稳定表达Notch1胞内结构域肺腺癌细胞株的构建及鉴定

目的构建Notch1胞内结构域(N1ICD)稳定表达的肺腺癌A549细胞株。方法采用PCR方法扩增N1ICD基因,构建慢病毒重组质粒p HBLV-N1ICD-Zs Green-Puro(LV-N1ICD),采用PCR和基因测序鉴定重组质粒。高纯度无内毒素抽提慢病毒重组质粒和辅助包装原件载体质粒,使用慢病毒空载质粒(LV-Zs Green-Puro)和LVN1ICD共转染293T细胞包装慢病毒,利用药物筛选法测定病毒滴度。将A549细胞分成A549-N1ICD组和A549-Zs Green-Puro组,分别加入LV-N1ICD和LV-Zs Green-Puro,取制备好的慢病毒感染A549细胞,加入嘌呤霉素筛选稳定转染细胞株,荧光显微镜观察转染效率,以带有绿色荧光的细胞初步视为稳定转染的细胞株。以A549细胞为对照组,进一步采用q PCR和Western blot方法分别检测N1ICD mRNA及蛋白表达。结果 PCR及基因测序结果表明pHBLV-N1ICD-Zs Green-Puro重组质粒构建成功。LV-N1ICD组病毒滴度为1×10~8TU/m L,LV-Zs Green-Puro组病毒滴度为1×108TU/m L。经嘌呤霉素筛选后,荧光显微镜下观察细胞形态无明显变化,A549-Zs Green-Puro组和A549-N1ICD组70%~80%的细胞带有绿色荧光。对照组、A549-Zs Green-Puro组、A549-N1ICD组的N1ICD mRNA相对表达量分别为1.59±0.11、1.09±0.10、70.81±6.39,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。三组N1ICD蛋白相对表达量分别为1.99±0.13、1.73±0.08、6.58±0.43,A549-N1ICD组高于其他两组(P均<0.01)。结论成功构建了稳定表达N1ICD的肺腺癌A549细胞株。

CD1d基因稳定转染Panc-1细胞系的建立

实验采用PCR法获得CD1d基因片段,将其插入慢病毒pReceiver-Lv201载体(带GFP荧光)中获得EX-S0249-LV201重组质粒,经转染试剂EndoFectin-Lenti转染到293T细胞中获得慢病毒LP-S0249-LV201,用包装获得的慢病毒感染胰腺癌Panc-1细胞,在不同时间段用倒置荧光显微镜观察绿色荧光,并用反转录酶聚合酶链反应(RT-PCR)和Western blot方法验证获得的表达细胞株.实验结果显示经RT-PCR和Western blotting检测证实慢病毒LP-S0249-LV201转染至Panc-1细胞株后,该细胞株表达CD1d基因和蛋白,成功建立了稳定表达CD1d基因的Panc-1细胞系,为进一步研究CD1d基因在胰腺癌免疫基因治疗中的作用奠定基础.

构建稳定表达RFP及嘌呤霉素抗性的K562细胞株

目的构建稳定表达红色荧光蛋白（red fluorescent protein，RFP）和嘌呤霉素（puromycin）抗性的K562．PM．RFP细胞株，便于慢性粒细胞性白血病研究中K562细胞的观察和筛选。方法采用PCR法获得RFP片段，将其插入到慢病毒pGC-FU-3FLAG-IRES—Puromycin载体中获得pGC—PM—RFP重组质粒，经脂质体转染到293T细胞中获得慢病毒LV—PM—RFP，有限稀释法检测慢病毒在293T细胞中的转染效率，用包装获得的慢病毒感染K562细胞，经嘌呤霉素筛选获得RFP阳性的K562-PM—RFP细胞株。结果PCR及测序结果证实目的基因RFP正确克隆至慢病毒质粒中，经慢病毒LV—PM-RFP感染的K562细胞能在嘌呤霉素抗性培养基中存活，并稳定表达RFP。结论成功构建了慢病毒重组质粒pGC—PM-RFP，并获得了携带RFP及嘌呤霉素抗性基因的K562-PM—RFP细胞株。

肿瘤坏死因子-α可诱导GSTM5核转位

目的构建稳定表达谷胱甘肽S转移酶mu5(GSTM5)的人支气管上皮16HBE细胞株,探讨诱导GSTM5核转位的关键因素。方法构建表达GSTM5基因的重组慢病毒载体(PLVX-puro-GSTM5-SBP-3*flag-N、PLVX-puro-3*flag-SBP-GSTM5-C)并制备出相应的慢病毒,感染人支气管上皮16HBE细胞后,经嘌呤霉素筛选获得细胞克隆;实时荧光定量PCR和蛋白印迹法(Western blot)分别检测细胞株中GSTM5的mRNA、蛋白表达水平;以肿瘤坏死因子-α(TNF-α;10ng/ml)刺激稳定转染细胞株(稳转株)0.5h,共聚焦荧光显微镜检测GSTM5核转位。结果成功构建稳定表达GSTM5人支气管上皮细胞株(16HBE-GSTM5-SBP-3*flag-N、16HBE-3*flagSBP-GSTM5-C);荧光共聚焦显微镜显示稳转株在TNF-α刺激诱导后,GSTM5由胞浆转入胞核,以16HBEGSTM5-SBP-3*flag-N稳转株更显著。结论 TNF-α刺激可诱导GSTM5人支气管上皮细胞株中GSTM5发生核转位,可能与其N端含有非经典核定位信号密切相关。