用数据模拟方法分析探空仪慢转对高空气象探测记录结果的影响

本文提出了一种用数据模拟的方法,分析因探空仪慢转对高空气象探测记录造成影响的情况,并结合了一次实际探空记录进行了分析论证,得出在实践中用五九型探空仪,在其转速下低于3转/分时的情况下,所探测到的高空压、温、湿资料与转速保持在5～8转/分的情况下的资料,吻合程度较高。而转速保持在记录整理与否的临界点:2转/分时～500hPa以上<2转/分,此时各要素的偏离程度已明显加大,对大气层结特征的反映,已失去指示性。

圆光栅编码器慢转失灵的原因分析与解决

本文介绍了在研制人卫经纬仪时遇到的一大难题及解决的办法

φ3×9m球磨机中心传动减速器(2×1250Ⅲ)慢转装置的改造

我司(福建水泥股份有限公司)于一九八九年10月投 入一台φ3×9m球磨机,经过两年多的运行,运转良好,年 利用率92％运转率高达98％,主减速器2×1250Ⅲ运转平 稳,各项技术指标均达到技术标准,齿面接触良好,无发现 点蚀,斑点,与其他使用厂家相比,该台设备是运转最好的 一台,但在辅助传动装置存在不足,主要是蜗轮磨损严重, 运转功率不足,经常超载跳停,经分析,蜗轮设计有误,为确 保运转,需对辅助传动进行改造。

GPx6过表达慢病毒载体和稳定转染细胞系的构建

为了建立稳定表达谷胱甘肽过氧化物酶6(Glutathione peroxidase 6,GPx6)的真核表达细胞系,对GPx6进行基因克隆,构建慢病毒表达载体,建立表达猪源GPx6的CHO-K1细胞系.根据NCBI数据库中的猪GPx6基因的c DNA序列,利用Primer5设计PCR扩增引物.在猪附睾组织中克隆出6His-GPx6基因,构建含有6His-GPx6的慢病毒过表达载体,利用三质粒包装系统进行慢病毒包装,慢病毒侵染CHO-K1细胞,进一步筛选获得阳性单克隆细胞系,通过免疫荧光、蛋白印迹和实时荧光定量确定目的基因表达效果.试验成功克隆出6His-GPx6基因,构建了含有6His标签的GPx6过表达慢病毒载体,并成功获得了含有GPx6的CHO-K1细胞系.为下一步研究GPx6在猪繁殖力的提高和精液稀释液添加剂的应用提供新思路.

小型铣刨机铣刨鼓慢转控制研究

铣刨鼓慢转控制方法以较低的制造费用实现了小型铣刨机铣刨鼓的正向慢转功能、反向慢转功能、两个后立柱同步升降功能和发动机熄火功能。采用该控制方法的铣刨机,可让铣刨鼓上刀头自动准确地缓慢旋转到位,方便操作手完成铣刀的更换,提高换刀的工作效率,降低劳动强度,并且可省去换刀阀的应用,降低成本。同时,采用该控制方法的铣刨机,站立在地面即可完成两个后立柱的同步升降和发动机的熄火等功能,使得铣刨机的功能性更加强大。

