利用CRISPR/Cas9慢病毒系统敲除人源HOIP基因

泛素化修饰是一种能调节诸多细胞功能的重要蛋白质翻译后修饰,近几年研究发现了一种新的泛素化修饰即线性泛素化修饰,LUBAC(linear ubiquitin chain assembly complex)是目前已知唯一的导致蛋白质发生线性泛素化修饰的E3酶。目前LUBAC复合物的底物和功能所知甚少。为了探索LUBAC复合物新的底物和功能,利用CRISPR/Cas9慢病毒系统构建稳定敲除LUBAC核心组分HOIP基因的HeLa细胞系,通过质谱鉴定此细胞系和对照细胞的差异泛素化修饰蛋白质,即可能是LUBAC新的底物。首先将靶向HOIP基因的不同CRISPR序列插入lenti CRISPRv2载体中,制备慢病毒质粒感染He La细胞,然后使用嘌呤霉素压力筛选,用Western Blot方法检测HOIP基因的敲除效果,最后成功地构建HOIP基因稳定敲除HeLa细胞系。此稳定细胞系的构建为日后深入研究LUBAC的功能提供一个人类细胞模型。

慢病毒介导稳定表达增强小反刍兽疫病毒复制的山羊Vero/SLAM细胞系的建立

利用Gateway技术和慢病毒表达系统将山羊淋巴细胞信号活化因子SLAM稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,建立稳定表达可增强小反刍兽疫病毒(PPRV)复制的SLAM的Vero阳性细胞亚克隆,并验证阳性细胞亚克隆Vero/SLAM表达SLAM的活性、遗传稳定性及其对PPRV复制的增殖效果。分离山羊外周血淋巴细胞,提取基因组Total RNA,一步RT-PCR获得完整ORF的SLAM基因,采用BP及LR位点的基因重组技术,构建入门载体pDONR/SLAM并获得表达骨架pDEST/SLAM,与Packaging Mix pLP1、pLP2及VSV-G共转染293-FT细胞,获得SLAM复制缺陷型慢病毒样粒子,用其感染Vero细胞,杀稻瘟菌素抗性筛选获得阳性细胞克隆,通过靶标基因扩增、间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、Western blot免疫印迹检测技术、致细胞病变效应及Realtime RT-PCR等技术分别验证SLAM基因组整合、转录,SLAM蛋白表达、反应活性以及PPRV在表达SLAM阳性细胞亚克隆上的增殖效果。结果显示:SLAM受体基因被稳定整合在Vero细胞基因组染色体上,该受体蛋白表达于细胞周质,建立的细胞连续传代不丢失,接种病毒后致细胞病变时间由4～7d缩短为3.5d,TCID_(50)·0.1mL^(-1)由4.25增加为5.67,相对于正常Vero细胞,整合有SLAM的Vero细胞,由于表达了PPRV特异的细胞受体使PPRV对其易感性显著增强。成功建立一株稳定表达靶向增强PPRV复制的Vero/SLAM细胞:该细胞表达的SLAM具有明显增强PPRV复制的功能,不仅可以从细胞模型水平阐明增强PPRV复制的关键靶基因,也为PPRV感染引起宿主细胞的变化以及对机体的致病机制等提供研究工具。

慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响

目的观察慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长的影响。方法将pRNAT-shSTAT3重组慢病毒质粒进行包装产生病毒液,测定其滴度,感染大肠癌HT-29细胞,筛选获得阳性细胞株,实时定量PCR和Westernblot检测shRNA对STAT3基因的沉默效率,MTT法检测细胞生长情况,流式细胞仪检测细胞周期变化。结果成功包装慢病毒,其病毒悬液的滴度为2×107TU/mL。病毒液感染大肠癌HT-29细胞,经G418筛选获得稳定细胞株,实时定量PCR和Western blot结果分别显示HT-29细胞STAT3mRNA表达和蛋白明显减弱,表达量分别为(16.9±2.1)%、(18.8±2.4)%(P<0.01)。MTT结果显示STAT3基因沉默后的大肠癌HT-29细胞生长明显减慢,G0/G1期细胞占(68.73±2.88)%,S期细胞占22.93±1.10%,与对照组相比差异显著(P<0.01)。结论慢病毒介导shRNA沉默STAT3表达对大肠癌HT-29细胞生长有明显的影响,细胞生长速度明显减慢,细胞阻滞于G0/G1期。

