对小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达的影响及其对共培养血管平滑肌细胞(VSMCs)钙化的影响。方法根据目的基因信息Mouse-BMP7(NM_007557.3)和质粒信息pLVX-zsGreen-C1进行基因序列合成,构建BMP7过表达慢病毒。qPCR检测BMP7过表达慢病毒感染效率;Western blot检测其感染的小鼠主动脉内皮细胞Jagged1蛋白表达。将过表达BMP7慢病毒感染的内皮细胞与VSMCs共培养,茜素红染色观察共培养后VSMCs钙化情况。结果成功构建BMP7过表达慢病毒载体并转染至小鼠主动脉内皮细胞。qPCR检测结果提示,与正常对照组比较,BMP7过表达组的BMP7 mRNA相对表达量显著升高(P<0.01),空载体对照组BMP7 mRNA无显著变化(P>0.05)。Western blot结果显示,BMP7过表达组内皮细胞Jagged1蛋白表达水平较正常对照组显著降低(P<0.01),而空载体对照组内皮细胞Jagged1蛋白水平较正常对照组无显著改变(P>0.05)。茜素红染色结果提示,与感染过表达BMP7慢病毒的内皮细胞共培养后,VSMCs的钙化程度明显增加。结论成功构建小鼠BMP7过表达慢病毒载体,并发现过表达BMP7可以降低小鼠主动脉内皮细胞Jagged1表达,并促进共培养的VSMCs钙化。

hsa-miR-128慢病毒载体的构建及其对胶质瘤细胞增殖的影响

目的:构建含hsa-miR-128-1和hsa-miR-128-2前体的慢病毒表达载体,建立能够稳定表达目的基因的人胶质瘤U87细胞株。研究hsa-miR-128对胶质瘤细胞增殖的影响。方法:扩增hsa-miR-128前体片段,克隆入Pentr3c载体,利用LR clonaseⅡ酶将目的片段转接于Plenti6.3质粒,包装病毒,以改构的Plenti6.3-mCherry载体包装的病毒为对照,感染人胶质瘤U87细胞,通过Blasticidin筛选出能够稳定表达抗生素抗性的细胞株。荧光显微镜观察mCherry的荧光表达,实时荧光定量检测miR-128的表达量,流式细胞仪检测细胞周期,MTT检测细胞增殖。结果:成功构建重组慢病毒载体Plenti6.3-miR-128-1和Plenti6.3-miR-128-2,经Blasticidin筛选细胞株、mCherry荧光表达和实时荧光定量PCR验证,成功包装出慢病毒。病毒滴度测定在1.1×107-8.3×107TU/mL之间,细胞周期和MTT结果提示miR-128-1和miR-128-2高表达的U87细胞株均表现增殖抑制。结论:成功构建了分别含有两种hsa-miR-128前体的慢病毒表达载体,筛选出稳定表达hsa-miR-128的U87细胞株。miR-128-1和miR-128-2均抑制胶质瘤U87细胞增殖。

重组慢病毒LV5-NE的构建及NE促进NB4细胞增殖

目的构建重组慢病毒LV5-NE筛选纯NB4/LV5-NE细胞株,探讨中性粒细胞弹性蛋白酶(NE)对人急性早幼粒细胞白血病细胞株NB4增殖的影响,为研究NE致白血病的可能机制奠定基础。方法以质粒p CMV-myc-NE为模板得到PCR产物NE,将NE基因连接到穿梭载体p GLV10/U6/GFP/Puro后酶切验证,将序列正确的质粒与包装质粒p Gag/Pol、pRev、p VSV-G共转染293T细胞。测定病毒滴度。实验分为空白组、LV5-NC组和LV5-NE组,病毒感染NB4细胞72 h后用嘌呤霉素筛选稳定表达的细胞。用Western blot检测NE在NB4细胞中的蛋白表达以及其切割作用;CCK-8法观察NB4细胞增殖能力;流式细胞术测定NB4细胞周期和凋亡;Western blot检测p Akt和Akt以及Bax和Bcl-2蛋白表达。结果成功构建表达NE的慢病毒LV5-NE,筛选得到纯NB4/LV5-NE细胞株,NE对NB4细胞的增殖有明显促进作用(P<0.05)结论 NE在NB4细胞株中稳定表达后中可促进NB4细胞的增殖,其增殖作用可能通过激活PI3K/Akt通路调节。