表达猴痘病毒表面蛋白A35R和E8L稳转细胞株的构建与应用

【目的】构建稳定表达猴痘病毒(Mpox virus,MPXV)表面蛋白A35R和E8L的稳转细胞株,用于定性或定量分析相应猴痘表面蛋白的抗体或互作分子与细胞表面A35R或E8L结合活性。【方法】运用基因重组技术,构建表达A35R或E8L的慢病毒表达载体,以HEK-293T作为宿主细胞,通过慢病毒转染技术形成稳定表达并定位在细胞表面A35R或E8L的稳转细胞株。采用Western Blot及细胞免疫荧光检测工程化细胞株中A35R或E8L的表达及蛋白定位情况,并运用流式细胞术验证稳转细胞与抗血清中多克隆抗体的结合能力。分别从表达A35R或E8L的稳转细胞中筛选出单克隆细胞株,并以单克隆稳转细胞作为工具定量分析商业化抗猴痘A35R或E8L单克隆抗体与细胞表面A35R或E8L的结合活性。【结果】成功构建稳定表达A35R或E8L并定位至细胞膜上的HEK-293T稳转细胞,经过单克隆化筛选,建立4株单克隆细胞株,其中2株稳定表达A35R(A35-2C10和A35-4E3)和2株稳定表达E8L(E8-6和E8-8)。筛选出的单克隆细胞在定量分析抗猴痘A35R或E8L的单克隆抗体结合活性方面显示出良好的拟合度。【结论】通过慢病毒转染技术构建的表达猴痘表面A35R或E8L的稳转细胞株可以作为通用研究工具,应用于抗A35与E8L中和抗体、核酸适配体或互作分子等相关分子与相应抗原结合活性的定性或定量分析。

不同冻存液冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的效果比较

目的筛选冻存慢病毒转染后稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液。方法采用甘油和二甲基亚砜(DMSO)2种不同冻存保护剂,以4种不同比例的冻存液分别冻存慢病毒转染后肝癌细胞HepG2及未转染的HepG2细胞,并对上述细胞复苏后的存活率及增殖能力进行比较分析。结果采用甘油为冻存保护剂时,冻存液[DMEM∶胎牛血清(FBS)∶甘油]比例为0∶9∶1的转染后细胞存活率最高(P=0.001);未转染细胞存活率与冻存液比例无关(P=0.293)。采用DMSO为冻存保护剂时,转染后细胞存活率为0%;未转染细胞存活率在60%及以上,且与冻存液比例无关(P=0.487)。冻存液中血清含量越高,复苏后细胞的增殖能力越强(P<0.05)。结论冻存慢病毒转染后的稳转肝癌细胞株HepG2的最佳冻存液为90%FBS+10%甘油。

大鼠骨髓间充质干细胞体外培养与慢病毒转染方法的建立

本研究建立大鼠骨髓间充质干细胞(BMMSC)体外分离培养、表型鉴定和标记的方法,为临床进行细胞移植治疗提供合格的细胞。无菌条件下取大鼠股骨、胫骨,用冲洗法冲出骨髓,贴壁培养法分离纯化BMMSC,体外扩增;流式细胞术进行免疫表型鉴定,并进行成骨,成脂分化鉴定;利用携带绿色荧光蛋白(GFP)基因的慢病毒液转染大鼠BMMSC。结果表明,贴壁培养法能有效分离纯化大鼠BMMSC,细胞呈均一的成纤维细胞样;流式细胞术显示,第4代BMMSC中CD29、CD44表达阳性,CD34、CD45表达阴性。在相应的诱导培养条件下,BMMSC均能成骨及成脂分化。BMMSC用慢病毒液转染后表达GFP。结论:贴壁培养法简单、可行和稳定;分离培养的细胞具有BMMSC的生物学特性和多向分化潜能;BMMSC经慢病毒液转染后表达GFP,标记效率高,可作为标记细胞的一种有效手段,适合体内示踪。