gga-miR-21过表达细胞株对传染性法氏囊病病毒复制的影响

为研究microRNA(gga-miR-21)对传染性法氏囊病病毒(IBDV)复制的影响,本研究利用PCR方法从鸡的肝细胞基因组中扩增细胞pri-gga-miR-21,克隆于慢病毒表达质粒pL-EGFP中构建重组质粒pL-miR-21。将pL-miR-21与3个包装质粒pLP1、pLP2和pLP/VSVG共转染293FT细胞,制备含gga-miR-21基因的重组慢病毒VL+miR-21。将VL+miR-21感染DF-1细胞,经杀稻瘟菌素筛选获得过表达gga-miR-21的细胞株DF-miR-21,采用定量RT-PCR(qRT-PCR)检测表明,gga-miR-21的表达量比正常DF-1细胞提高60%。将IBDV接种于DF-miR-21细胞,在96 h后,其病毒滴度(104.75TCID50/0.1 mL)显著低于正常DF-1细胞的病毒滴度(108.75TCID50/0.1 mL)。采用生物信息学方法和双荧光素酶报告系统分析验证,在IBDV基因组VP1基因中存在gga-miR-21的结合靶点。将IBDV感染DF-miR-21细胞,采用western blot分析,VP1蛋白的表达量比正常DF-1细胞显著降低;用qRT-PCR分析,VP1 mRNA水平与正常DF-1细胞没有明显差异。本实验结果表明:细胞gga-miR-21可以抑制IBDV的复制,其分子作用机理是在VP1基因翻译水平上实现的。

H7N9流感假病毒制备条件的优化及其在中和抗体检测中的初步应用

目的:优化A/Anhui/1/2013(H7N9)流感假病毒的制备条件。方法:采用基于慢病毒载体的假病毒包装系统,通过对质粒组合方式、骨架质粒与包膜质粒配比、质粒复合物与转染试剂配比、换液时间点、维持液血清浓度、假病毒收获时间点等条件的探索,优化H7N9假病毒的包装条件;通过对4种假病毒纯化方案的比较,确定纯化方法;对纯化的假病毒进行Western印迹鉴定和电镜形态观察,了解其生物学特征;通过中和试验了解其在中和抗体检测中的应用情况。结果:假病毒包装条件优化结果表明,以血凝素(HA)与神经氨酸酶(NA)作为膜质粒,采用骨架质粒与膜质粒质量比3:1、质粒复合物与转染试剂质量体积比1:2混合,转染293FT细胞后10 h换含2%胎牛血清的维持液,培养48 h后收获上清,可高效获得流感假病毒AHop-H7N9pp;不同纯化方式获得的假病毒对感染H7N9的雪貂血清的中和抗体检测结果表明,假病毒纯化方法对中和抗体检测灵敏度的影响没有显著性差异;生物学特征分析显示,纯化的假病毒在电镜下具有典型的流感病毒形态,Western印迹能检测到HA和P24蛋白;多种流感疫苗小鼠血清中和试验结果表明该假病毒具有高度特异性,可用于H7N9中和抗体检测。结论:获得了包装有A/Anhui/1/2013(H7N9)HA与NA的假病毒,并确定了高效制备H7N9假病毒的各条件参数,为基于H7N9流感假病毒的中和抗体检测平台的建立奠定了基础。

猪瘟病毒E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中的表达和免疫原性分析

【目的】设计构建分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,并评估表达的E2-GM-CSF融合蛋白的免疫原性,为猪瘟病毒(Classical swine fever virus,CSFV)的防控提供新的候选亚单位疫苗。【方法】利用PCR方法扩增E2-GM-CSF基因并克隆入慢病毒表达载体pCDH,将得到的重组慢病毒质粒pCDH-E2-GM-CSF包装成E2-GM-CSF慢病毒颗粒,转导HEK293T细胞,经嘌呤霉素加压筛选获得分泌表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞,纯化表达的E2-GM-CSF融合蛋白经小鼠免疫试验验证其免疫原性。【结果】pCDH-E2-GM-CSF质粒经酶切鉴定,得到大小分别为8172 bp的载体片段和1521 bp的E2-GM-CSF基因片段,表明E2-GM-CSF基因成功克隆入pCDH载体;细胞基因组DNA PCR扩增结果为一条大小为1686 bp的条带,表明E2-GM-CSF基因成功整合至HEK293T细胞基因组;Western blotting分析获得约70 ku的条带,证明E2-GM-CSF融合蛋白在HEK293T细胞中成功分泌表达;SDS-PAGE验证显示,纯化后的E2-GM-CSF融合蛋白为单一条带,纯度较高,大小约70 ku;小鼠免疫血清ELISA检测结果表明,表达的E2-GM-CSF融合蛋白具有良好的免疫原性,免疫后第14天在小鼠血清中检测到效价为1∶300的E2特异性抗体,免疫后第21天E2特异性抗体效价达1∶900,免疫后第28天小鼠血清中的E2特异性抗体效价最高达到1∶8100,远高于E2蛋白的1∶1800。【结论】利用慢病毒载体构建的表达E2-GM-CSF融合蛋白的HEK293T重组细胞可正确分泌表达具有免疫原性的E2-GM-CSF融合蛋白,为CSFV的防控提供了新的候选亚单位疫苗,同时其构建、开发与评估过程也可为其他亚单位疫苗在哺乳动物细胞中的快速表达提供借鉴。

