人CDH22基因RNAi慢病毒载体的构建及稳定干扰CDH22基因的表达

目的构建人CDH22基因RNA干扰(RNAi)慢病毒载体,有效沉默大肠癌细胞的CDH22基因表达,为研究CDH22在大肠癌转移中参与的信号转导机制提供研究基础。方法利用在线软件设计人CDH22基因shRNA序列,合成、退火形成双链寡核酸后克隆到pENTRTM/U6载体的黏性末端,测序。得到的阳性重组子再与慢病毒载体进行重组,获得真核表达慢病毒干扰载体。在脂质体的介导下将慢病毒包装辅助质粒和CDH22基因重组慢病毒载体导入293FT细胞包装病毒,测定病毒滴度,感染大肠癌细胞SW480,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰CDH22基因的细胞亚系。结果成功构建CDH22真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒滴度为8×105U/ml。荧光定量PCR结果表明,所获得的细胞克隆11中CDH22 mRNA水平的表达显著降低。结论成功构建出CDH22基因慢病毒RNAi表达载体,并获得CDH22基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系,为研究CDH22在大肠癌转移中的作用机制提供了研究基础。

STUB1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建人STUB1基因RNA干扰(RNA interference,RNAi)慢病毒表达载体并进行鉴定。方法:针对筛选确定的人STUB1基因RNAi有效靶点序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经AgeI和EcoRI酶切后的pMagic 4.0载体连接,产生短发卡RNA慢病毒载体。PCR筛选阳性克隆,测序鉴定,并包装成慢病毒颗粒。结果:PCR鉴定与DNA测序证实,合成的含STUB1 shRNA慢病毒载体寡核苷酸链插入正确。STUB1 shRNA慢病毒载体在293T细胞中成功包装成慢病毒颗粒。结论:成功构建人STUB1基因RNAi慢病毒载体以及包装成功慢病毒颗粒,为研究STUB1在胶质瘤发生发展过程中相关信号通路的作用,提供了稳定感染细胞的载体。

慢病毒载体介导IκB激酶-α(IKKα)基因RNA干扰转基因小鼠的制备

IκB激酶-α(IKKα)的功能与淋巴形成和乳腺发育相关,在乳腺肿瘤中观察到IKKα蛋白的过量表达.应用小鼠受精卵卵周隙注射慢病毒载体的方式,建立IKKα基因RNAi转基因小鼠模型,为在体内研究IKKα基因的生物学功能及其与肿瘤发生的关系创造条件.实验构建了针对IKKα基因RNAi(剔降)的慢病毒载体,并将载体导入小鼠受精卵卵周隙,获得携带该载体的转基因小鼠模型,经PCR鉴定首建鼠阳性率为15%.转基因小鼠外周血细胞IKKαmRNA表达量明显降低.初步表型观察分析,IKKα基因RNAi小鼠发育正常,进一步的分析工作正在进行中.

慢病毒载体在RNA干扰中的应用进展

小分子RNA干扰技术是一种新兴的特异性地阻断某些基因表达的研究手段,在肿瘤、病毒感染,遗传病及其它疾病的治疗中均有广泛应用。慢病毒载体是一类来源于重组逆转录病毒的载体,由于具有可以感染非分裂期与分裂期细胞,容纳大的外源性目的基因片段,免疫反应小等特点,现已成为转移目的基因进入哺乳动物细胞的理想载体。将慢病毒载体应用于RNA干扰当中,可以特异性抑制哺乳动物的各类细胞中基因的表达,成为基因功能研究和基因治疗的有力手段。本文将试图对近期慢病毒载体在RNA干扰当中的应用的最新进展进行综述。