重组慢病毒介导STAT3过表达质粒转染促进显性脊柱裂胎鼠骨髓间充质干细胞向神经细胞分化

目的:观察重组慢病毒介导STAT3过表达质粒转染骨髓间充质干细胞(BMSCs)移植后,对显性脊柱裂胎鼠脊髓组织神经细胞转分化的影响。方法:给予维甲酸致畸建立显性脊柱裂胎鼠模型,利用显微外科注射技术对胎鼠进行干细胞移植治疗。分为空白对照组(12例),阴性对照组(10例)和实验组(11例),采用CCK-8,RT-PCR和Western-blot检测手段,测定干细胞增殖活性的OD值及每组STAT3,pSTAT3,神经标记物(GFAP,NSE,NF和Nestin)和凋亡相关因子(Caspase-8和Bcl-2)的表达情况。结果:在干细胞移植后通过CCK-8检测实验组在第8小时OD值达到峰值,之后逐渐下降,与空白对照组和阴性对照组相比有统计学差异(P<0.05),而空白对照组和阴性对照组检测后的OD值高峰时间和峰值未见统计学差异。经过基因和蛋白双验证,实验组pSTAT3,GFAP,NSE,NF和Nestin表达水平显著高于空白对照组和阴性对照组(P<0.05),而STAT3 mRNA在实验组中的表达水平显著降低(P<0.05)。实验组中Caspase-8和Bcl-2在基因和蛋白两个层面的表达水平均明显低于空白对照组和阴性对照组(P<0.05)。结论:构建STAT3过表达质粒通过慢病毒介导的方法转染骨髓间充质干细胞,可以提高其向神经细胞转化的效率,为显性脊柱裂的治疗提供新的种子细胞。

慢病毒转染和电转染原代C57BL/6小鼠神经干细胞的比较

目的比较慢病毒与电转染两种技术转染小鼠原代神经干细胞的优劣,获得神经干细胞高效转染的方法。方法从C57BL/6小鼠脑组织中提取神经干细胞,进行原代培养;分别进行慢病毒转染和电转染,通过观察绿色荧光蛋白在细胞中的表达,比较两种转染方法的转染效果,并用噻唑蓝(MTT)法计算相对存活率,比较两种方法转染后对细胞的影响。结果慢病毒与电转染两种转染技术转染神经干细胞48 h后,慢病毒的转染率为(77.6±6.6)%,高于电转染法转染率([29.2±4.8)%],两者比较,差异有统计学意义(P<0.05);转染72 h后,慢病毒转染的细胞荧光表达量为(60.0±3.6)%,电转染细胞的荧光表达量仅剩(12.8±2.4)%;MTT法结果显示,电转染组细胞相对存活率为(75.8±2.3)%,慢病毒转染组细胞相对存活率为(70.1±1.4)%,两者比较,差异无统计学意义(P>0.05)。结论对于原代神经干细胞转染,慢病毒转染法比电转染法具有更高的转染效率及长久稳定性,转染后细胞存活率与电转染法接近,因此慢病毒转染法更能满足研究者的需求。

小鼠脂肪源间充质干细胞的培养鉴定及增强绿色荧光蛋白-慢病毒载体转染

目的探索脂肪源间充质干细胞（ADMSCs）的分离培养方法、生长特性及筛选出慢病毒载体感染间充质干细胞的最佳感染指数（MOI），并鉴定其感染后的增殖能力，为ADMSCs移植治疗急性肾小管损伤提供实验依据。方法取4周龄昆明小鼠腹股沟脂肪组织，差速贴壁法培养分离昆明小鼠脂肪源间充质干细胞。经细胞培养液洗涤、离心后接种于细胞培养瓶，放置体积分数5％CO2孵箱中培养，24h后换液，以后每3d更换培养基，待细胞融合达到约90％时，传代培养。取第3代ADMSCs用流式细胞术（FCM）检测其表型、茜素红染色及油红O染色鉴定其多向分化潜能；用携带增强绿色荧光蛋白（EGFP）的慢病毒载体（LV）感染ADMSCs，FCM检测病毒感染效率，四甲基偶氮唑蓝（MTY）比色法检测感染后的细胞活力。结果（1）差速贴壁法培养分离7-11d时细胞融合达80％以上。原代细胞融合达80％～90％进行1：4传代，细胞贴壁和生长速度快于原代细胞培养。第3代及再传代细胞形体趋于一致，细胞呈梭形。细胞连续传代10次，生长速度未见明显减缓；（2）FCM检测第3代细胞CD29阳性表达98．93％，CD34阳性表达0．17％；（3）第3代细胞成脂诱导14d油红O染色阳性，成骨诱导14d茜红染色阳性；（4）当MOI=25感染第3代细胞72h后，共聚焦荧光显微镜观察细胞EGFP阳性表达60％～70％，细胞活力不受影响；（5）MrIT法显示重组慢病毒转染细胞与未转染慢病毒细胞比较，细胞增殖能力无差异。结论从昆明小鼠腹股沟脂肪组织中分离的ADMSCs可在体外稳定传代；差速贴壁法可以简便、高效地提取ADMSCs；携带EGFP的LV可有效感染ADMSCs，并且感染后其增殖能力不受影响。

慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞向神经细胞转化的研究

目的:探究慢病毒介导shRNA LINGO-1质粒转染促进骨髓间充质干细胞(BMSCs)向神经细胞转化的研究。方法:利用shRNA基因干扰技术,构建shRNA LINGO-1干扰载体,慢病毒转染BMSCs,根据病毒转染情况分成空白对照组(未转染慢病毒的BMSCs)、空载体病毒组(转染不含shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)、干扰载体病毒组(转染shRNA LINGO-1干扰载体慢病毒的BMSCs)。利用流式细胞仪检测BMSCs的表面蛋白,利用RT-PCR和Western-Blot检测胶质纤维酸性蛋白(GFAP)、神经元特异性烯醇化酶(NSE)、神经丝蛋白(NF)、巢蛋白的表达。结果:CD44和CD29在第2代BMSCs的表达为60.2%和58.3%;CD34和CD45在第2代BMSCs的表达为3.4%和2.6%。慢病毒转染效率为90%以上。空白对照组、空载体病毒组和干扰载体病毒组的GFAP、NSE、NF和巢蛋白m RNA的相对表达量比较差异有统计学意义(P<0.05),其中空载体病毒组和空白对照组的比较差异无统计学意义(P>0.05),干扰载体病毒组和空载体病毒组的差异有统计学意义(P<0.05)。Western-blot检测蛋白表达量也具有同样的表达特点。结论:慢病毒介导shRNA LINGO-1干扰载体转染促进BMSCs可提高BMSCs向神经细胞转化的效率。

慢病毒下调酪蛋白激酶2相互作用蛋白1表达的骨髓间充质干细胞修复骨质疏松大鼠牙槽骨缺损

背景:在口腔牙槽骨修复治疗过程中,患者的全身状况尤其是骨质疏松症等系统性疾病往往会影响治疗效果,近来发现酪蛋白激酶2相互作用蛋白1(casein kinase 2-interacting protein-1,CKIP-1)具有负调控成骨的作用,因此有希望作为新的靶点用于治疗骨质疏松。目的:探究CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损的修复作用。方法:(1)从1周龄SD乳鼠股骨及胫骨骨髓中分离培养出骨髓间充质干细胞,慢病毒转染降低骨髓间充质干细胞中的CKIP-1水平;(2)通过维甲酸[70 mg/(kg·d)]灌胃21 d的方式建立骨质疏松SD大鼠模型,将CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体、空载体转染的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体、明胶海绵分别植入骨质疏松大鼠模型牙槽骨缺损内,正常组将明胶海绵植入正常大鼠牙槽骨缺损内。术后正常喂养30 d后,取上颌牙槽骨进行苏木精-伊红染色并通过Lane-Sandhu组织学评分和新生骨百分比评估骨缺损愈合情况,通过q RTPCR技术和免疫组化染色检测各组术区牙槽骨中CKIP-1、碱性磷酸酶、骨钙素的m RNA相对表达量及阳性表达情况。结果与结论:(1)与空载体转染相比,CKIP-1下调后的骨髓间充质干细胞中CKIP-1的m RNA相对表达量减少(P <0.05);(2)与植入空载体转染的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体组、明胶海绵组相比,植入CKIP-1表达下调的骨髓间充质干细胞与明胶海绵复合体组Lane-Sandhu组织学评分和新生骨百分比显著升高(P <0.05),与正常组相近;碱性磷酸酶、骨钙素表达显著升高(P <0.05);(3)结果说明,局部移植CKIP-1下调的骨髓间充质干细胞对骨质疏松大鼠牙槽骨缺损具有明显的修复作用。