不同病毒载体系统应用于水牛体细胞转基因的研究

为了筛选出能高效率感染水牛体细胞、实现基因转移的病毒表达载体系统,试验采用携带增强绿色荧光蛋白(EGFP)的3种不同病毒载体介导的转基因,即逆转录病毒载体(pMX-EGFP)、诱导型慢病毒载体(FUW-TETO-EGFP)和慢病毒载体(FUGW-EGFP)系统进行病毒包装,然后分别一次或二次感染不同的水牛体细胞[水牛胎儿成纤维细胞(BFFs)和水牛胃细胞(BSTC)],应用荧光显微镜观察EGFP是否表达,然后用流式细胞仪检测感染效率,最后用G418对感染效率低的病毒载体系统进行阳性细胞系筛选。结果表明:3种病毒载体系统均能感染BFFs和BSTC,实现了基因的转移和表达,FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率显著高于pMX-EGFP系统(P<0.05);除FUGW-EGFP系统感染BSTC外,同种类型病毒载体系统感染同种细胞,二次感染的感染效率高于一次感染,但均差异不显著(P>0.05);同一病毒载体系统一次感染BSTC的效率高于感染BFFs。说明FUGW-EGFP、FUW-TETO-EGFP系统对水牛体细胞的感染效率高于pMX-EGFP系统,而且BSTC比BFFs更易被病毒感染。

慢病毒载体系统研究及应用进展

近年来,慢病毒载体系统(lentivirus vector system)研究发展迅速,作为基因改造的有效手段在生命科学领域中得到广泛运用。该系统携带基因片段大,整合效率高,能够感染多种分裂期与非分裂期的细胞,实现基因在宿主体内的长期稳定表达。现就慢病毒载体系统的基本结构、发展历程以及临床应用等方面的研究情况进行综述,介绍该系统目前的发展和应用现状。

稳定表达猪SAMHD1蛋白的MARC-145细胞系构建与鉴定

SAMHD1作为宿主的天然免疫限制性因子,参与机体的天然免疫调控,在机体抗病毒感染过程中发挥重要的作用。为了建立稳定表达猪SAMHD1的细胞系,本研究将猪SAMHD1全长编码基因克隆至慢病毒载体pWPXL,构建重组质粒pWPXLpSAMHD1。将重组质粒与慢病毒包装质粒共转染293T细胞,获得重组慢病毒。将该慢病毒感染MARC-145细胞,经嘌呤霉素筛选后,获得表达猪SAMHD1基因的MARC-pSAMHD1细胞系。经检测发现,该细胞系传至10代,仍能稳定表达猪SAMHD1蛋白。该细胞系的建立为猪SAMHD1抗病毒特性和猪繁殖与呼吸综合征病毒致病机理等研究奠定了坚实的基础。

人脐静脉内皮细胞Caveolin-1基因沉默模型的建立

目的:利用小干扰RNA(siRNA)技术建立人脐静脉内皮细胞(ECV304)小凹蛋白(Caveolin-1)基因沉默模型,为研究Cave-olin-1基因在人脐静脉内皮细胞中的作用。方法:通过Ambion专用软件对Caveolin-1基因编码区分析,设计合成短发夹RNA(shRNA)单链。通过T4连接酶将退火反应合成的shRNA双链克隆入含RNA PolIII聚合酶表达元件的pENTRTM/U6入门载体,并利用Gateway技术构建相应的慢病毒RNA干扰(RNAi)表达载体。用REAL-TIME RT-PCR、蛋白印迹法分析沉默效率。结果:测序结果显示pEN-TRTM/U6载体插入的Cavelin-1基因shRNA序列大小及阅读框架正确。LR重组反应后成功构建了针对Caveolin-1基因的RNAi慢病毒表达系统。转染ECV-304细胞获得对Caveolin-1的沉默效率大于85%。结论:成功地构建了针对Caveolin-1基因的RNAi慢病毒表达系统,获得了长期稳定的基因剔除效应。人脐静脉内皮细胞Caveolin-1基因沉默模型能长期保种及传代,为进一步研究Cav-eolin-1基因的功能奠定了基础。