RNA干扰端粒酶反转录酶基因慢病毒表达载体的构建及鉴定

背景:端粒酶反转录酶(telomerase reverse transcriptase,TERT)对端粒酶活化起重要作用,但利用构建针对其基因的慢病毒抑制其在脊髓星形胶质细胞中的表达却少有报道。目的:构建用于RNA干扰的靶向大鼠脊髓源星形胶质细胞端粒酶反转录酶基因的慢病毒载体,并观察其对端粒酶反转录酶表达的抑制作用。方法:通过设计合成出shRNA-TERT序列,经聚合酶链反应扩增后定向连接到pLentilox3.7U6载体上构建重组质粒,经转染DH5α细胞筛选阳性菌落后行测序鉴定。将pLentilox3.7U6-TERT重组质粒转染293T细胞,包装产生重组慢病毒Le-TERT并测定其滴度,再用Le-TERT感染大鼠脊髓星形胶质细胞,实时定量-聚合酶链反应检测各细胞株TERT基因表达水平,并利用Western blot和免疫荧光分别检测TERT蛋白的表达。结果与结论:基因测序鉴定证明,pLentilox3.7U6-TERT重组质粒构建成功,并成功包装慢病毒。实时定量PCR、Western blot和免疫荧光检测结果表明,Le-TERT转染星形胶质细胞4 d后,对TERT mRNA的干扰效率可达(63.98±2.6)%,Le-TERT在转然后的星形胶质细胞中呈低表达。结果证实,实验构建的重组表达载体pLentilox3.7U6-TERT能够产生有效滴度的慢病毒,感染大鼠脊髓星形胶质细胞后,该载体可以有效抑制TERT的表达。

PRL-3基因RNA干扰慢病毒载体的构建及在SW480细胞中的表达

目的构建PRL-3基因慢病毒干扰载体及建立PRL-3基因稳定干扰的结直肠癌细胞亚系,为PRL-3基因功能研究奠定基础。方法设计PRL-3基因特异性RNAi靶序列,与pENTRTM/U6线性载体定向连接,构建pENTRTM/U6真核入门表达载体。通过与pENTRTM/U6 entry clone与pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST载体进行重组,获得pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体。利用包装细胞293FT获得重组的慢病毒,感染大肠癌细胞株SW480细胞,杀稻瘟菌素筛选获得稳定干扰PRL-3基因的细胞亚系。结果成功构建PRL-3pLenti6/BLOCK-iTTM-DEST真核表达慢病毒干扰载体并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为6×105U/L。RT-PCR、Western blotting结果表明,克隆1PRL-3 mRNA及蛋白显著降低。结论成功构建人PRL-3基因特异性的慢病毒干扰载体,获得PRL-3基因稳定干扰的大肠癌细胞亚系。

使用FLAG标签肽及慢病毒载体共同筛选小鼠foxp3基因RNA干扰的有效靶点

【目的】筛选高效的foxp3RNA干扰的靶点用于阻断CD4+CD25+Treg细胞的免疫抑制功能。【方法】使用oligoengine软件设计foxp3基因shRNA序列,化学合成法合成4条shRNA序列,构建含foxp3的靶序列的慢病毒载体;构建出表达FLAG融合蛋白和目的基因的工具细胞293T细胞用于筛选RNA干扰的有效靶点。【结果】成功包装了4条foxp3基因靶序列相应的慢病毒颗粒;成功构建了表达融合蛋白和目的基因的293T工具细胞;在工具细胞上筛选出了2条RNAi效率分别为91.3%和95.6%的有效靶点。【结论】使用FLAG融合蛋白和慢病毒载体能够筛选出Foxp3基因的RNAi最佳靶点。

Jagged1RNA干扰慢病毒载体抑制舌癌Cal-27细胞增殖、侵袭作用的研究

目的:观察Jagged1RNA干扰慢病毒载体抑制舌癌Cal-27细胞增殖、侵袭作用。方法:采用RT-PCR和Western Blot检测Jagged1siRNA对Cal-27细胞Jagged1基因和蛋白表达水平的敲减效果;克隆形成实验检测干扰后细胞群体依赖性和增殖能力;流式细胞仪检测细胞周期的变化;Tranwell检测RNA干扰后侵袭率变化。结果:KD组较NC组Jagged1基因和蛋白表达受到明显的敲减。KD组细胞克隆形成率明显降低,较NC组下降42.42%。S期细胞比率均明显下调,约62.98%,G1期细胞比率上调,凋亡率明显增高。72hKD细胞生长抑制率为32.50%。Jagged1RNAi慢病毒载体感染后,KD组侵袭率无下降。结论:下调Jagged1基因和蛋白的表达,可使舌癌细胞克隆形成率明显降低、增殖活性降低、S期细胞比率下降、凋亡率升高、成瘤能力下降。