慢萎转复汤治疗胃癌前期病变62例临床观察

用具有益气养胃、活血散结作用的慢萎转夏汤随症加减治疗慢性萎缩性胃炎伴中、重度肠上皮化生和不典型增生６２例，结果临床症状和胃镜、病理都获得了不同程度的改善，其中胃镜、病理显效２７例，有效２１例，无效１４例，总有效率为７７．４％。临床症状总有效率为９１．９％。

HLA-G慢病毒转染抑制NK细胞毒功能的实验研究

目的建立-株稳定表达人类白细胞抗原G（human leucocyte antigenG，HLA—G）的子宫内膜癌细胞系，探讨HLA—G对NK92细胞的杀伤活性影响。方法将HLA—G慢病毒包装并转染于HEC-1-B细胞系，稳定转染HLA—G基因的I-IEC-1-B与NK92细胞系共培养，并使用乳酸脱氢酶（1actate dehydrognase，LDH）释放法检测HLA—G表达对自然杀伤（naturalkiller，NK）92细胞杀伤活性的影响。结果外源基因HLA—G成功介导转染在人子宫内膜癌HEC-1-B细胞系，通过免疫荧光可见HLA—G表达率为95％，乳酸脱氢酶（LDH）释放法检测HLA—G基因表达能够有效抑制NK92细胞的杀伤活性，与对照组相比有统计学意义（P〈0．05）。结论HLA—G是-个重要的免疫抑制分子，稳定表达HLA—G的子宫内膜癌细胞可明显抑制NK92细胞的杀伤活性，可能诱导移植免疫耐受的发生。

FOXO4过表达慢病毒载体构建及顺铂耐药稳定细胞株的建立

目的构建稳定过表达叉头框基因O4(FOXO4)的顺铂耐药细胞株MDA-MB-231/DDP,探讨FOXO4在三阴性乳腺癌(TNBC)细胞顺铂耐药中的作用,为改善TNBC顺铂耐药提供理论基础。方法通过药物剂量递增法诱导乳腺癌细胞MDA-MB-231获得顺铂耐药性,CCK-8法确定细胞的耐药指数。将目的基因FOXO4定向插入载体质粒GV492中构建重组慢病毒表达载体LV-FOXO4-OERNA。通过预实验选取助感液类型、确定感染的最佳转染复数值(MOI)以及嘌呤霉素筛选的最佳浓度。将重组慢病毒表达载体感染MDA-MB-231/DDP细胞,嘌呤霉素最佳浓度筛选FOXO4过表达细胞株(FOXO4-OERNA组)。qRT-PCR和Western blotting检测目的基因表达情况,测定不同组IC 50确定细胞对顺铂敏感性。结果成功建立乳腺癌顺铂耐药细胞株(耐药指数=5.231)。与亲本细胞株相比,MDA-MB-231/DDP耐药细胞株FOXO4 mRNA表达水平显著降低(P<0.05)。通过基因测序证明,序列与预计序列一致,重组慢病毒表达载体构建成功,通过嘌呤霉素成功筛选出FOXO4稳定表达株。通过过表达FOXO4可以降低MDA-MB-231细胞对顺铂的耐药性,FOXO4-OERNA组耐药指数(RI=3.063),逆转指数达到1.708。结论通过药物剂量递增法可建立MDA-MB-231顺铂耐药细胞株,过表达FOXO4可逆转MDA-MB-231/DDP细胞对顺铂的耐药性。