神经胶质瘤细胞中SWAP-70慢病毒载体的构建及表达

目的构建下调及过表达SWAP-70的慢病毒载体,并检测其在神经胶质瘤细胞中的表达效果。方法采用PCR扩增目的基因片段,构建SWAP-70慢病毒表达载体,与慢病毒转染系统共转染至293T细胞。收集病毒颗粒上清液,感染神经胶质瘤细胞。荧光显微镜下观察细胞中绿色荧光蛋白的表达情况,并采用Western blot法鉴定SWAP-70蛋白表达水平。结果成功构建下调及过表达SWAP-70的慢病毒载体,感染神经胶质瘤细胞的效率达90%左右。Western blot结果显示,下调SWAP-70的神经胶质瘤细胞中SWAP-70蛋白表达降低(P<0.01),而过表达SWAP-70的神经胶质瘤细胞中内源性及外源性SWAP-70蛋白均有表达。结论成功建立下调及过表达SWAP-70的慢病毒载体,并有效转染神经胶质瘤细胞,为胶质瘤的基因治疗研究提供参考。

FGFR2IIIc重组慢病毒载体的构建及其在肌原细胞L6中的表达

目的:构建人FGFR2IIIc重组慢病毒表达系统,感染并筛选获得大鼠肌原细胞L6表达人FGFR2IIIc的重组细胞株,初步研究FGFR2IIIc对L6细胞的作用。方法:从人胎盘组织中获得FGFR2IIIc基因,并克隆到Gateway慢病毒系统的入门载体pENTR-11,采用LR重组酶将重组的pENTR-FGFR2IIIc和表达载体pLenti6/V5-DEST进行重组反应得到pLenti6/V5-DEST-FGFR2IIIc。将该重组表达载体和Viral Packaging Mix包装质粒通过阳离子脂质体共转染293FT细胞,待细胞完全裂解后收集重组慢病毒颗粒上清液;取适量上清液感染L6细胞,杀稻瘟毒素筛选2～4周,挑单克隆细胞进一步扩大培养并建立重组细胞株。RT-PCR、间接免疫荧光和Western blot鉴定重组细胞株中目的基因FGFR2IIIc的表达,bFGF和硫酸乙酰肝素共同诱导各重组L6细胞株后流式细胞术分析细胞周期,形态观察检测成肌分化水平,并通过相关信号通路抑制剂分析与各信号通路的关系。结果:构建了含人FGFR2IIIc基因的重组慢病毒表达载体,获得的重组慢病毒颗粒能高效感染L6细胞,RT-PCR和间接免疫荧光实验说明正确表达目的基因;流式细胞术结果表明L6中高表达FGFR2IIIc的重组细胞株的G1/G0期的细胞增多;各重组细胞株分别加入Erk1/2和p38通路抑制剂抑制诱导2天,发现重组细胞株发生不同的形态变化。结论:通过慢病毒表达系统,成功构建高表达FGFR2IIIc的重组L6细胞株,FGFR2IIIc通过Erk1/2和p38通路影响了L6细胞的形态发生,该结果为下一步在大鼠L6细胞中研究FGFR2IIIc基因与成肌分化功能相关性奠定基础。

慢病毒介导的HBV-X基因可调控表达小鼠模型的构建

理想动物模型的缺乏是乙型肝炎病毒(HBV)研究的一个重要障碍.本实验运用可调控慢病毒载体结合精子介导的方法构建体内乙型肝炎病毒X基因(HBV-X)可调控表达的转基因小鼠模型.首先构建了四环素调控的HBV-X基因可调控表达慢病毒颗粒,再对雄性小鼠进行睾丸注射,后与母鼠合笼,母鼠分娩获得子代小鼠,最后利用Southern blot,反向PCR,Western blot以及免疫组织化学等方法分别对子代小鼠体内病毒基因整合情况和可控诱导表达情况进行检测.结果提示子代小鼠体内成功整合HBV-X基因,并在强力霉素(Dox)诱导后,可表达目的蛋白,可调控转基因小鼠构建基本成功.