慢病毒载体及其介导的RNA干扰在基因治疗中的应用研究

主要就慢病毒载体及其介导的RNA干扰技术在基因治疗中的应用研究进行了综述,并对其在该领域具有的广阔前景进行了展望.慢病毒载体作为一种新型的载体,可有效地将携带的目的基因导入宿主细胞,并将其整合到宿主细胞基因组中,从而使目的基因得以持久稳定地表达.该载体因具有高感染性、高表达效率及不易诱发宿主免疫反应等优点,已成为基因治疗研究中的一个重要工具.RNA干扰技术可以特异性抑制或关闭特定基因的表达,因此该技术可广泛应用在基因功能探究和恶性肿瘤治疗等领域.由慢病毒载体介导的RNA干扰技术能持久、稳定、特异性地抑制各类细胞中特定基因的表达,在病毒感染、肿瘤等疾病的基因治疗中被广泛应用,成为生物医学领域的新热点.

大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。

人高迁移率族蛋白组A1基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建和鉴定人高迁移率族蛋白组A1(HMGA1)基因RNA干扰慢病毒表达载体。方法:针对已经筛选确定的HMGA1基因RNA干扰有效靶序列,合成靶序列的Oligo DNA,退火形成双链DNA,与经HpaⅠ和XhoⅠ酶切后的pGCL-GFP载体(含U6启动子和绿色荧光蛋白)连接产生LV-sh HMGA1慢病毒载体,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。用LV-sh HMGA1慢病毒载体、pHelper 1.0和pHelper 2.0等3种质粒共转染包装293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度。结果:PCR和测序证实,成功构建LV-shHMGA1的慢病毒载体,病毒滴度达5×107TU/ml。结论:人HMGA1基因RNA干扰慢病毒载体的成功构建为进一步应用RNAi技术研究HMGA1基因的功能打下了基础。

ALKBH2基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的 ALKBH2基因高表达于尿路上皮肿瘤,RNA干扰(RNA interference,RNAi)技术难以稳定均一性的下调靶基因。文中旨在构建人源ABH2基因shRNA干扰慢病毒表达载体并进行鉴定。方法选取ABH2基因,分析该基因的编码区序列,进行单链oligo的设计及合成,利用PCR对合成的oligo进行拼接反应,将合成好的序列装入pcDNA3.1(+)载体并转化至感受态细胞DH5α,测序鉴定重组克隆中基因序列后构建表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2。根据不同的载体分为4组:siRNA-468组、siRNA-571组、siRNA-662组和对照组。根据靶基因序列设计并合成3对shRNA,构建入U6载体。将shRNA载体分别与表达载体共转染入HEK293细胞,通过QPCR检测筛选出最优干扰序列。将筛选到最有效的shRNA-571干扰序列构建入慢病毒载体pL/shRNA/F载体,用构建的慢病毒干扰载体和包装质粒共转染293T细胞,包装病毒,收集病毒原液,超速离心浓缩,并测定滴度。将LV-shRNA-571与过表达载体pcDNA3.1(+)/ABH2共转染肾癌细胞株ACHN,通过QPCR鉴定干扰效果。结果克隆测序验证无误,慢病毒载体构建成功。转染实验48 h后,收集293细胞分泌的病毒上清测定病毒的滴度为1.1×108TU/mL。对照组ABH2 mRNA相对表达量为0.785±0.082,siRNA-571组为0.078±0.006,RNAi后ABH2基因的mRNA表达水平(0.078±0.006)与对照组(0.785±0.082)相比显著降低(P<0.01),慢病毒PL/shRNA/F-ALKBH2-571对目的基因ABH2的干扰效率为92.2%。结论成功构建ABH2基因RNAi慢病毒载体并得到鉴定。

逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统的构建和鉴定

目的构建并鉴定表达MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统并检测其对于喉癌多药耐药细胞系(LSC-1/TAX)多药耐药表型的逆转效果。方法根据MDR-1基因序列,设计3条寡聚核苷酸序列,合成互补DNA链,插入慢病毒表达质粒pLVTHM中,与pCMV-dR8.74和pMD2G共转染293T细胞,包装产生病毒颗粒。以RT-PCR、realtimePCR及Westernblot方法检测三条siRNA在人喉癌耐药细胞系(LSC-1/TAX)中的干扰效率,并采用MTT方法检测干扰前后化疗药物的敏感性。结果通过酶切和测序证实慢病毒载体构建正确,产生能够表达GFP和siRNA的慢病毒颗粒,浓缩滴度为>1×108TU/ml。三条siRNA均可以感染LSC-1/TAX细胞系,其中第三条siRNA敲减效果最佳。结论成功建立逆转MDR-1小干扰RNA的慢病毒载体系统,为逆转喉癌多药耐药表型的实验奠定了基础。

大鼠PER2基因RNAi慢病毒载体的构建及干扰效率的测定

目的构建及筛选有效干扰大鼠血管平滑肌细胞PER2基因的shRNA慢病毒载体,并测定其干扰效率。方法设计大鼠PER2的siRNA靶序列,插入慢病毒载体质粒pGLV-U6-EGFP中,构建pLentivirus-per2-rat表达重组体并转染至A7r5大鼠胸主动脉血管平滑肌细胞内,利用Real-time PCR方法检测PER2基因的mRNA表达水平,筛选有效沉默钟基因PER2表达的RNAi慢病毒载体。结果经电泳、基因测序证实插入的目的序列正确,有PER2表达,成功构建了pLentivirus-per2-rat表达重组体;转染慢病毒载体pLentivirus-per2-rat至A7r5大鼠胸血管平滑肌细胞,测定转染效率达70%;Real-time PCR检测PER2基因的mRNA相对表达量,筛选出有效干扰大鼠血管平滑肌细胞钟基因Per2表达的siRNA片段,使PER2mRNA表达量下调约84%。结论成功构建了大鼠PER2的RNAi慢病毒载体,为进一步研究时钟基因的功能奠定了基础。

慢病毒载体及慢病毒介导的RNA干扰

慢病毒载体是高效的基因转导工具，能将外源基因序列稳定导入分裂期细胞和非分裂期细胞。将慢病毒载体与RNA干扰结合能在哺乳动物的各类细胞中特异性抑制同源基因的表达，它将是基因功能研究和基因治疗的有力手段。应用慢病毒载体进行转基因动物的制备，转基因的效率将得到显著提高。慢病毒介导的RNA干扰具有高效、稳定、特异性强的特点，它能在哺乳动物的各类细胞、多种疾病的离体细胞中实现稳定的RNA干扰。该技术被广泛用于基因功能的研究，在疾病的基因治疗上也具有良好的前景。

Caveolin-1 RNA干扰慢病毒载体的构建及其对肝癌细胞株SMMC7721侵袭的影响

目的构建人Caveolin-1RNA干扰慢病毒载体,探讨慢病毒介导的Caveolin-1RNA干扰对人肝癌细胞株SMMC7721侵袭能力的影响。方法应用pGCSIL-GFP-Caveolin-1RNA干扰慢病毒载体感染SMMC7721,检测其转导效率、mRNA和蛋白水平的敲除效率,并检测对SMMC7721侵袭能力的影响。结果pGCSIL-GFP-Caveolin-1RNA干扰慢病毒载体感染SMMC7721的转导效率为(96.0±1.2)%;Caveolin-1mRNA水平的敲除率约90%;Western blot显示感染后Caveolin-1蛋白水平显著下降;感染后SMMC7721的侵袭能力显著下降。结论慢病毒载体构建的Caveolin-1RNA干扰能有效敲除SMMC7721中Caveolin-1的表达,显著降低SMMC7721侵袭能力。