截短型小鼠成纤维细胞生长因子受体-1基因慢病毒载体构建及在真核细胞中的表达

本研究旨在克隆小鼠成纤维细胞生长因子受体1(fibroblast growth factor receptor 1,fgfr1)基因,构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)的截短型fgfr1(△fgfr1)重组慢病毒载体并在真核细胞中表达。采用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)以BALB/c胎鼠脑组织为模板克隆全长型fgfr1基因,连接至克隆载体pCR-Blunt,通过反向PCR技术删除胞内磷酸化区域获得△fgfr1,限制性内切酶酶切后亚克隆至慢病毒转移质粒,构建携带EGFP及△fgfr1双顺反子自身失活型重组慢病毒表达质粒,通过脂质体转染法与包装质粒及包膜蛋白质粒共转染包装细胞293FT,超速离心浓缩病毒颗粒后转染293FT细胞,用荧光显微镜及流式细胞术(FCM)检测EGFP的表达,免疫印迹法(Western blot)鉴定截短型FGFR1蛋白表达。结果表明,成功克隆小鼠fgfr1基因,构建重组慢病毒转移载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1及对照载体LV-IRES-EGFP,三质粒系统共转染293FT细胞后获得病毒滴度达到108 TU/ml。以重组病毒载体转染293FT细胞后第4天在荧光显微镜下观察到较强绿色荧光表达,FCM检测转染效率可达95%,Western blot检测显示,转染后293FT细胞表达截短型FGFR1蛋白。结论:成功构建了自身失活型慢病毒载体LV-IRES-EGFP-△fgfr1,并在真核细胞中获得表达。

SP110基因过表达慢病毒载体的构建与包装

目的构建核体蛋白SP110基因过表达慢病毒载体,并进行慢病毒包装,为研究SP110在结核病中的作用机制奠定基础。方法利用PCR技术获得SP110基因序列并将其插入到慢病毒穿梭质粒LV5中,获得重组慢病毒质粒V-SP110,经酶切鉴定及DNA测序鉴定后,用RNAi-Mate将重组质粒和慢病毒包装质粒系统(pGag/Pol、pRev、pVSV-G)包装成重组慢病毒颗粒,共转染293T细胞,包装产生慢病毒。通过荧光显微镜或FACS计数荧光细胞,结合稀释倍数计算病毒滴度。结果酶切鉴定结果显示产生约1650 bp的片段,片段大小与SP110基因cDNA大小一致。DNA测序比对测序结果与预期SP110基因序列完全一致,说明SP110基因正确插入载体中,成功构建了SP110基因过表达载体。经293T细胞包装后,成功获得病毒滴度为1.0×10^8 TU/mL的重组慢病毒LV5-SP110。结论SP110基因过表达慢病毒载体构建与包装成功完成,为进一步探讨SP110基因在结核病发生发展中的作用提供工具。

禽白血病病毒衣壳蛋白P27慢病毒载体的构建及其在鸡肝癌细胞中的表达

为构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白P27慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞LMH中的表达,试验以实验室前期构建的pcDNA3.1-p27为模板,扩增p27基因,克隆入pLVX-IRES-ZsGreen1载体,构建的重组质粒命名为pLVX-p27,与辅助质粒psPAX2和pMD2.G共转染至HEK293T细胞,包装获得表达p27基因的重组慢病毒。将慢病毒上清感染293T和LMH细胞,检测细胞中p27基因的转录水平和蛋白表达水平。结果显示:重组质粒pLVX-p27构建正确,收集的慢病毒上清滴度为9×10^(4)TU/mL;实时荧光定量PCR、Western blot和共聚焦荧光试验结果显示P27蛋白主要定位于胞浆,p27基因的RNA和蛋白表达量在感染后96 h内随着感染时间延长逐渐升高。研究表明:表达p27基因的慢病毒包装成功,并且能感染293T及禽源LMH细胞,为进一步研究P27的生物学功能提供了工具。