应用shRNA慢病毒技术抑制MCF7/MX100细胞中乳腺癌耐药蛋白的表达和功能(英文)

乳腺癌耐药蛋白(BCRP)在肿瘤细胞中的过表达可能导致肿瘤耐药性。RNA干扰是一种选择性抑制目的基因表达的实用技术。本研究旨在应用RNA干扰技术调控BCRP的表达和功能。首先在过表达BCRP的耐药细胞MCF-7/MX100中,评价了三种靶向于BCRP的si RNAs(si-BCRP1,si-BCRP2和si-BCRP3)。研究发现si-BCRP2和si-BCRP3对BCRP的m RNA和蛋白的抑制率分别超过90%和70%,进而导致MCF-7/MX100细胞中米托蒽醌的积聚显著上升。进一步的研究将生成si-BCRP2和si-BCRP3的shR NA序列克隆至慢病毒表达载体pT RIPZ中,并采用慢病毒介导的转基因体系建立了稳定表达si RNA的MCF-7/MX100细胞。在该细胞系中,si-BCRP2和si-BCRP3对BCRP的mR NA的抑制率分别达到72%和56%,对其蛋白的抑制率分别为70%和53%。在进一步的研究中,该细胞系被用于中药活性成分的筛选,以评价BCRP的底物和抑制剂。结果显示,BCRP低表达的MCF-7/MX100细胞可能作为良好的细胞模型被用于临床前研究。

Neuritin基因高表达系统构建及转染大鼠雪旺细胞的鉴定

目的构建neuritin基因的高表达系统,观察其转染雪旺细胞后neuritin的表达。方法根据大鼠neuritin mRNA序列体外合成编码序列(CDS区),构建到pGH载体,与酶切后的GV208-绿色荧光蛋白(GFP)慢病毒载体片段进行连接、转化、酶切及测序鉴定重组克隆。提取阳性克隆,转染入293T细胞,包装成慢病毒,以此感染大鼠雪旺细胞。将雪旺细胞分为三组:空白对照组(A组)、无意义干扰组(B组)、高表达组(C组)。实时荧光定量PCR和蛋白免疫印迹实验检测细胞neuritin的表达。结果大鼠neuritin正确插入慢病毒载体,C组neuritin mRNA水平显著高于A组、B组(P<0.01)。检测到neuritin蛋白与GFP的融合蛋白。结论成功构建neuritin慢病毒高表达系统;其转染的雪旺细胞neuritin表达升高。

羊布鲁氏杆菌OMP31的真核表达及其应用分析

为了获得可在细胞内表达布鲁氏杆菌外膜蛋白31(OMP31)基因的表达载体和慢病毒,试验从羊布鲁氏杆菌M5-90疫苗株PCR获得OMP31基因,连接至p Zero Back/blunt载体,经双酶切鉴定、测序鉴定正确的基因亚克隆到p HAGE-CMV-MCS-IZs Green表达载体上,双酶切鉴定,构建含正确OMP31基因的表达载体p HAGE-OMP31,与包装质粒ps PAX2和包膜质粒p MD2.G共转染293FT细胞进行慢病毒Lentivirus-OMP31包装;获得的Lentivirus-OMP31感染293FT细胞,利用蛋白质印迹(Western-blot)和免疫荧光(IFS)鉴定OMP31蛋白的表达及其免疫原性;LentivirusOMP31体外感染布鲁氏杆菌的宿主细胞模型单核细胞THP-1和人绒毛膜滋养层细胞JEG-3,Western-blot和IFS鉴定OMP31基因的表达,并利用流式细胞(FCM)检测细胞凋亡情况。结果表明:构建了能够在细胞内表达OMP31基因的真核表达载体p HAGE-OMP31和慢病毒LentivirusOMP31,二者感染细胞后表达的OMP31蛋白可与特异性抗体反应,具有良好的抗原性。经初步鉴定,OMP31蛋白在JEG-3细胞内表达能引起细胞凋亡。说明载体p HAGE-OMP31和慢病毒Lentivirus-OMP31可作为用于研究OMP31与布鲁氏杆菌感染相关性的试验材料。