大鼠Nogo受体基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的:构建大鼠Nogo受体(Nogoreceptor,NgR)基因RNA干扰慢病毒表达载体,并观察其对293T细胞感染效率。方法:应用基因工程技术,首先构建携带目的基因siNgR199的慢病毒穿梭质粒表达载体,然后使用慢病毒包装质粒混合物和构建好的慢病毒穿梭质粒共转染293T细胞,转染48h后收集上清离心过滤后冰浴保存,最后进行病毒滴度测定,与标准病毒液分别感染293T细胞,按MOI值分为5个梯度:1、3、5、10、20,以确定病毒滴度及适合感染的MOI值。其中采用PCR方法对重组载体进行鉴定,利用绿色荧光蛋白作为报告基因,对病毒滴度和感染效率进行检测。结果:酶切鉴定及PCR结果与病毒载体的预期结果一致,病毒滴度达1×108ifu/m1,适合感染的MOI值为3。结论:应用基因工程技术,成功构建了大鼠siNgR199慢病毒表达载体,为应用于治疗脊髓损伤后轴突再生创造了条件。

绵羊抑制素shRNA慢病毒干扰载体的构建与鉴定

构建并鉴定了针对绵羊抑制素α亚基(INHA)基因的shRNA(Small hairpin RNA,shRNA)慢病毒干扰载体,为进一步制备优质、高产转基因绵羊奠定基础。设计并合成4条针对绵羊INHA基因的shRNA表达序列(shRNA1、shRNA2、shRNA3、shRNA4)及2条阴性对照序列(NC1、NC2),将其分别连接到空载体pGFP-V-RS中,得到4个shRNA表达载体(即shRNA干扰载体)pGFP-V-RS-shRNA和2个阴性对照载体pGFP-V-RS-NC;同时构建绵羊INHA的高效表达载体pIRES2-eGFP-INHA,然后将构建好的4个shRNA干扰载体及2个阴性对照载体分别与INHA高效表达载体瞬时共转染293T细胞,qPCR法进行干扰效果筛选,挑选干扰效果最佳的shRNA干扰载体构建成慢病毒干扰载体。qPCR检测结果表明,shRNA干扰载体pGFP-V-RS-shRNA3的干扰效果最好,用它构建的慢病毒干扰载体经测序验证表明其已建成功。绵羊INHA shRNA慢病毒干扰载体构建成功,为进一步制备优质高繁转基因绵羊奠定了基础。

慢病毒载体及其在RNA干扰技术中的应用与发展

慢病毒载体是一类逆转录病毒载体,以其转染效率高,可感染分裂期和非分裂期细胞,可容纳较大的基因片段等优点,现已被作为转移目的基因的理想载体。而RNA干扰技术是近年来迅速发展起来可以特异性地剔除特定基因或者抑制特定基因表达的一种新技术,在病毒感染、心血管疾病、肿瘤等疾病的治疗中被广泛应用。通过慢病毒载体与RNA干扰技术的结合应用,有望为特定基因的功能以及相关疾病的治疗研究提供新的手段和方法。

兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体构建与RNA干扰效率的鉴定

背景:膜联蛋白A1参与细胞凋亡的调控。目的:针对兔膜联蛋白A1基因构建短发夹RNA慢病毒载体,并检测其对成骨细胞的沉默效率。方法:针对兔膜联蛋白A1基因设计RNA干扰靶序列,合成Oligo DNA,退火形成双链DNA,与BamHI和EcoRI双酶切后的pGLV/H1/GFP载体连接成pGLV-shANXA1,PCR筛选阳性克隆,测序鉴定。pGLV-shANXA1和pGLV/helper-1、pGLV/helper-2、pGLV/helper-3共转染293FT细胞包装产生慢病毒颗粒LV-shANXA1,并测定其滴度,随后将LV-shANXA1感染兔成骨细胞。结果与结论:经PCR和测序证实构建片段大小及DNA序列与目标序列一致,shANXA1片段完全正确插入慢病毒载体pGLV/H1/GFP中。包装浓缩慢病毒颗粒LV-shANXA1的滴度为3.8×108TU/L。经嘌呤霉素筛选后,感染复数为50时,LV-shANXA1对成骨细胞感染效率为80%;感染复数为100时,感染效率为95%。Real-time PCR和Western blot检测显示,LV-shANXA1-901对膜联蛋白A1基因的沉默效率最高,在感染复数为50时,沉默效率可达71.2%。表明实验成功构建的兔膜联蛋白A1基因短发夹RNA慢病毒载体能够在细胞水平有效沉默靶基因。