鸡胚19期原始生殖细胞慢速冷冻和玻璃化冷冻保存的研究

本研究对发育至第19期的鸡胚性腺原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs)分离提纯后,在DMEM中添加冷冻保护剂DMSO(二甲基亚砜)、EG(乙二醇)、蔗糖、PVP(聚乙烯吡咯烷酮)分别组成6种慢速冷冻保护液和6种玻璃化冷冻保护液,进行超低温冷冻保存。复苏后苔盼蓝染色测定细胞存活率,体外接种培养、传代。结果:①慢速冷冻保存中,PGCs在慢速冷冻液V(10%EG+10%FBS+0.1mol/L蔗糖)条件下复苏后存活率最高(92.20%),且与慢速冷冻液I(10%DMSO+10%FBS)存活率之间差异显著(P<0.05)。②玻璃化冷冻保存中,PGCs在玻璃化冷冻液I(10%DMSO+10%EG+20%FBS+10%PVP)条件下复苏后存活率最高(84.15%),且与其余5种玻璃化冷冻液下复苏后存活率之间差异均极显著(P<0.01)。③培养传至第3代的慢速冷冻复苏后PGCs细胞和培养传至第2代的玻璃化冷冻复苏后PGCs细胞,PAS染色、AKP染色呈阳性并保持完整的二倍体核型。

分裂期胚胎慢速冷冻保存时长对复苏后临床结局的影响

目的探讨分裂期胚胎慢速冷冻保存时间长短对复苏后胚胎质量与临床结局的影响。方法回顾性研究2010年1月～2011年12月在南京市鼓楼医院生殖医学中心进行分裂期胚胎慢速冷冻后复苏周期共441例，根据复苏前胚胎冷冻保存时间分为〈6个月、6—11个月、12—17个月、18～23个月、≥24个月共5组，分析不同冷冻保存时间下胚胎存活状态与临床妊娠及分娩结局。结果〈6月、6～11月、12—17月、18—23月、≥24月5组胚胎复苏后存活率分别为85．34％、80．22％、78．54％、75．23％和81．25％，胚胎完整率分别为46．83％、41．10％、33．20％、32．11％和40．97％，胚胎种植率分别为39．46％、26．37％、29．20％、23．73％和28．40％，临床妊娠率分别为56．95％、38．03％、45．07％、40．00％和47．62％，妊娠周期流产率分别为10．47％、11．11％、15．63％、8．33％和25．00％，抱婴回家率分别为46．36％、29．58％、32．39％、23．33％和21．43％。结论慢速冷冻胚胎保存时间在6个月以内的复苏后胚胎存活状况与远期临床结局最佳。长期保存对胚胎存活与妊娠维持的远期影响仍是值得关注的问题。

慢速冷冻对人成熟卵与未成熟卵发育潜能的影响

目的 :探讨慢速冷冻保存对人成熟卵子和未成熟卵子发育潜能的影响。方法 :在行宫腔配子移植和多囊卵巢综合征患者未成熟卵穿刺周期中收集不同成熟期的卵子 10 5个 ,其中成熟卵 (MII) 6 9个 ,未成熟卵 (MI和GV) 36个。各成熟期卵子经慢冻 速融后进行形态学和存活力观察 ,并进一步观察体外成熟、受精及胚胎培养情况。结果 :经慢速冷冻后各个成熟期卵子的形态都发生了改变。冷冻后的未成熟卵子可以体外成熟 (76 6 7% )。冻融成熟卵子受精后的分裂率 (76 92 % )高于体外成熟卵受精后的分裂率 (P <0 .0 1) ,只有冻融成熟卵子经胚胎培养获得优质胚胎 (33 33% )。结论 :用慢速冷冻法保存成熟卵子可以得到较好的胚胎发育结果 ,未成熟卵子的冷冻保存仍然存在相当的难度。

冷冻保存时长对卵裂期胚胎组蛋白表观遗传修饰的影响

【目的】研究不同的冷冻保存时长对人类卵裂期胚胎的组蛋白表观遗传修饰的影响。【方法】采用经患者知情同意捐献用于科研的慢速冷冻的卵裂期胚胎,根据冷冻时长分为6、9和12年组,以新鲜胚胎为对照组,每组6枚捐献胚胎。采用细胞免疫荧光技术观察去乙酰化酶HDAC1、组蛋白(H3K9ac、H3K4me3、H3K9me3)的表达量在各组胚胎中的差异,并以单细胞RT-qPCR技术检测去乙酰化酶HDAC1、甲基化酶(SUV39H1、SET?DB1)、去甲基化酶KDM5A对应mRNA的表达量。【结果】4组胚胎的去乙酰化酶HDAC1、组蛋白(H3K9ac、H3K4me3和H3K9me3)的蛋白表达量无统计学意义的差异(P>0.05)。同时去乙酰化酶HDAC1、甲基化酶SUV39H1对应mRNA的表达量也无统计学意义的差异(P>0.05)。随着胚胎冷冻时长的增加,甲基化酶SETDB1对应mRNA的表达量有递增趋势,然而差异无统计学意义(P>0.05)。去甲基化酶KDM5A对应的mRNA的表达量也随冷冻时长的增加而增强,差异有统计学意义(P<0.05)。【结论】慢速冷冻保存时长对卵裂期胚胎的组蛋白(H3K9ac、H3K4me3和H3K9me3)的蛋白表达量无显著影响,甲基化酶(SUV39H1、SETDB1)对应的mRNA表达量没有明显影响;但随着冷冻保存时长增加,胚胎去甲基化酶KDM5A对应的mRNA表达量增加,有可能导致胚胎转录抑制程度增强。