人端粒酶反转录酶启动子调控的microRNA-21海绵抑制剂慢病毒载体的构建及功能分析

目的构建由人端粒酶反转录酶(h TERT)启动子调控的microRNA-21(miR-21)海绵抑制剂慢病毒载体,探讨该重组慢病毒载体对端粒酶阳性肿瘤的特异性抑瘤作用及其机制。方法将h TERT启动子核心序列取代慢病毒载体RFP上游的CMV启动子;将重组成功的慢病毒载体Lenti-h TERT-miR-21-sp感染端粒酶阴性细胞HBE及端粒酶阳性肿瘤细胞A549、H1299,观察RFP的表达情况;同时在肿瘤细胞中检测抑制miR-21表达后对细胞生长、凋亡的影响;并应用含人类全长基因的c DNA表达谱芯片,对抑制miR-21表达后人肺癌细胞株A549中差异表达基因进行分析。结果经酶切及测序法鉴定慢病毒载体构建成功;将包装后获得的高滴度病毒颗粒感染目的细胞后,发现重组病毒只能在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性高表达,且下调miR-21基因表达后,肿瘤细胞的生长能力受到抑制,凋亡率明显上升(P<0.05);与对照相比,抑制miR-21表达的A549细胞中差异表达的基因共有64条,其中20条上调,44条下调。结论 h TERT启动子能够严格地引导病毒载体在端粒酶阳性肿瘤细胞中特异性的封闭miR-21的表达,实现抑制肿瘤细胞生长的作用;芯片结果提示,miR-21引发肺癌可能是多因素多基因共同作用的结果。

CFL1RNAi慢病毒的构建及其对人脐静脉内皮细胞的增殖抑制作用

目的观察干扰CFL1对HUVEC的增殖抑制作用。方法以cfl1基因为模板,设计RNA干扰靶点,构建cfl1基因RNAi慢病毒;慢病毒感染人脐静脉内皮细胞HUVEC后采用realtimePCR鉴定CFL1RNAi慢病毒感染效果,采用CCK-8法检测HUVEC细胞的增殖抑制情况。结果 CFL1RNAi慢病毒干扰HUVEC细胞后realtimePCR证实CFL1 RNAi慢病毒可下调cfl1基因的表达;CCK-8法证实cfl1基因表达下调可抑制HUVEC细胞的增殖。结论 CFL1 RNAi慢病毒感染HUVEC细胞后可明显抑制cfl1基因表达,抑制HUVEC细胞增殖。

短发夹RNA慢病毒载体稳定抑制β-catenin表达的CPCs的构建

目的构建干扰大鼠耳蜗前体细胞（CPCs）β-catenin基因的短发夹RNA（shRNA）重组慢病毒载体，并对构建的载体进行鉴定。方法用聚合酶链式反应（PCR）方法扩增β-catenin基因，根据β-catenin基因设计shRNA oligo构建干扰载体，利用Gateway技术构建携带β-catenin基因的shRNA慢病毒载体，将构建好的慢病毒载体与辅助质粒pLV/helper-SL3、pLV/helper-SL4、pLV/helper-SL5共转染293FT细胞，收集病毒上清获得病毒颗粒，经浓缩后用4种不同浓度（0.0、5.0、10.0、20.0 μl）的重组慢病毒瞬时感染大鼠CPCs，同时构建shRNA对照组，采用实时荧光PCR定量检测（qPCR）和免疫印迹法（Western blot）从基因和蛋白水平鉴定shRNA-β-catenin慢病毒载体对β-catenin的抑制效应。结果成功构建shRNA-β-catenin重组慢病毒载体，shβ-catenin和shβ-catenin-对照的病毒滴度分别为5.05×107和4.34×107。体外实验显示，4种不同浓度重组慢病毒转染的CPCs中的β-catenin蛋白量随着转染病毒浓度的增加而减少，各组间差异有统计学意义（P〈0.05），转染shβ-catenin的CPCs表达的β-catenin mRNA的量明显低于shβ-catenin-对照组，两组间差异有统计学意义（P〈0.05）。结论本次包装的β-catenin重组慢病毒载体具有较高的感染效力，慢病毒载体的成功构建为研究β-catenin在CPCs向听觉毛细胞的分化机制提供了一定的技术支持。

禽白血病病毒衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体的构建及其在鸡肝癌细胞系中的表达

构建禽白血病病毒(ALV)衣壳蛋白p15基因慢病毒表达载体,并检测其在鸡肝癌细胞系(LMH)中的表达情况,以探讨p15基因对病毒复制、免疫信号通路的影响。以真核表达质粒pCAGGS-p15为模板扩增p15全长基因,经双酶切后克隆到慢病毒载体plvx-IRES-ZsGreen1上,构建成plvx-p15-Flag慢病毒表达质粒,将该质粒与辅助质粒共转染293T细胞产生慢病毒,将细胞上清中的病毒感染LMH细胞,检测p15蛋白表达情况。慢病毒载体在293T细胞上包装完成后,病毒滴度为2.25×10^(5) TU/mL。慢病毒感染LMH细胞,基因和蛋白水平检测结果表明,p15蛋白表达良好。表达ALV p15基因的慢病毒包装成功,并且能够感染鸡源LMH细胞。该载体的构建为进一步研究p15蛋白的生物学功能提供工具。