SHIP基因诱导白血病细胞株K562凋亡及其机制

肌醇5'磷酸酶(src homology 2 domain-containing inositol-5-phosphatase,SHIP)是继PTEN之后发现的又一肌醇磷酸酶,对造血细胞增殖有关键负调控作用。目前国内外对SHIP基因与人类肿瘤抑制关系方面的研究报道较少。本研究利用携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体稳定感染K562细胞,应用实时荧光PCR、Western blot检测转染前后细胞内SHIP基因mRNA和蛋白水平的变化,MTT测定细胞增殖水平的变化,ELISA检测相关激酶活性,TUNEL、Hoechst33342检测细胞凋亡的变化,从而探讨SHIP基因诱导K562凋亡的机制,分析SHIP基因在白血病发病中的意义。结果如下:(1)K562细胞SHIP蛋白表达阴性;(2)携带野生型SHIP基因的慢病毒表达载体转染使K562细胞表达SHIP mRNA和蛋白;(3)与对照组相比,转染野生型SHIP基因导致K562细胞生长受抑,并出现明显的凋亡征象;(4)转染SHIP基因的K562细胞Akt磷酸化水平降低;NF-κB和bcl-xL表达降低;同时细胞促凋亡基因bad、p27表达和caspase-9、caspase-3活性明显增高。上述结果提示SHIP通过抑制PI3K/Akt路径中Akt的磷酸化,促进其下游bad、p27表达和caspase-9、caspase-3的活化,抑制bcl-xL,最终诱导白血病细胞凋亡;另外,NF-κB表达下调也是SHIP抑制白血病细胞增殖并促进细胞凋亡的重要作用机制。

稳定表达T7 RNA聚合酶的BHK-21细胞系的建立

为了建立能稳定表达T7RNA聚合酶的BHK-21细胞系,利用PCR方法从BL21(DE3)细菌中扩增T7RNA聚合酶基因,并克隆到慢病毒表达系统的pLVX-Puro转移载体上,然后与Lenti-X HTX包装载体共转染Lenti-X 293T细胞系,收获高效价的慢病毒。将慢病毒感染BHK-21细胞,用嘌呤霉素多次筛选后获得抗性细胞。用构建的pET-28a-IRES-EGFP检测质粒转染得到的抗性细胞,有荧光表达的细胞即可以稳定表达T7RNA聚合酶的细胞系。结果表明:构建的BHK-T7株细胞能稳定表达T7RNA聚合酶。

过表达TPL2蛋白BHK21细胞系的建立及其初步应用

利用慢病毒表达系统将TPL2(COT和MAP3K8)质粒稳定整合在乳仓鼠肾细胞(baby Hamster Syrian kidney)BHK21细胞基因组染色体上,建立稳定表达TPL2的BHK21/TPL2细胞系。构建TPL2质粒,通过基因合成将TPL2基因和慢病毒载体Lv-PCDH连接,得到重组慢病毒载体Lv-TPL2。通过嘌呤霉素筛选得到的阳性细胞株BHK21/TPL2即为稳定表达TPL2蛋白的BHK21细胞株。运用间接免疫荧光、激光扫描共聚焦显微技术、实时荧光定量PCR和普通PCR等技术分别验证TPL2基因组整合、转录、反应活性以及FMDV、SVV在BHK21/TPL2细胞株上的增殖效果。结果,TPL2基因被稳定整合在BHK21细胞基因组染色体上,建立的细胞系连续传代不丢失。接种病毒后致细胞病变严重,相对于正常的BHK21/PCDH细胞,整合有TPL2的BHK21细胞对FMDV、SVV的易感性显著增强。上述结果为FMDV疫苗的研制和生产提供了更佳的功能细胞系。

过表达TPL2蛋白PK-15细胞系的建立及其功能验证

通过基因合成的TPL2(tumor progression locus 2)质粒,获得稳定表达TPL2的PK-15/TPL2细胞系。将慢病毒载体Lv-PCDH和TPL2(Pig)重组慢病毒载体Lv-TPL2(Pig)利用转染试剂将其转染至PK-15细胞。感染48 h后,加入嘌呤霉素进行药物筛选,通过筛选得到的阳性细胞株PK-15/TPL2即为稳定表达TPL2蛋白的PK-15细胞株。通过qRT-PCR法和琼脂糖凝胶电泳、IFA,TCID50技术验证PK-15/TPL2细胞系和对口蹄疫病毒(foot-and-mouth disease virus,FMDV)和猪塞内加谷病毒(seneca valley virus,SVV)病原复制的影响。结果显示,细胞表达大量的TPL2的基因产物,用FMDV、SVV病毒感染稳定表达TPL2的PK-15细胞株时,明显抑制病毒的复制。结果表明,利用该技术可高效快速地建立了稳定高表达TPL2的PK-15细胞系,该细胞株的建立为病毒的分离及TPL2的生物学活性研究奠定理论基础。