慢病毒载体介导的脂肪干细胞miR-1重组表达系统的构建

目的构建miR-1稳定过表达并且适于体内示踪的基因修饰大鼠脂肪干细胞(rASCs)模型.方法首先对体外培养的rASCs进行表型鉴定及成骨、成脂诱导分化;然后观察重组慢病毒转染rASCs过程中不同感染复数(MOI)及有无添加聚凝胺(polybrene)对报告基因萤火虫荧光素酶(FLuc)表达和活性的影响;最后采用qRT-PCR检测miR-1-3p和miR-1-5p的表达水平.结果通过观察FLuc介导酶促反应引起的生物发光筛选出最佳转染条件为MOI 60,且添加聚凝胺能增强慢病毒转染rASCs的效率;随后应用该条件转染rASCs构建miR-1稳定过表达模型,qRT-PCR结果显示miR-1-3p和miR-1-5p的表达水平分别升高了65.6倍和37.4倍(P<0.05),证实该模型构建成功.结论慢病毒载体能成功介导外源基因在rASCs中稳定过表达,并且报告基因FLuc催化底物产生的生物发光有利于进一步的体内示踪研究.总言之,本研究为基因修饰细胞模型的构建提供了方法学基础,并为心肌组织再生修复提供新的工程细胞株.

miR-126靶向调控IRS1,SLC7A5及TOM1基因抑制结肠癌的增殖及侵袭转移

目的:通过研究miR-126在人结肠癌细胞中的表达及其对结肠癌细胞生物学行为的影响,了解miR-126在结肠癌发生发展中的作用。方法:利用原位杂交在高密度人结肠癌组织芯片中研究miR-126的表达,通过慢病毒转染构建miR-126稳定过表达细胞系,并进一步通过体外实验研究miR-126对结肠癌细胞生物学行为的影响。结果:miR-126在人结肠癌组织中表达下调,在存在侵袭转移患者的结肠癌组织中下调尤为明显。miR-126的表达与患者是否发生转移及结肠癌临床分期、Duke’s分期相关(P<0.05),且miR-126下调越明显,患者预后越差(P=0.025)。利用慢病毒转染构建的miR-126过表达SW480细胞系进行体外实验显示结肠癌细胞中恢复miR-126的表达可抑制结肠癌细胞增殖,使其出现G1期阻滞并促进结肠癌细胞凋亡、抑制结肠癌细胞迁移和侵袭能力。同时miR-126可明显增强结肠癌细胞对化疗药物奥沙利铂的敏感性。进一步生物信息学分析及qRT-PCR结合蛋白免疫印迹法验证IRS1,SLC7A5及TOM1可能为miR-126在结肠癌中的靶基因。结论:miR-126可明显抑制结肠癌的发生发展,且与结肠癌患者预后密切相关,其可能调控的靶基因为IRS1,SLC7A5及TOM1,miR-126有望成为结肠癌临床诊断及治疗的新靶点。

不同方式转染小鼠B淋巴瘤细胞A20的探讨

目的:探讨小鼠B淋巴瘤细胞A20最佳的转染方式,为后期研究LMP1基因在A20细胞中的表达及作用奠定基础。方法:分别使用脂质体转染法、NucleofectorTM核酸转染法和慢病毒载体介导转染法将带有报告基因绿色荧光蛋白的重组质粒pCDF-LMP1转染小鼠B淋巴瘤细胞A20,荧光显微镜观察细胞内绿色荧光的分布,比较分析这三种转染方式对A20细胞的转染效率。结果:脂质体转染效率最低,仅见个别细胞有绿色荧光,NucleofectorTM核酸转染效率约为10%,浓缩后的慢病毒载体介导转染法效率最高,可达80%以上。结论:对于悬浮细胞A20而言,浓缩后的慢病毒载体介导的转染法是最佳的转染方式,该方法在将外源基因转染至悬浮细胞方面值得推广,也为极难转染的细胞做稳定转染提供参考价值。